一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基与流程

技术领域：

本发明属于原代细胞分离培养技术领域，具体涉及一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基。

背景技术：
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人的气道主要是由基底细胞、杯状细胞、纤毛细胞等三种上皮细胞组成的假复层上皮，其中基地细胞排列在基底膜，是目前公认认的气道上皮干细胞，杯状细胞产生粘液以捕获吸入的颗粒和病原体，而纤毛细胞产生运动力将其从肺部移除。气管移植后，粘液纤毛清除受损是一个重要的挑战，因为分泌物保留在远端吻合部位。气道上皮细胞的体外培养增殖是气道上皮功能和再生医学研究的基础，但目前细胞的分离方法和培养条件都无法满足实际研究需求，而从支气管内活检获得且在无血清支气管上皮生长培养基(begm)中培养而获得足够数量的自体上皮细胞存在很大的挑战。这是扩增基地细胞进行体外研究的有用工具，但是我们发现它不适合上皮细胞生物学和组织再生工程的研究，因为培养失败，生长的细胞不能提供足够的细胞数量用于移植物覆盖。另外，在begm中，通过在一次或两次传代后，自我更新能力开始在培养物中丧失。因此，用begm培养人气道上皮细胞不能过获得足够数量的用于组织工程气管移植。

目前，有研究通过与有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞共培养，实现人体表皮干细胞的体外长期扩增，即rho相关蛋白激酶(rock)的抑制增加增殖并有条件地使细胞永生化，从而允许干细胞的无限繁殖以及组织适当的分化能力。但其操作复杂、繁琐，原代细胞培养过程中细胞状态受到丝裂霉素c处理3t3j2细胞的影响较大。因此，寻求简单且有效的人气道上皮细胞培养的方法与培养基对获得足够量的上皮细胞尤为重要。

技术实现要素：
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本发明的目的旨在提供一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供一种培养人气道上皮细胞的优化培养基。

为达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法，包括如下步骤：

1)清洗人支气管或细支气管：取离体的肺脏组织，去除支气管或细胞支气管周围多余的脂肪和结蹄组织后，用无菌的剪刀剪成块状于无菌离心管中，在4℃条件下用pbs缓冲液进行旋转漂洗10次，30min/次后，备用；

步骤1)中所述pbs缓冲液为预冷无菌的含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素b的溶液。

2)分离人气道上皮细胞：将清洗好的组织块置于冻存管中，加入预先配置好的消化液，在37℃条件下旋转消化40-60min后，待气管变软后且有细胞团块或单细胞时，将冻存管中的消化液和组织块一起转移至离心管中，加入胎牛血清(fbs)至终浓度为5％，盖上盖子，轻轻上下颠倒20次达到终止消化；

步骤2)中所述预先配置好的消化液是由dmem培养基、1％双抗、2.5μg/ml两性霉素b和15mg/ml链霉蛋白酶(pronese)配制而成的。

3)收集人气道上皮细胞：将消化好的人气道上皮细胞，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基进行悬浮；

4)去除成纤维细胞：将重悬的细胞接种到细胞培养皿中，在37℃，5％co2条件下的培养箱中培养2-4h后，去除成纤维细胞，得贴壁的细胞悬液；

5)再收集气道上皮细胞；将贴壁的细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，将沉淀的细胞用优化的培养基进行再悬浮；

6)获得原代培养的气道上皮细胞(p0)：将再收集的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％co2的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得原代培养的气道上皮细胞(p0)；

7)传代培养气道上皮细胞：待获得的原代培养的气道上皮细胞的融合率达80-90％时，吸去培养基，用预热的pbs缓冲液漂洗后，加入accutase酶于37℃条件下消化5-10min，待细胞变圆后，轻轻拍打培养皿的侧壁；当细胞全部悬浮后，加入10％dmem培养基进行终止消化，收集细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用优化的培养基进行悬浮；

8)获得传代培养p20以上的气道上皮细胞：将上述悬浮的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％co2的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得分离培养的气道上皮细胞(p1)；待p1细胞融合率达到80-90％后，按照步骤7)进行传代培养，连续传代培养80d后，获得传代培养p20以上的气道上皮细胞。

步骤6)和步骤8)中所述包被有鼠尾胶原的培养皿是在培养皿中加入适量浓度为50μg/ml的i型鼠尾胶原，室温包被24h后，用pbs缓冲液清洗3次即得。

本发明培养人气道上皮细胞的优化培养基，包括dmem培养基、f-12nutirientmix培养基、0.5mg/ml的氢化可的松(hydrocrotisone)、胎牛血清(fbs)、25ug/ml的表皮生长因子(hegf)、5mg/ml的胰岛素(insulin)、11.7um的霍乱毒素(choleratoxin)、10mm的rock1抑制剂(y-27632)、10mm的bmp4拮抗剂(dmh-1)。

上述培养人气道上皮细胞的优化培养基，按体积百分比计，由如下成分配制而成：

dmem培养基70～75％

f-12nutirientmix培养基15～30％

0.5mg/ml的氢化可的松0.001～0.005％

胎牛血清5％～8％

25ug/ml的表皮生长因子0.001～0.005％

5mg/ml的胰岛素0.05～0.2％

11.7um的霍乱毒素0.001～0.005

10mm的rock1抑制剂0.05～0.2％

10mm的bmp4拮抗剂0.005～0.05％。

本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明利用优化的培养基培养人气道上皮细胞的方法，不仅大大的简化了需要3t3j2细胞为饲养层而培养上皮细胞的步骤，只需要将链霉蛋白酶(pronase)消化的原代人气道上皮细胞培养于本发明优化的培养基中，且获得了快速分离且无限传代培养的人气道上皮细胞，将传代培养的人气道上皮细胞进行体外扩增培养，达到20代以上，即可获得足够量的种子细胞用于如体外细胞互作模型研究等诸多后续的体内外研究中。

附图说明：

图1是本发明人气道上皮细胞在优化培养基上的传代培养：p0(i)、p3(ii)、p16(iii)；

图2是三个独立样本的气道上皮细胞倍增时间。

具体实施方式：

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不仅限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用技术手段，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的衍化、替换或变更。

1.实验材料

1.1标本来源：收集在某医科大学总医院普胸外科因肺癌等病因进行手术切除的肺组织。

2.主要试剂

dmem高糖培养基(gibco)、f-12nutrientmix培养基(gibco)、胎牛血清(bi)、accutasesolution(细胞消化液)(millipore)、hegf(sigma-aldrich)、hydrocrotisone(sigma-aldrich)、y-27632(sigma-aldrich)、choleratoxin(sigma-aldrich)、dmh-1(cot：hy-12273，medchemexpress)、i型鼠尾胶原(bdbiosiences)、pronase(roche)、dmso(panreac)、青霉素-链霉素(hyclone)、两性霉素b(solarbio)、ph7.2-7.5的pbs缓冲液(hyclone)。

3.主要器材和仪器：

co2培养箱(healforce)、3d旋转消化仪(杭州米欧仪器有限公司)、倒置荧光显微镜(zeiss)、生物安全柜(nuaire)、普通离心机(赛洛捷克)、液氮罐(mvexc47/11-10)、电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、60mm细胞培养皿、15ml离心管、冻存管都购自costar、数码恒温磁力搅拌器、计时器、程序化冻存盒、10ul、100ul、1000ul等规格精密微量加样枪，一次性微量加样管，一次性手套、口罩、帽子等。

4.试验方法

4.1优化培养基的配置：按照表1的配方，进行配置，将配置好的培养基盖上盖子并用封口膜封口，锡箔纸包裹避光，4℃保存备用。

表1人气道上皮细胞优化培养基配方

4.250μg/ml的i型鼠尾胶原配置：吸取273μl3.66mg/ml的i型鼠尾胶原放入还有20ml无菌水的血清瓶中，用无菌的磁力转子搅拌2h后，4℃保存备用。

4.315mg/ml链霉蛋白酶(pronase)消化液的配置：60mg链霉蛋白酶粉剂加入4mldmem培养基中，并加入40μl100x的抗生素，以及4μl1000x的两性霉素b，混合后，零下20℃保存备用。

4.4培养皿i鼠尾胶原的包被:取60mm的培养皿，加入浓度为50μg/ml的i型鼠尾胶原，加样量为100μl/cm²，室温包被24h后，用pbs缓冲液清洗3次，4℃放置备用。

4.5人气道上皮细胞分离、培养

4.5.1标本的获取：收集在某医科大学总医院普胸外科因肺癌等病因需行进行手术切除的肺组织；

4.5.2人支气管或细支气管的清洗：将临床收集的肺组织，放入盛有预冷的含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素b的pbs的培养皿中，用无菌的剪刀、镊子以及手术刀去除支气管或细胞支气管周围多余的脂肪和结蹄组织等后，用无菌的剪刀剪成大小为1cm²×1cm²左右，并转移至50ml离心管中，用预冷的无菌的含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素b的pbs4℃旋转漂洗去血并除菌，30min/次，共10次；

4.5.3人气道上皮细胞分离：将上述洗好的组织，选取2片1cm²×1cm²左右的组织块放入到1.8ml的冻存管中，加入1.5ml预先配置好的消化液(dmem+1％双抗+2.5μg/ml两性霉素b+15mg/mlpronese)放入37℃，旋转消化40-60min后，待气管变软后且有组织片或细胞团块时，将冻存管的消化液连通组织一起转移至15ml的离心管中，加入fbs至终浓度为5％，盖上盖子，轻轻上下颠倒20次达到终止消化的目的；

4.5.4收集细胞：将上述的消化的细胞，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用10％fbs的dmem培养基悬浮；

4.5.5差速贴壁法去除成纤维细胞：将上述重悬的细胞，接种到10cm的细胞培养皿中，在37℃，5％co2的培养箱中培养2-4h后去除成纤维细胞；

4.5.6收集气道上皮细胞；收集步骤4.5.5贴壁2-4h后的细胞悬液于15ml的离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用2ml优化的培养基悬浮。细胞计数，调整细胞密度，将3-5×10⁵细胞接种于鼠尾胶原包被的60mm的细胞培养皿上，每皿加入3ml优化的培养基，放置于37℃，5％co2的培养箱中培养，2-3d换液，此时分离培养的细胞为p0。

4.6.7气道上皮细胞传代培养：3-5d后待上述获得的p0人气道上皮细胞融合率达到80-90％时，吸去培养基，加入1ml的预热的pbs漂洗一遍后，加入1ml的accutase酶37℃消化5-10min，显微镜下观察，待细胞变圆后，轻轻拍打培养皿的侧壁，待细胞全部悬浮后，加入2ml10％dmem培养基进行终止消化，收集细胞悬液于15ml的离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用2ml优化的培养基悬浮，细胞计数，调整细胞浓度为将3-5×105细胞接种于鼠尾胶原包被的60mm的细胞培养皿上，每皿加入3ml优化的培养基，放置于37℃，5％co2的培养箱中培养，2-3d换液。此时培养的细胞为p1。

4.6.8待p1细胞融合率达到80-90％后，按照4.6.7步骤进行传代培养，连续传代培养培养80d后，本发明优化的培养基可使人原代气道上皮细胞传代培养p20以上。

4.6人气道上皮细胞的冻存与复苏

4.6.1冻存

人气道上皮细胞冻存培养基：优化的培养基，含有50％fbs、10％dmso，用前新鲜配置，放入4℃预冷备用。

4.6.2步骤

待细胞融合率为80％-90％时，吸出培养液，pbs漂洗2次，吸去培养基，加入1ml的预热的pbs漂洗一遍，加入1ml的accutase酶37℃消化5-10min，显微镜下观察，待细胞变圆后，轻轻拍打培养皿的侧壁，待细胞全部悬浮后，加入2ml10％dmem培养基进行终止消化，轻轻吹吸，分散细胞，收集细胞悬液于15ml的离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用预冷的冻存液悬浮，每只冻存管加入1ml细胞。程序化冷冻，然后转移到液氮罐中长期保存。

4.6.3复苏

500ml高压灭菌烧杯1个，高压灭菌蒸馏水500ml。将灭菌蒸馏水水浴锅加热至37～40℃，倒入烧杯中；从液氮罐中取出细胞冻存管，立即侵入盛有温水的烧杯中，并快速搅动直至冰晶全部融化。融化的细胞悬液转移至装有5ml10％fbsdmem培养基中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀2ml优化的培养基重悬，细胞计数，调整细胞浓度为将3-5×10⁵细胞接种于鼠尾胶原包被的60mm的细胞培养皿上，加入3ml培养基。细胞在6-8小时后即可贴壁。第二天更换培养基，去除死细胞，2-3d即可传代。

4.7人气道上皮细胞的生长形态

显微镜下观察人气道上皮细胞形态

4.8重复性试验

为了验证本发明优化的培养基可重复性，从某医科大学总医院普胸外科收集3个患者的肺组织，按照4.5.1-4.7的步骤，继续分离人气道上皮细胞细胞，并将3个患者的分离得到的人气道上皮细胞标记为b1、b2、b3。3个患者的临床信息如表2：

4.9细胞倍增时间的统计分析

从分离的p0细胞开始，在每一代的传代过程中，细胞计数并将其量与原始细胞数进行比较。利用公式：细胞倍增时间＝log(n.t./n.0.)/log2，其中：n.t.为细胞长满t时间的细胞数目；n.0.为t.0时间原始细胞数目。对于每次细胞进行传代时，重复改过程，可以计算细胞群体倍增的速率。

5实验结果：

5.1用胎盼蓝染色法鉴定人气道细胞活力：吸取人气道上皮细胞悬液与0.4％的胎盼蓝溶液1:1混匀，吸取50μl立即放入到细胞计数板上计数。显微镜下观察显示活的人气道上皮细胞呈圆形、透亮，且立体感较强，死的人气道上皮细胞被染成蓝色，且细胞膜边界不清晰或者模糊。经细胞计数后，人气道上皮细胞存活率在80％-95％，细胞得率在3.3～5.5x10⁶之间。

5.2倒置显微镜下观察细胞形态：如图1所示，刚分离及传代的人气道上皮细胞呈单个，或者细胞团块，透亮，呈圆形或者有纤毛样的上皮细胞在旋转运动，立体感较强。6-8h后，人气道上皮细胞贴壁生长。第二天观察人气道上皮细胞呈分散的细胞团块或单个小克隆，细胞呈多角形或者蝌蚪，轮廓清晰。培养2-3d后，培养的人气道上皮细胞在显微镜下观察，细胞间相互接触成片，可见细胞呈单核或者双核(如p0(i)所示)；待细胞传代至p3时(如p3(ii)所示)，细胞生长状态良好，细胞呈细胞呈多角形或者蝌蚪，轮廓清晰，且培养3d左右细胞融合率达到80-90％。随后对细胞进行连续的传代培养80d后，即p16，分离的培养的人气道上皮细胞仍能继续增值生长，细胞呈多角形或者蝌蚪，轮廓清晰(如p16(iii)所示)。

5.3细胞倍增时间的计算：如图2所示，将分离培养的人气道上皮细胞每次进行传代时，细胞计数比较三个样本的人气道上皮细胞倍增时间，b2样本先于b1、b3样本达到细胞增殖的平台期。但当b1、b2、b3样本都到达细胞增殖的平台期后，不同样本的分离的人气管上皮细胞在本发明优化的培养基中呈现出相同的增长速率。

结论：本发明通过对原代及传代人气道上皮细胞存活率的检测，细胞形态变化的规律，以及对3个不同标本分离培养的人气道上皮细胞的倍增时间计分析。结果显示：本试验分离培养的人气道上皮细胞存活率达到80％-95％，而且本发明优化的培养基可以使分离的人气道上皮细胞传代培养20代以上，这将为以人原代气道上皮细胞为细胞模型进行体外细胞生物学和组织再生工程的研究提供充足的种子细胞。