一种核酸提取与亚硫酸氢盐转化及核酸纯化的试剂盒的制作方法

本发明属于生物医学领域，尤其是表观遗传学中甲基化研究，特定基因的启动子区域cpg岛的甲基化状态与肿瘤筛查与诊断相关。

背景技术：

真核生物基因组尤其是脊椎动物的cpg序列发生甲基化的频率非常高，但是部分基因(45％左右)的启动子附近存在一段约1000bp的富含无甲基化的cpg区域，被称为cpg岛。cpg岛异常甲基化通常存在于没有表达的组织特异性基因的启动子、印迹失活的常染色体等位基因的启动子和女性失活的x染色体上各基因的启动子中。这种基因启动子甲基化的方式往往使抑癌基因转录失活，可以促进多种癌相关基因的表达，激活肿瘤细胞的增殖。由于dna甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，近年来以甲基化分析为代表的表观遗传学和表观基因组学较为活跃。

dna甲基化分析的通常做法是：提取纯化好的基因组dna，经超微量紫外分光光度计定量后，调整待转化的dna在合适的范围：1ng-2μg。在碱性环境下加入亚硫酸氢钠和dna保护液，经过95℃充分变性、60℃反应10-30分钟，再重复一次以确保转化充分。产物再进行核酸过柱纯化。亚硫酸氢盐处理使得未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而5’-甲基胞嘧啶则不变，可以通过测序鉴定，也可通过甲基化特异引物进行鉴定：设计两对引物，分别与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化dna链，另一对结合处理后的非甲基化dna链。分析扩增产物，如果用针对处理后甲基化dna链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；反之亦然。另外，还可采用针对甲基化位点pcrtaqman探针法、pcr荧光染料为基础的高分辨率溶解曲线(hrm)法来鉴定。

当前的甲基化分析中的核酸提取及转化的处理方法存在步骤多、过程繁琐、dna损耗大、时间长(包括标本提取与测定、dna转化、纯化等过程，至少3小时)、无法自动化等缺点。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种人类或高等动物的基因组核酸提取、甲基化分析中的重亚硫酸盐转化反应、转化后核酸的纯化为一体的快速自动化方法，总时间在一小时以内。其显著优点在于自动化，不易发生人工操作多次开盖带来潜在的交叉污染，比传统甲基化分析前的标本提取及转化需要6小时以上缩短是时间80％以上。另外，传统方法由于分三个阶段完成、步骤多损耗大，本发明一次完成，dna损失少。实现该目的采用的技术要领如下：

1.人类体液标本(血清、血浆、全血、尿液、唾液、脑脊液、灌洗液、分泌物等)、口腔拭子或肛门拭子的浸泡液等，理论上含有人类基因组dna不高于10μg(高于此含量则降低取样量，并以水补足到一定体积)，取样200μl。

2.依次加入350μl裂解液、20μl蛋白酶液、80μl3m亚硫酸氢钠(ph5.0)、20μldna保护剂，混匀后，加入适量石蜡油(sigma)覆盖液面。

3.70-95℃2-10min、60℃10-30min,70-95℃2-10min、60℃10-30min。

4.加入300μl悬在异丙醇中的磁珠，混匀5-10min。

5.富集磁珠，转移到1ml洗涤液a中洗一次，1ml洗涤液b中洗两次，最后于0.1ml洗脱液中,室温至80℃5-10min洗脱。

其中裂解液包含：5mgitc、50mm柠檬酸钠、5％thesit、5％brij-58、1％dtt、0.2murea、0.1％sds、10mmedta.na2(ph6.5)

洗涤液a包含：2mgitc、0.1％sds、20mmtris、5mmedta.na2、50％乙醇(ph7.5)

洗涤液b包含：2mmtris、2mmnacl、0.5mmedta.na2、80％乙醇(ph7.5)

洗脱液包含：50mmtris

蛋白酶溶液为蛋白酶k，溶于50％甘油、10mmtris、1mmedta.na2、5mmcacl2、5mmca(oac)2、0.2％sds，浓度为20mg/ml(ph8.0)

3m亚硫酸氢钠(ph5.0)：含有0.1％edta.na2作为稳定剂

dna保护剂：包含trolox，即6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸,为自由基清除剂

磁珠：硅基磁珠用异丙醇稀释成6.6mg/ml，可以选择罗氏、默克、英潍捷基、凯杰、惠尔、金麦格、奥润、为度等公司的产品。

为了解转化反应是否彻底完成，可与qiagen的epitectbisulfitekit(货号59104)或epitectfastbisulfitekit(货号59824)对同一份标本比较。可以任意选取几个富含cpg的基因经pcr扩增后观察测序结果。

与现有技术比较，本发明人类基因组甲基化分析前的重亚硫酸盐转化及核酸纯化方法具有显著的优越性：快速、自动化、易于标准化、有效避免多步骤带来的核酸损耗和交叉污染。

附图说明：

图1是本发明采集老年男性尿液对2号染色体上的efemp1基因进行dna甲基化特异荧光pcr扩增结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。

图2是本发明采集老年男性尿液对7号染色体上的sostdc1基因进行dna甲基化特异荧光pcr扩增结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。

图3是本发明采集老年男性尿液对3号染色体上的rassf1a基因进行dna甲基化特异荧光pcr扩增结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。

图4是本发明采集老年男性尿液对11号染色体的gst1f基因进行dna甲基化特异荧光pcr扩增结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。

图5是本发明采集老年男性尿液对16号染色体上的cyba基因进行dna甲基化特异荧光pcr扩增结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。

图6是本发明采集老年男性尿液对y染色体上的kdm5d基因进行dna甲基化特异荧光pcr扩增结果图，横坐标代表扩增循环数，纵坐标代表荧光值强度。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整地描述，显而易见，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，均属于本发明保护的范围。

一种尿液dna甲基化分析方法，包括以下步骤：

1.尿液标本(含脱落细胞)5-30ml，3000rpm10min,弃去上清留底部液体1-5ml,

2.振荡混匀后取200μl，加入96孔深孔板中的预先填有350μl裂解液的裂解孔位，吸打1次以混匀，加入20μl蛋白酶液吸打1次，再加入80μl亚硫酸氢钠、20μldna保护剂，吸打混匀。

注：预充填试剂的96孔深孔板的第1列加有350μl裂解液、第2列加有300μl磁珠、第3列加有950μl洗涤液a、第4列加有950μl洗涤液b、第5列加有950μl洗涤液b、第6列有100μl洗脱液。深孔板的1-6列，7-12列各独立组成一个提取单元，每个单元可以做a-h共8个标本。

3.按照以下程序运行，在天隆生物科技的np968自动核酸提取仪上进行标本裂解、dna重亚硫酸盐转化、洗涤与纯化等步骤，运行结束后可获得完成转化后的纯化dna。

4.同一份标本还可实施一分为二的比较研究，即进行重亚硫酸盐转化与不转化的比较。步骤2中不加亚硫酸氢钠不加dna保护剂即为未实施转化的核酸提取纯化。

5.采用多对引物探针组合分别对2号染色体上的efemp1基因(illumina甲基化芯片的位点编号cg05385513)、3号染色体上的rassf1a基因、7号染色体上的sostdc1基因(cg06363129、cg11417025、cg07220448)、11号染色体的gst1f基因、16号染色体上的cyba基因(cg08843517)、y染色体上的kdm5d基因(本次研究均采集老年男性尿液)进行dna甲基化特异荧光pcr扩增。

结果显示，先用qiagen的qiaampdnabloodminikit提取再用epitectbisulfitekit转化与dna纯化，以上述多对引物扩增后测序，结果和本发明100％相符。