本发明涉及中医药技术领域，具体而言，涉及一种地黄有效成分提取分离方法及提取的梓醇和多糖。
背景技术：
地黄rehmanniaglutinosalibosch为玄参科地黄属植物，又名地髓、芭等，块根入药，人工栽培，大面积种植区域分布在山西运城，临汾，河南焦作，陕西渭南。北京、河北、山东、甘肃也有种植。由于加工炮制方式的不同，药材分为鲜地黄、生地黄及熟地黄，是中药经加工炮制而药性发生变化的典型，鲜地黄主治伤中，逐血痹，填骨髓，长肌肉。地黄的化学成分以苷类为主，其中又以梓醇等环烯醚萜苷类为主。梓醇有抗癌、神经保护、抗炎、利尿、降血糖、保肝及抗衰老等多种药理活性，研究表明，在暂时缺血的情况下，梓醇具有显著的神经保护功能，并发现梓醇能激活脑神经元，可以治疗因外伤、代谢障碍、脑缺血和帕金森氏病引起的脑神经病。动物体外实验表明梓醇还具有抗炎、抵抗细胞内ca2+、促进pc12细胞分化和抑制细胞凋亡等作用。梓醇含量是地黄加工炮制工艺的重要检测指标。地黄中还含有多种多糖，地黄中多糖能够消除人体内的自由基，具有抗肝瘤、抗病毒、抗衰老等功效，可以治疗心血管疾病、消渴症，对人体免疫系统具有双向调节作用，可以预防免疫力低下，提高免疫功能。
我国含梓醇的植物资源相当丰富，特别是高含量植物，如地黄为我国大宗常用药材，这为梓醇新药开发提供了资源保证。为此，应将梓醇及其衍生物的化学转化和药效学结合起来研究，为阐明地黄经过加工炮制而药性发生改变的内在机制，开辟一条可行的道路，应加强研究梓醇及其降解后可能生成的活性产物，为开发新的治疗药物奠定基础。
现有技术中，对梓醇的提取一般有以下几种：(1)有机溶剂提取法(用5倍甲醇回流提取2次，每次2h)；(2)超声波提取法(68％乙醇，料液比5:1，超声36min)；(3)微波提取法；(4)酶法提取；(5)甲醇提取(在甲醇浓度70％，提取温度55℃，料液比在1：18)。以上几种方法得率较低，且地黄中其他的有效药物成分浪费严重，提取成本较高。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种地黄有效成分提取分离方法，以解决上述问题，所述的地黄有效成分提取分离方法，对地黄中的多种成分分别提取，摆脱单一目标提取分离的限制，大大提高了地黄的利用率，最终达到梓醇及多糖的多目标联产，操作简便，设备要求低，利用酶解得率提高3-5倍，节约重要原料，易于产业化大量生产。
本发明的第二目的在于提供一种所述的地黄有效成分提取分离方法提取的梓醇单体和多糖单体，其中，所述梓醇单体的纯度大于98％。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种地黄有效成分提取分离方法，包括以下步骤：
(1)将地黄中加入酶和水进行酶解，依次采用纯乙醇、体积浓度为65％-75％的乙醇、体积浓度为85％-95％的乙醇和纯水进行提取，合并所有提取液；
(2)将步骤(1)得到的合并后的提取液经过浓缩和大孔树脂后，再依次采用纯水、体积浓度为5％-15％的乙醇、体积浓度15％-25％的乙醇、体积浓度35％-45％的乙醇、体积浓度55％-65％的乙醇和体积浓度85％-95％的乙醇淋洗层析柱；体积浓度为15％-25％的乙醇淋洗后得到梓醇提取液，体积浓度为85％-95％的乙醇淋洗后得到多糖混合物提取液；
(3)将步骤(2)得到的梓醇提取液和多糖混合物提取液分别进行浓缩和烘干，得到梓醇单体粉末和多糖单体，将所述梓醇单体粉末进一步纯化得到梓醇单体；
优选的，所述纯化采用硅胶树脂进行操作。
优选的，在步骤(1)中，所述酶为所述地黄质量的0.01％-0.1％；更优选的，加入酶的同时加入适量水，更进一步优选的，所述水的质量为所述地黄质量的5-10倍。
优选的，所述酶选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶中的一种或几种的组合；更优选的，所述酶解的温度为30-70℃；更进一步优选的温度为40-50℃；更进一步优选的，所述酶解的时间为24-48h。
优选的，所述酶由质量比为1:(0.6-0.8)：(0.4-0.6)：(0.3-0.7)的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶组成；更优选的质量比为1:0.7：0.5:0.5；更进一步优选的，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
优选的，在步骤(1)中，所述纯乙醇的质量为所述地黄的2.5-5倍；所述体积浓度为65％-75％的乙醇的质量为所述地黄的5-10倍；所述85％-95％的乙醇的质量为所述地黄的5-10倍；所述体积浓度为85％-95％的乙醇的质量为所述地黄5-10倍；所述纯水的质量为所述地黄的5-10倍；
更优选的，所述淋洗的温度为30-50℃，更进一步优选为40-50℃；
更优选的，每次所述淋洗的时间为30-60min，更进一步优选为45-60min；
更优选的，所述纯水的温度为90-100℃。
优选的，在步骤(2)中，所述纯水体积为所述层析柱体积的1-2倍；所述体积浓度为5％-15％的乙醇为所述层析柱体积2-5倍；所述体积浓度为35％-45％的乙醇为所述层析柱体积2-5倍；所述体积浓度为55％-65％的乙醇为所述层析柱体积2-5倍；所述体积浓度为85％-95％的乙醇为所述层析柱体积2-5倍。
优选的，在步骤(1)中，所述体积浓度为65％-75％的乙醇的提取的时间为30-60min，更优选为45-60min。
优选的，在步骤(1)中，所述体积浓度为85％-95％的乙醇的提取的时间为30-60min，更优选为45-60min。
优选的，在步骤(2)中，所述浓缩为浓缩掉70％-75％的溶剂。
优选的，在步骤(2)中，所述大孔径吸附树脂选自d101、ab-8、x-5、lx-60或dm-130中的一种。
所述的地黄有效成分提取分离方法所提取的梓醇和多糖，优选的，所述梓醇的纯度大于98％。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本申请所提供的地黄有效成分提取分离方法，对地黄中的多种成分分别提取，摆脱单一目标提取分离的限制，大大提高了地黄的利用率，最终达到梓醇及多糖的多目标联产。
(2)本申请所提供的地黄有效成分提取分离方法，操作简便，设备要求低，利用酶解得率提高3-5倍，节约重要原料，易于产业化大量生产。
(3)本申请所提供的地黄有效成分提取分离方法提取的梓醇单体的纯度大于等于98％。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一种地黄有效成分提取分离方法，包括以下步骤：
(1)将地黄中加入酶和水进行酶解，依次采用纯乙醇、体积浓度为65％-75％的乙醇、体积浓度为85％-95％的乙醇和纯水进行提取，合并所有提取液；
(2)将步骤(1)得到的合并后的提取液经过浓缩和大孔树脂后，再依次采用纯水、体积浓度为5％-15％的乙醇、体积浓度15％-25％的乙醇、体积浓度35％-45％的乙醇、体积浓度55％-65％的乙醇和体积浓度85％-95％的乙醇淋洗层析柱；体积浓度为15％-25％的乙醇淋洗后得到梓醇提取液，体积浓度为85％-95％的乙醇淋洗后得到多糖混合物提取液；
(3)将步骤(2)得到的梓醇提取液和多糖混合物提取液分别进行浓缩和烘干，得到梓醇单体粉末和多糖单体，将所述梓醇单体粉末进一步纯化得到梓醇单体；
优选的，所述纯化采用硅胶树脂进行操作。
本发明所提供的地黄有效成分提取分离方法首先对原料清洗表面干燥后粉碎，然后加入酶进行酶解，酶解后在30-50℃利用不同浓度的乙醇进行醇提三次，最后加入水提取一次。提取后进行逐步淋洗，分段接收。将三次提取物混合并浓缩掉70％-75％的溶剂后，过d101或ab-8大孔树脂，分别用水(1-2倍分离柱体积的)——5-15％乙醇(2-5v)——15-25％乙醇(2-5v)——35-45％乙醇(2-5v)——55-65％乙醇(2-5v)——85-95％乙醇(2-5v)，其中20％乙醇淋洗后得到梓醇，35-45％乙醇-85-95％乙醇淋洗后得到多糖混合物。最后将得到的梓醇溶液和多糖混合物溶液浓缩烘干得到相应单体粉末。
优选的，在步骤(1)中，所述酶为所述地黄质量的0.01％-0.1％；更优选的，加入酶的同时加入适量水，更进一步优选的，所述水的质量为所述地黄质量的5-10倍。
优选的，所述酶选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶中的一种或几种的组合；更优选的，所述酶解的温度为30-70℃；更进一步优选的温度为40-50℃；更进一步优选的，所述酶解的时间为24-48h。
优选的，所述酶由质量比为1:(0.6-0.8)：(0.4-0.6)：(0.3-0.7)的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶组成；更优选的质量比为1:0.7：0.5:0.5；更进一步优选的，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
优选的，在步骤(1)中，所述纯乙醇的质量为所述地黄的2.5-5倍；所述体积浓度为65％-75％的乙醇的质量为所述地黄的5-10倍；所述85％-95％的乙醇的质量为所述地黄的5-10倍；所述体积浓度为85％-95％的乙醇的质量为所述地黄5-10倍；所述纯水的质量为所述地黄的5-10倍；
更优选的，所述淋洗的温度为30-50℃，更进一步优选为40-50℃；
更优选的，每次所述淋洗的时间为30-60min，更进一步优选为45-60min；
更优选的，所述纯水的温度为90-100℃。
优选的，在步骤(2)中，所述纯水体积为所述层析柱体积的1-2倍；所述体积浓度为5％-15％的乙醇为所述层析柱体积2-5倍；所述体积浓度为35％-45％的乙醇为所述层析柱体积2-5倍；所述体积浓度为55％-65％的乙醇为所述层析柱体积2-5倍；所述体积浓度为85％-95％的乙醇为所述层析柱体积2-5倍。
优选的，在步骤(1)中，所述体积浓度为65％-75％的乙醇的提取的时间为30-60min，更优选为45-60min。
优选的，在步骤(1)中，所述体积浓度为85％-95％的乙醇的提取的时间为30-60min，更优选为45-60min。
优选的，在步骤(2)中，所述浓缩为浓缩掉70％-75％的溶剂。
优选的，在步骤(2)中，所述大孔径吸附树脂选自d101、ab-8、x-5、lx-60或dm-130中的一种。
所述的地黄有效成分提取分离方法所提取的梓醇和多糖，优选的，所述梓醇的纯度大于98％。
梓醇的结构式如下：
实施例1
本实施例所提供的地黄有效成分提取分离方法，具体包括以下步骤：
1)取新鲜的地黄及茎叶切碎,加入地黄质量0.01％的果胶酶和纤维素酶的混合物，加入地黄质量5倍的水，控温在30℃，酶解48h。
2)加入地黄质量2.5倍纯乙醇，在30℃下提取30min，过滤，滤饼继续加5倍70％乙醇提取30min，过滤，滤饼继续加5倍90％乙醇提取30min，过滤，滤饼加5倍90℃纯水提取30min。过滤，得滤渣和滤液，滤渣烘干后可作为植物菌肥，将所有步骤的提取液混合得最终提取液。
3)将最终提取液浓缩掉70％溶剂，溶剂回收为70％左右的乙醇，然后过大孔吸附树脂d101，先后用1倍层析柱体积的纯水、2倍层析柱体积10％乙醇、2倍层析柱体积20％乙醇、2倍层析柱体积40％乙醇、2倍层析柱体积60％乙醇、2倍层析柱体积90％乙醇淋洗层析柱；
其中，20％乙醇淋洗后得到梓醇提取液，90％乙醇淋洗后得到多糖混合物提取液。
4)将梓醇提取液和多糖混合物提取液分别浓缩烘干，得到梓醇单体粉末和多糖单体，将梓醇单体粉末经硅胶树脂进一步纯化得到高纯度的梓醇单体。
实施例2
本实施例所提供的地黄有效成分提取分离方法，具体包括以下步骤：
1)取新鲜的地黄及茎叶切碎,加入地黄质量0.1％的果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，加入地黄质量10倍的水，控温在50℃，酶解24h。
2)加入地黄质量5倍纯乙醇，在50℃下提取60min，过滤，滤饼继续加10倍70％乙醇提取60min，过滤，滤饼继续加10倍90％乙醇提取60min，过滤，滤饼加10倍100℃纯水提取60min。过滤，得滤渣和滤液，滤渣烘干后可作为植物菌肥，将所有步骤的提取液混合得最终提取液。
3)将最终提取液浓缩掉75％溶剂，溶剂回收为70％左右的乙醇，然后过大孔吸附树脂ab-8，先后用2倍层析柱体积的纯水、5倍层析柱体积10％乙醇、5倍层析柱体积20％乙醇、5倍层析柱体积40％乙醇、5倍层析柱体积60％乙醇、5倍体积90％乙醇淋洗层析柱；
其中，20％乙醇淋洗后得到梓醇提取液，90％乙醇淋洗后得到多糖混合物提取液。
4)将梓醇提取液和多糖混合物提取液分别浓缩烘干，得到梓醇单体粉末和多糖单体，将梓醇单体粉末经硅胶树脂进一步纯化得到高纯度的梓醇单体。
实施例3
本实施例所提供的地黄有效成分提取分离方法，具体包括以下步骤：
1)取新鲜的地黄及茎叶切碎,加入地黄质量0.05％的果胶酶，加入地黄质量7倍的水，控温在40℃，酶解36h。
2)加入地黄质量3倍纯乙醇，在40℃下提取40min，过滤，滤饼继续加7倍70％乙醇提取40min，过滤，滤饼继续加7倍90％乙醇提取40min，过滤，滤饼加7倍95℃的纯水，提取4min。过滤，得滤渣和滤液，滤渣烘干后可作为植物菌肥，将所有步骤的提取液混合得最终提取液。
3)将最终提取液浓缩掉70％溶剂，溶剂回收为70％左右的乙醇，然后过大孔吸附树脂(d101、ab-8、x-5、lx-60或dm-130)，先后用2倍层析柱体积的纯水、3倍层析柱体积10％乙醇、3倍层析柱体积20％乙醇、3倍层析柱体积40％乙醇、3倍层析柱体积60％乙醇、3倍层析柱体积90％乙醇淋洗层析柱。
其中，20％乙醇淋洗后得到梓醇提取液，90％乙醇淋洗后得到多糖混合物提取液。
4)将梓醇提取液和多糖混合物提取液分别浓缩烘干，得到梓醇单体粉末和多糖单体，将梓醇单体粉末经硅胶树脂进一步纯化得到高纯度的梓醇单体。
实施例4
本实施例所提供的地黄有效成分提取分离方法，具体包括以下步骤：
1)取新鲜的地黄及茎叶切碎,加入地黄质量0.08％的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶，加入地黄质量8倍的水，控温在45℃，酶解24-48h。
2)加入地黄质量2.5-5倍纯乙醇，在40℃下提取45min，过滤，滤饼继续加8倍70％乙醇提取45min，过滤，滤饼继续加8倍90％乙醇提取45min，过滤，滤饼加8倍90℃的纯水，提取45min。过滤，得滤渣和滤液，滤渣烘干后可作为植物菌肥，将所有步骤的提取液混合得最终提取液。
3)将最终提取液浓缩掉70％溶剂，溶剂回收为70％左右的乙醇，然后过大孔吸附树脂dm-130，先后用1倍层析柱体积的纯水、4倍体积10％乙醇、4倍体积20％乙醇、4倍体积40％乙醇、4倍体积60％乙醇、4倍体积90％乙醇淋洗层析柱。
其中，20％乙醇淋洗后得到梓醇提取液，90％乙醇淋洗后得到多糖混合物提取液。
4)将梓醇提取液和多糖混合物提取液分别浓缩烘干，得到梓醇单体粉末和多糖单体，将梓醇单体粉末经硅胶树脂进一步纯化得到高纯度的梓醇单体。
实施例5与实施例4基本相同，不同的是，酶的组成中，采用质量比为1:0.7：0.5:0.5的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和碱性蛋白酶组成。
实施例6与实施例4基本相同，不同的是，酶的组成中，采用质量比为1:0.6：0.4:0.3的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和碱性蛋白酶组成。
实施例7与实施例4基本相同，不同的是，酶的组成中，采用质量比为1:0.8：0.6:0.7的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和碱性蛋白酶组成。
对比例1与实施例4基本相同，不同的是，不进行酶解，直接进行进行提取步骤。
对比例2与实施例4基本相同，不同的是，在步骤(3)中，提取的乙醇的体积浓度依次为：4％、10％、30％、50％和80％。
对比例3与实施例4基本相同，不同的是，酶的组成中，采用质量比为1:0.5：0.3:0.3的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和碱性蛋白酶组成。
实验例梓醇和多糖含量测试
(一)实验材料：鲜地黄(产自河南焦作)；乙腈(色谱纯)；纯水。
(二)实验仪器，如表1所示。
表1实验仪器
(三)分别采用本申请实施例1-7和对比例1-3所提供的方法进行提取实验。实验结果如表2所示。
表2行提取实验测试结果
实验结果表明，本申请所提供的地黄有效成分提取分离方法，梓醇和多糖得率高，大大提高了地黄的利用率，最终达到梓醇及多糖的多目标联产，操作简便，设备要求低，利用酶解得率提高3-5倍，节约重要原料，易于产业化大量生产。并且，所得到的梓醇纯度高，大于98％。
其中，实施例5、6和7采用特定的酶的组合进行酶解，可以有效提高梓醇的纯度，其中实施例5的配比下效果最佳，梓醇的纯度达到最大值。与对比例3相比，酶的配比不在优选范围的情况下，其得到的梓醇的纯度比优选范围下的得到的梓醇的纯度低。
而对比例1中，未采用任何酶进行酶解操作，会大大降低提取得到的梓醇的纯度。而通过对比例2的比较，未采用本申请所提供的乙醇体积浓度范围的乙醇进行淋洗，也会造成提取的梓醇的纯度降低。由此说明，本申请所提供的提取方法，有效提高了梓醇的纯度，不仅如此，还可以进一步得到多糖提取物，实现梓醇及多糖的多目标联产，大大提高了地黄的利用率，且方法操作简便，设备要求低，节约重要原料，易于产业化大量生产。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。