本发明涉及褐藻肽复配物领域，尤其是涉及褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法。
技术背景
褐藻门(Phaeophyta)成员，一群较高级的藻类，约1500种，分布大陆沿岸的冷水水体，淡水中罕见。其颜色取决於褐色素（墨角藻黄素）与绿色素（叶绿素）的比例，从暗褐到橄榄绿。充气的气囊使叶状体的光合部分浮於或接近水表。
褐藻没有单细胞，全为多细胞植物，最简单的是由单列细胞组成的分枝丝状体，如外子藻目（Ectocarpales）；进化的种类，有类似根、茎、叶的分化，有的甚至具有气囊构造，如海带目（Laminariales）可协助藻体漂浮在海面上，内部组织则有表皮、皮层及髓部之分化，体型普遍较为粗大，可长至60多公尺长，大量繁殖时形成海洋森林或藻海，吸引无数海洋生物汇集，带来丰富的海洋资源。褐藻中除海带、鹿角菜外，昆布(Ecklonia hornem)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、羊栖菜(Sargassum fusiforme)等均可食用和药用；马尾藻属(Sargassum)植物可作饲料或肥料。此外，还可从马尾藻等褐藻中提取褐藻胶、甘露醇、碘、氯化钾、褐藻淀粉等食品或医药工业原料。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，本制备方法简单易行，褐藻蛋白质酶解效率、褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高，易于被机体吸收。
本发明针对
背景技术：
中提到的问题，采取的技术方案为：褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，包括：提取、酶解、复配，具体包括以下步骤：
提取：取经喷雾干燥获得的褐藻粉20-30份均匀悬浮在160-200份蒸馏水中，悬浮液经液氮速冻、25-30℃水浴法冻融5-6次，再用暂停1-2秒、超声2-4秒的超声波破碎3-5分钟，超声频率为30-35kHz、超声密度为0.40-0.50W/cm2，在2-4℃下以6000-8000r/min的速率离心30-45分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白质上清液，低温干燥得褐藻蛋白质粉；反复冻融多次后，细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎，后经超声波破碎，褐藻细胞中的蛋白质会游离出来；
酶解：在120-150份底物浓度为2-3%的褐藻蛋白液中加入终浓度为2.0-2.2mmol/L的乙二胺四乙酸、5.0-6.0mmol/L的 L-半胱氨酸、0.3-0.5mol/L的氯化钠、0.3-0.5mmol/L的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛、4000-5000U/g的木瓜蛋白酶，在温度为55-60℃、pH为6.8-7.0的条件下水解2-3小时；将水解液在2-4℃、6000-7000r/min的条件下经截留分子质量为10000Da的超滤膜过滤去除酶，得到具有生物活性的滤液，将滤液低温旋蒸得褐藻蛋白酶解肽；（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于木瓜蛋白酶的金属原子活性中心，能够降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大蛋白酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，褐藻蛋白质的酶解率可达75%以上，褐藻蛋白酶解肽在胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等胃肠蛋白酶的消化下能够保持良好的抑制活性，同时具有较高的降血压、降血脂活性，在功能保健和医药制剂方面具有潜在的发展前景；
复配：将褐藻蛋白酶解肽复溶成22-25%的肽液，调节pH值至7.5-7.8，取80-100份肽液，加入100-120份1.2-1.5mol/L的FeCl2溶液，再加入5-8mg的抗坏血酸，在25-28℃温度下震荡合成30-45分钟，将合成液于2-4℃温度下以8000-8500r/min转速离心浓缩20-45分钟，取上清液于旋转蒸发器38-40℃真空浓缩，冷冻干燥后即得褐藻蛋白酶解肽复配物；褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高较高，易于被机体吸收，避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点，同时褐藻蛋白酶解肽可以补充机体所需氨基酸，降低血压、血脂，具有较好的保健功效，是一种高效的褐藻蛋白酶解肽铁复配物。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于木瓜蛋白酶的金属原子活性中心，能够降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大蛋白酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，褐藻蛋白质的酶解率可达75%以上；2）褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高较高，易于被机体吸收，避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点，同时褐藻蛋白酶解肽可以补充机体所需氨基酸，降低血压、血脂，具有较好的保健功效，是一种高效的褐藻蛋白酶解肽铁复配物。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，包括以下步骤：
1）取经喷雾干燥获得的褐藻粉20份均匀悬浮在160份蒸馏水中，悬浮液经液氮速冻、25℃水浴法冻融5次，再用暂停1秒、超声2秒的超声波破碎3分钟，超声频率为30kHz、超声密度为0.40W/cm2，在2℃下以6000r/min的速率离心30分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白质上清液，低温干燥得褐藻蛋白质粉；2）在120份底物浓度为2%的褐藻蛋白液中加入终浓度为2.0mmol/L的乙二胺四乙酸、5.0mmol/L的 L-半胱氨酸、0.3mol/L的氯化钠、0.3mmol/L的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛、4000U/g的木瓜蛋白酶，在温度为55℃、pH为6.8的条件下水解2小时；将水解液在2℃、6000r/min的条件下经截留分子质量为10000Da的超滤膜过滤去除酶，得到具有生物活性的滤液，将滤液低温旋蒸得褐藻蛋白酶解肽；3）将褐藻蛋白酶解肽复溶成22%的肽液，调节pH值至7.5，取80份肽液，加入100份1.2mol/L的FeCl2溶液，再加入5mg的抗坏血酸，在25℃温度下震荡合成30分钟，于2℃温度下以8000r/min转速离心浓缩20分钟，取上清液于旋转蒸发器38℃真空浓缩，冷冻干燥后即得褐藻蛋白酶解肽复配物。
实施例2：
褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，包括以下步骤：
1）提取：取经喷雾干燥获得的褐藻粉30份均匀悬浮在200份蒸馏水中，悬浮液经液氮速冻、30℃水浴法冻融6次，再用暂停2秒、超声4秒的超声波破碎5分钟，超声频率为35kHz、超声密度为0.50W/cm2，在4℃下以8000r/min的速率离心45分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白质上清液，低温干燥得褐藻蛋白质粉；反复冻融多次后，细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎，后经超声波破碎，褐藻细胞中的蛋白质会游离出来；
2）酶解：在150份底物浓度为3%的褐藻蛋白液中加入终浓度为2.2mmol/L的乙二胺四乙酸、6.0mmol/L的 L-半胱氨酸、0.5mol/L的氯化钠、0.5mmol/L的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛、5000U/g的木瓜蛋白酶，在温度为60℃、pH为7.0的条件下水解3小时；将水解液在4℃、7000r/min的条件下经截留分子质量为10000Da的超滤膜过滤去除酶，得到具有生物活性的滤液，将滤液低温旋蒸得褐藻蛋白酶解肽；（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于木瓜蛋白酶的金属原子活性中心，能够降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大蛋白酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，褐藻蛋白质的酶解率可达75%以上，褐藻蛋白酶解肽在胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等胃肠蛋白酶的消化下能够保持良好的抑制活性，同时具有较高的降血压、降血脂活性，在功能保健和医药制剂方面具有潜在的发展前景；
3）复配：将褐藻蛋白酶解肽复溶成25%的肽液，调节pH值至7.8，取100份肽液，加入120份1.5mol/L的FeCl2溶液，再加入8mg的抗坏血酸，在28℃温度下震荡合成45分钟，于4℃温度下以8500r/min转速离心浓缩45分钟，取上清液于旋转蒸发器40℃真空浓缩，冷冻干燥后即得褐藻蛋白酶解肽复配物；褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高较高，易于被机体吸收，避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点，同时褐藻蛋白酶解肽可以补充机体所需氨基酸，降低血压、血脂，具有较好的保健功效，是一种高效的褐藻蛋白酶解肽铁复配物。
实施例3：
褐藻蛋白酶解肽铁复配物的制备方法，包括：提取、酶解、复配，具体包括以下步骤：
提取：取经喷雾干燥获得的褐藻粉30份均匀悬浮在200份蒸馏水中，悬浮液经液氮速冻、26℃水浴法冻融6次，再用暂停2秒、超声3秒的超声波破碎4分钟，超声频率为32kHz、超声密度为0.45W/cm2，在3℃下以6500r/min的速率离心35分钟，离心后去除沉淀，得到蛋白质上清液，低温干燥得褐藻蛋白质粉；反复冻融多次后，细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎，后经超声波破碎，褐藻细胞中的蛋白质会游离出来；
酶解：在130份底物浓度为2.2%的褐藻蛋白液中加入终浓度为2.1mmol/L的乙二胺四乙酸、5.5mmol/L的 L-半胱氨酸、0.4mol/L的氯化钠、0.4mmol/L的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛、4500U/g的木瓜蛋白酶，在温度为58℃、pH为6.8的条件下水解2.5小时；将水解液在3℃、6800r/min的条件下经截留分子质量为10000Da的超滤膜过滤去除酶，得到具有生物活性的滤液，将滤液低温旋蒸得褐藻蛋白酶解肽；（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于木瓜蛋白酶的金属原子活性中心，能够降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大蛋白酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，褐藻蛋白质的酶解率可达75%以上，褐藻蛋白酶解肽在胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等胃肠蛋白酶的消化下能够保持良好的抑制活性，同时具有较高的降血压、降血脂活性，在功能保健和医药制剂方面具有潜在的发展前景；
复配：将褐藻蛋白酶解肽复溶成24%的肽液，调节pH值至7.6，取90份肽液，加入100份1.4mol/L的FeCl2溶液，再加入7mg的抗坏血酸，在26℃温度下震荡合成45分钟，于2℃温度下以8000r/min转速离心浓缩30分钟，取上清液于旋转蒸发器38℃真空浓缩，冷冻干燥后即得褐藻蛋白酶解肽复配物；褐藻蛋白酶解肽铁复配物螯合率较高较高，易于被机体吸收，避免了无机铁盐稳定性差、胃肠刺激大、易受到肠内容物干扰、生物利用率低、存在一定毒副作用等缺点，同时褐藻蛋白酶解肽可以补充机体所需氨基酸，降低血压、血脂，具有较好的保健功效，是一种高效的褐藻蛋白酶解肽铁复配物。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。