本发明涉及一种重组脯氨酸氨肽酶发酵高产及制备脱苦大米肽的方法，属于发酵技术、酶制剂、食品添加剂领域。
背景技术：
微生物的发酵培养优化策略往往从培养基的优化和发酵过程控制两方面入手，目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某种微生物的培养基配方和发酵过程控制策略，且不同的微生物所适合的培养基和发酵过程控制策略都不尽相同，没有一种培养方法能够适合多种微生物的发酵培养，所以对某一特定微生物需要采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和试验方法将培养基组成和发酵过程控制等发酵策略组合优化才能选择出最适合的培养方法。
现阶段脯氨酸氨肽酶的发酵产量还比较低，不能满足工业制备的需求，这也是脯氨酸氨肽酶至今没有商业化产品的关键因素。因此，如何提高通过发酵策略提高脯氨酸氨肽酶发酵产量成为迫切需要解决的问题。
酶制剂是指从生物中提取的具有酶类性质的物质，现已应用在医药、化工、食品、酿造等各领域，应用范围非常的广泛。食品加工业与人们的生活关系紧密，酶在食品加工业中的应用越来越多，作用也越来越重要，在肉类加工、蛋白质的深度水解和作为食品添加剂中有很大体现。
酶制剂伴随着社会的发展其应用也越来越广泛，氨肽酶也在不断的开拓其应用领域。非特异的氨肽酶能广谱的水解蛋白或多肽n-端的氨基酸残基，可以水解多肽或蛋白n-端不同种类的氨基酸残基，游离出不同种类的氨基酸。特异性强的氨肽酶能水解内切蛋白酶及非特异的外切酶不能水解的氨基酸残基，能够有效的加深蛋白水解深度及提高蛋白水解物的营养价值。水稻是全球产量最丰富的粮食作物之一，大米蛋白作为水稻加工成的产品，资源丰富，营养均衡且不易产生过敏。因此，大米蛋白在食品工业中有着非常广阔的应用前景。然而，大米蛋白在深加工过程中，其水解物往往呈现出较强的苦味，影响了其应用的领域。如何通过酶的协同降解提高大米蛋白水解度、去除或减轻水解液苦味、增加水解液的营养价值成为一个亟待解决的问题。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明基于发酵动力学指导重组枯草脯氨酸氨肽酶的发酵高产及利用脯氨酸氨肽酶协同碱性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶水解大米蛋白制备脱苦大米肽，结果脯氨酸氨肽酶产量显著提高，多酶协同水解提高了大米蛋白的水解度，减轻水解液的苦味及提高了水解物的营养价值，同时水解液表现出一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用。本发明生产的脯氨酸氨肽酶是具有严格底物特异性的氨肽酶，本发明提高了脯氨酸氨肽酶的产量，减轻了下游分离制备脯氨酸氨肽酶的成本及利用脯氨酸氨肽酶特异性地切除n末端的脯氨酸残基，可以去除一些特异性不高的氨肽酶进一步水解pro的障碍，能起较好的协同水解和脱苦作用。
本发明提供了一种利用重组枯草芽孢杆菌高产脯氨酸氨肽酶的方法，以提高脯氨酸氨肽酶产量，降低下游分离制备的成本。
所述方法包括以下步骤：
(1)将活化后的重组枯草芽孢杆菌接入种子培养基，使用回旋式恒温摇床进行培养，控制转速为220r/min，培养温度为37℃，培养20h，制得种子液；
(2)以5％的接种量将种子液接种到5l发酵罐中，发酵罐装液为3l发酵培养基，通入无菌空气，通气量为1.5vvm；转速的调控为0-6h200rpm，6-12h为400rpm，12-28h为500rpm，28h至发酵结束为400rpm；ph的调控为0-12h不控制ph，12-16h为ph7.0，16-28hph不控制，28h后ph7.0；温度的调控为40℃发酵前8h，8-12h为35℃，12h至发酵结束为33℃。
所述步骤(1)中种子培养基组分为氯化钠10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l，灭菌后加入过滤除菌的卡那霉素至终浓度为50μg/ml。
所述步骤(2)中发酵培养基组分为葡萄糖20g/l，酵母提取物60g/l，鱼粉18.75g/l，氯化铵3.25g/l，k2hpo412.54g/l，kh2po42.31g/l，0.1％(v/v)的植酸，ph7.0。灭菌后加入过滤除菌的卡那霉素至终浓度为50μg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述方法，具体是将-40℃甘油管保藏的重组枯草芽孢杆菌平板活化两次，制备活化的重组芽孢杆菌：
(1)接入到种子培养基中，培养基体积为150ml，所用摇瓶为500ml体积，使用回旋式恒温摇床进行培养，控制转速为220r/min，培养温度为37℃，培养20h，制得种子液；
(2)以5％的接种量将种子液接种到装有3l发酵培养基的5l发酵罐中，通入无菌空气，通气量为1.5vvm，25％氨水调ph，有机硅作消泡剂；
(3)转速的调控为0-6h200rpm，6-12h为400rpm，12-28h为500rpm，28h至发酵结束为400rpm；ph的调控为0-12h不控制ph，12-16h为ph7.0，16-28hph不控制，28h后ph7.0；温度的调控为40℃发酵前8h，8-12h为35℃，12h至发酵结束为33℃。
所述步骤(3)发酵过程中，每隔4h定时取样，测定菌体干重、胞内脯氨酸氨肽酶酶活力及胞外脯氨酸氨肽酶酶活力。
本发明同时提供了一种大米蛋白的水解方法，是依次用碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶进行水解。
所述方法，是配制质量浓度为5-8％的大米蛋白溶液，
(1)加入适量碱性蛋白酶，于40-50℃下反应1-4h，沸水浴10-20min；
(2)冷却后继续加入适量的亮氨酸氨肽酶，45-50℃反应1-4h，沸水浴10-20min；
(3)冷却后再加入适量的脯氨酸氨肽酶，45-50℃反应2-3.5h，沸水浴10-20min。
所述步骤(1)中碱性蛋白酶添加量为5000-20000u/g大米蛋白。
所述步骤(2)中亮氨酸氨肽酶添加量为1000-4000u/g大米蛋白。
所述步骤(3)中脯氨酸氨肽酶添加量为50-200u/g大米蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述酪蛋白溶液是采用纯水配制，并用碱调ph至9.0、90℃水浴30min制得。
在本发明的一种实施方式中，所述方法，具体是：用纯水配制5％的大米蛋白溶液，并用碱调ph至9.0、90℃水浴30min，所用碱为2mnaoh溶液；然后，
(1)加入适量的碱性蛋白酶，50℃反应4h，沸水浴15min；
(2)冷却后继续加入适量的亮氨酸氨肽酶，50℃反应4h，沸水浴15min；
(3)冷却后再加入适量的脯氨酸氨肽酶，50℃反应2h，沸水浴15min。
所述步骤(1)反应中，每隔1h取样，甲醛滴定法测定大米蛋白水解度。
所述步骤(2)反应中，每隔1h取样，甲醛滴定法测定大米蛋白水解度。
所述步骤(3)反应后，冷却后将所得水解液在10000rpm的条件下离心15min，取上清液；将上清液用10％三氯乙酸等体积稀释，放置1h，然后用针头式滤器过滤，滤液于10000rpm离心10min，再次取上清液。然后分别进行多肽分子量分布、游离氨基酸分析。同时，对水解液进行α-葡萄糖苷酶抑制效果的测定。
本发明以发酵动力学参数为指导得到高产脯氨酸氨肽酶的发酵工艺条件；以大米蛋白为底物，该酶与碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶协同水解，以水解度为依据，优化碱性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶在大米蛋白水解中的添加量；以游离的pro为依据，确定脯氨酸氨肽酶的用量。
本发明还提供所述方法在食品和饮料及在食品蛋白资源加工利用领域的应用。
本发明还提供一种纯化所述α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，是将水解液10000rpm离心15min，取上清，冻干。用20mmph7.5pb缓冲液溶解，进行hitripdeaeff阴离子交换层析，流速为1ml/min，用150mm、350mm、550mm浓度nacl进行阶段洗脱，每个阶段洗脱10个柱体积，收集洗脱液，充分透析，冻干浓缩。将冻干粉复水，测定各峰的α-葡萄糖苷酶的抑制率。将抑制率高的组分，进行sephadexg-15凝胶层析，按峰收集，冻干浓缩、复水测定α-葡萄糖苷酶的抑制率。
本发明的有益效果：
本发明以发酵动力学参数为指导确定了高产重组枯草芽孢杆菌脯氨酸氨肽酶的发酵工艺条件，即：转速的调控为0-6h200rpm，6-12h为400rpm，12-28h为500rpm，28h至发酵结束为400rpm；ph的调控为0-12h不控制ph，12-16h为ph7.0,16-28hph不控制，28h后ph7.0；温度的调控为40℃发酵前8h，8-12h为35℃，12h至发酵结束为33℃。优化后的脯氨酸氨肽酶产量达174.8u/ml是优化前最高水平的1.66倍。
该酶协同碱性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶水解大米蛋白，确定了碱性蛋白酶的添加量为15000u/g大米蛋白、水解4h及亮氨酸氨肽酶的添加量为3000u/g大米蛋白、水解2h，三酶协同水解后游离氨基酸含量为3.484mg/ml，为未水解前的游离氨基酸含量的27.4倍，水解液主要以小肽和游离氨基酸形式存在，180da以下的小肽含量达到了44.70％，充分水解了暴露出的n端脯氨酸残基，游离的脯氨酸含量为0.149mg/ml，是未水解游离脯氨酸含量的1064.3倍，水解液中疏水性氨基酸含量显著增加，减轻了水解的苦味，加深了大米蛋白水解深度，提升了水解液的营养价值，分离纯化水解液中α-葡萄糖苷酶抑制活性肽得到了抑制活性较强的组分，在功能及保健食品和饮料中具有很好的应用前景。
附图说明
图1：转速对重组菌发酵的影响
图2：不同条件下发酵动力学分析(a：1:200rpm，2:300rpm，3:400rpm，4:500rpm，b：1:200rpm，2:300rpm，3:400rpm，4:500rpm；c：1：不控制ph，2：ph7.0，3：ph7.5，d：1：不控制ph，2：ph7.0，3：ph7.5；e：1:30℃，2:33℃，3:35℃，4:37℃，5:40℃，f：1:30℃，2:33℃，3:35℃，4:37℃，5:40℃)
图3：确定发酵工艺下的发酵过程曲线
图4：水解液疏水氨基酸
具体实施方式
生物材料样品：所用重组枯草芽孢杆菌(带有组氨酸标签的脯氨酸氨肽酶的重组菌株bacillussubtiliswb600，所用质粒为pma5)及脯氨酸氨肽酶的纯化制备详见中国专利cn105925650a。
脯氨酸氨肽酶酶活力测定方法：以l-脯氨酸-对硝基苯胺为底物(底物储藏液用tris-hcl7.5配制，浓度为4.25mm)，反应混合物包括1ml稀释后的酶液，2mltris-hcl7.5缓冲液和1ml底物储藏液，50℃水浴反应10min，加入1ml50％(v/v)的冰醋酸溶液终止反应，在405nm处测定吸光值。
酶活单位(u)定义为50℃每分钟分解l-脯氨酸-对硝基苯胺产生1μm对硝基苯胺所需的酶量。
碱性蛋白酶酶活单位定义：40℃每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。
亮氨酸氨肽酶酶活单位定义：50℃每分钟分解l-亮氨酸-对硝基苯胺产生1μm对硝基苯胺所需的酶量。
所用发酵罐：t&jtypea5l发酵罐(上海迪必尔生物工程有限公司)
多肽分子量分布检测：waters600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和empower工作站)。
水解液中游离氨基酸的测定：使用氨基酸液相色谱仪(ag1100)进行测定。
α-葡萄糖苷酶抑制率的测定：用ph6.8的磷酸钾缓冲液配制1.5u/ml的α-葡萄糖苷酶溶液，70μl的酶液混合70μl的样品在37℃水浴温育10min，再加入70μl含有10mmpnpg的ph6.8的磷酸钾缓冲液，37℃水浴反应1h。然后加入70μl1mna2co3溶液终止反应。在405nm下测定吸光度a。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下：
其中a0为对照，ai为样品吸光度，aj为样品对照。
实施例1：不同转速条件下重组枯草芽孢杆菌发酵培养
将-40℃甘油管保藏的重组枯草芽孢杆菌接入到种子培养基中，使用回旋式恒温摇床进行培养，摇床转速为220r/min，培养温度37℃，培养20h。在将种子液以5％的接种量接入装有3l发酵培养基的5l发酵罐中，发酵过程中通入无菌空气，通气量1.5vvm，发酵温度为37℃，ph7.0，搅拌转速分别设置200rpm、300rpm、400rpm、500rpm，发酵时间为36h。发酵过程中，每隔2h取样，测定菌体干重、胞外脯氨酸氨肽酶及胞内脯氨酸氨肽酶活力等。
结果表明，将搅拌转速从200rpm提高到500rpm，脯氨酸氨肽酶活力也从38.0u/ml提高到了97.5u/ml。
实施例2：发酵动力学指导下的发酵培养
将种子液以5％的接种量接入装有3l发酵培养基的5l发酵罐中，发酵过程中通入无菌空气，通气量1.5vvm，发酵条件：转速的调控为0-6h200rpm，6-12h为400rpm，12-28h为500rpm，28h至发酵结束为400rpm；ph的调控为0-12h不控制ph，12-16h为ph7.0,16-28hph不控制，28h后ph7.0；温度的调控为40℃发酵前8h，8-12h为35℃,12h至发酵结束为33℃。发酵过程中，每隔4h取样，测定菌体干重、胞外脯氨酸氨肽酶及胞内脯氨酸氨肽酶活力等。
结果表明，动力学分析下的发酵策略能显著提高脯氨酸氨肽酶的产量，脯氨酸氨肽酶活力达到174.8u/ml。
实施例3：重组枯草脯氨酸氨肽酶在大米蛋白水解中的作用
用纯水缓冲液配制5％的大米蛋白溶液，用2mnaoh溶液调ph至9.0,90℃水浴保温30min，冷却后，加入15000u/g大米蛋白的碱性蛋白酶，50℃反应4h，沸水浴15min，冷却后继续加入3000u/g大米蛋白的亮氨酸氨肽酶粉末，50℃反应2h，沸水浴15min，冷却后再加入200u/g大米蛋白的重组脯氨酸氨肽酶酶液，50℃反应2h，沸水浴15min，冷却，水解液主要以小肽和游离氨基酸形式存在，180da以下的小肽含量达到了44.70％，充分水解了暴露出的n端脯氨酸残基，游离的脯氨酸含量为0.149mg/ml，是未水解游离脯氨酸含量的1064.3倍。
此外，发明人还比较了不同酶解方法对大米蛋白水解效果的影响，结果如表1所示。结果显示，碱性蛋白酶单独水解时180da以下的小肽含量为13.68％，碱性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶双酶水解时180da以下的小肽含量为42.21％。
表1不同酶解方法对大米蛋白水解效果的影响
注：1：大米蛋白溶液，2：碱性蛋白酶单酶水解液，3：碱性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶双酶水解液，4：脯氨酸氨肽酶、碱性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶协同水解液。
另外，本发明方法得到的游离氨基酸含量为3.484mg/ml，为未水解的游离氨基酸含量的27.4倍，其中脯氨酸含量为未水解的1064.3倍，疏水性氨基酸含量显著提升。而碱性蛋白酶单独水解时游离氨基酸含量为1.121mg/ml，碱性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶双酶水解时游离氨基酸含量为3.567mg/ml与三酶协同水解时游离氨基酸含量基本平衡，但游离脯氨酸含量明显低于三酶协同水解物为0.083mg/ml。
本发明通过脯氨酸氨肽酶与碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶协同水解大米蛋白，得到的水解物中游离氨基酸的含量和小肽含量都大幅增加，疏水性氨基酸含量也显著提高，大米蛋白的水解度不仅大大提高，水解液的苦味液也得到了去除或减轻。
实施例4：大米蛋白水解方法
本发明的大米蛋白水解方法，是配制质量浓度为8％的大米蛋白溶液，
(1)加入适量碱性蛋白酶，于40℃下反应3.5h，沸水浴10min；
(2)冷却后继续加入适量的亮氨酸氨肽酶，45℃反应3h，沸水浴10min；
(3)冷却后再加入适量的脯氨酸氨肽酶，45℃反应3h，沸水浴10min；
其中碱性蛋白酶添加量为20000u/g大米蛋白；亮氨酸氨肽酶添加量为4000u/g大米蛋白；脯氨酸氨肽酶添加量为100u/g大米蛋白。
得到的大米蛋白水解液中2000da以上的多肽基本上已经不存在了，而180da以下的小肽含量达到了48.26％，游离氨基酸含量为5.852mg/ml，游离的脯氨酸含量为未水解的1136.4倍。
实施例5：α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的分离纯化方法
50ml碱性蛋白酶、亮氨酸氨肽酶及脯氨酸氨肽酶协同水解大米蛋白的水解液10000rpm离心15min，取上清，冻干。用20mmph7.5pb缓冲液溶解冻干粉，用hitripdeaeff阴离子交换层析进行初步分离，上样量10ml，流速为1ml/min，用150mm、350mm、550mm浓度nacl溶液进行阶段洗脱，每个阶段洗脱10个柱体积，收集洗脱液，充分透析，冻干浓缩。将冻干粉复水，测定各洗脱峰的α-葡萄糖苷酶的抑制率及多肽浓度。发现洗脱峰f4组分抑制率最高，将该组分进行sephadexg-15凝胶层析，上样量1ml，流速为0.5ml/min，按峰收集，将各洗脱峰冻干，用1ml纯水溶解冻干粉，测定α-葡萄糖苷酶的抑制率及多肽浓度。得到最强α-葡萄糖苷酶的抑制效果的组分f4b其ic50为132.6μg/ml。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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