一种具有提高抗氧化活性的浒苔多糖羧甲基化修饰产物及其制备方法与流程

本发明涉及一种海藻多糖，具体涉及一种具有提高抗氧化活性的浒苔多糖羧甲基化修饰产物及其制备方法。

背景技术：

浒苔是一种大型经济绿藻，俗称苔条、海苔，为绿藻门，石莼目石莼科植物。经研究发现，浒苔富含碳水化合物、蛋白质、粗纤维、氨基酸、脂肪酸、多糖、维生素和多种矿物元素，其中浒苔多糖的含量最高，主要由鼠李糖、木糖、葡萄糖及少量甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖组成，并含有糖醛酸和硫酸基，多糖主链含有多种连接键型。现代药理学研究证明浒苔多糖具有多种生理功能，例如降血糖血脂、抗氧化、抗菌、消炎、抗肿瘤、免疫等。目前，浒苔多糖的功能与活性在制药、功能性食品、天然食品添加剂、化妆品等行业均有应用。

多糖为天然产物，来源广泛，具有毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点，因而备受研究者的重视。现代研究发现，多糖的生物活性与多糖的空间结构密切，通过物理、化学等手段对其分子结构进行修饰，从而赋予多糖更多生物活性。用适当方法向多糖支链进行羧甲基修饰，羧甲基化多糖溶解性和电负性增强，并对其抗氧化、抗肿瘤活性有很大的提高，且能增强甚至产生新的生物活性。本发明对浒苔多糖进行羧甲基化修饰，确定其结构特征，比较研究了不同取代度羧甲基化多糖的抗氧化活性。有关浒苔多糖羧甲基化衍生物制备及抗氧化活性研究至今未见国内外文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供羧甲基化浒苔多糖的合成方法，并获得不同羧甲基化取代度浒苔多糖抗氧化作用结果。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：

一种羧甲基化浒苔多糖，由以下方法合成：将浒苔多糖溶于不同浓度氢氧化钠溶液中，并加入异丙醇同时搅拌，冰浴，搅拌1、2～5h后制成均匀悬浊液，并逐渐滴加异丙醇—氯乙酸混合液，逐渐升温至40、50～80℃，搅拌3h，停止反应，冷却至室温。用1mol/l的盐酸调ph值至中性，将反应液置于截留分子量为3500的透析袋中透析48h。旋转蒸发溶液，冷冻干燥，得到羧甲基化浒苔多糖。

本发明还要求保护所述的不同取代度的羧甲基化多糖在制药中的应用。进一步地，不同取代度羧甲基化浒苔多糖在制备药物中的应用包括以下4个方面。

(1)羧甲基化浒苔多糖在制备清除dpph自由基药物中的应有，羧甲基化浒苔多糖有效浓度为2mg/ml，羧甲基化取代度为0.1～0.7。

(2)羧甲基化浒苔多糖在制备清除羟基自由基药物中的应有，羧甲基化浒苔多糖有效浓度为2mg/ml，羧甲基化取代度为0.1～0.7。

(3)羧甲基化浒苔多糖在制备清除超氧阴离子自由基药物中的应有，羧甲基化浒苔多糖有效浓度为2mg/ml，羧甲基化取代度为0.1～0.7。

(4)羧甲基化浒苔多糖在制备清在清除还原能力药物中的应有，羧甲基化浒苔多糖有效浓度为2mg/ml，羧甲基化取代度为0.1～0.7。

本发明的有益效果在于：将人工合成的羧甲基化浒苔多糖用于体外抗氧化活性实验，获得不同取代度的羧甲基化浒苔多糖抗氧化的实验结果，为羧甲基化浒苔多糖在医药领域的应用提供参考依据。

附图说明

图1为实施所述浒苔多糖羧甲基化修饰前后红外光谱分析图，其中eip线代表浒苔多糖，eipc线代表羧甲基化浒苔多糖。

图2为实施所述不同naoh浓度对肠浒苔多糖羧甲基化取代度的影响

图3为实施所述不同反应温度肠浒苔多糖羧甲基化取代度的影响

图4为实施所述不同反应温度肠浒苔多糖羧甲基化取代度的影响

图5为实施不同取代度羧甲基化浒苔多糖对dpph自由基清除作用

图6为实施不同取代度羧甲基化浒苔多糖对羟基自由基清除作用

图7为实施不同取代度羧甲基化浒苔多糖对超氧阴离子自由基清除作用

图8为实施不同取代度羧甲基化浒苔多糖对fe³⁺还原能力作用

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

1、浒苔多糖的制备

浒苔洗净，于50℃下烘干，粉碎过20目筛，80％的乙醇85℃冷凝回流提取3次，每次2h，分离残渣并干燥。称取上述残渣5g，按照一定料液比加入蒸馏水，水浴提取，抽滤，滤液离心得上清液浓缩，加入4倍体积无水乙醇沉淀，4℃静置48h，4000r/min，离心15min，取沉淀干燥，得到浒苔粗多糖(eip)。

2、浒苔多糖羧甲基化修饰

称量120mg浒苔多糖，加入10ml20％naoh和25ml的异丙醇溶液，冰浴，搅拌3h后制成均匀悬浊液。将混合液(25ml异丙醇溶有3g氯乙酸和10ml20％naoh制备的混合液)缓慢滴入反应体系中，逐渐升温至60℃，搅拌3h，停止反应，冷却至室温。用1mol/l的盐酸调至ph为中性。用流水和蒸馏水分别透析48h。旋转蒸发溶液，冷冻干燥，得到羧甲基化浒苔多糖(eipc)。

3、红外光谱分析

分别称取2mg的浒苔多糖和羧甲基化浒苔多糖加入100mg干燥kbr于玛瑙研钵中，研磨均匀，压片。进行红外光谱扫描，扫描范围为4000～400cm^-1。

由图1可知，浒苔多糖的羧甲基化修饰产物，不但具有多糖的特征红外吸收峰：3441cm^-1(o-h)、1260cm^-1、1204cm^-1、1077cm-1(c-o-h)，而且，在1611cm^-1羧基(-cooh)的c＝o非对称振动吸收峰、1422cm^-1处与羧基相连的甲基(-ch3)的c-h变角振动吸收、1328cm^-1处c＝o的对称伸缩吸收增强明显，表明了羧甲基化浒苔多糖中羧甲基(-ch2-cooh)的存在。由此说明：本试验所用的羧甲基化修饰方法修饰的浒苔多糖结构可行。

4、羧甲基化浒苔多糖取代度的测定

试管中分别加入0.25ml0.5mg/ml的eipc溶液和0.25ml浓硫酸，混匀，125℃加热3h后取出，再加入2ml2,7-二羟基萘溶液，混匀后于沸水浴中加热20min，冷却至室温，最后加入2ml的蒸馏水，测定其520nm吸收值。同时，用羟基乙酸替代多糖样品计算每克多糖样品中羟基乙酸的克数，记为a，按以下公式，计算羧甲基化浒苔多糖取代度的值：

ds＝162a/(76-80a)

其中，ds为取代度，a为每克样品中羟基乙酸的克数

经测定，羧甲基化浒苔多糖取代度为0.781.

5、不同naoh浓度对浒苔多糖羧甲基化取代度的影响

设置naoh浓度10％、15％～30％，研究不同浓度的碱液对浒苔多糖羧甲基化取代度的影响，结果见图2.

羧甲基化浒苔多糖取代度随naoh质量分数的增大呈现先增大后减小的趋势，naoh质量分数为20％时，达到最大。由于随着naoh质量分数的增加，naoh的总量增加，分子渗透到多糖分子的机率增加，使得肠浒苔多糖溶胀更充分，活性中心也随之增加，其与氯乙酸接触反应的机会增多，相应醚化反应效率更高，从而使反应的取代度增加。但是，如果溶液中存在过量的naoh，会导致氯乙酸发生副反应，使得氯乙酸利用率降低，反而会降低取代度。因此，选择氢氧化钠-氯乙酸化学法修饰肠浒苔多糖的naoh质量分数为20％。

6、不同反应温度对浒苔多糖羧甲基化取代度的影响

设置反应温度40℃、50℃～80℃，研究不同反应温度对浒苔多糖羧甲基化取代度的影响，结果见图3。

羧甲基化浒苔多糖的取代度随反应温度升高呈现先增大后减小的趋势。温度逐渐升高，分子运动速度加快，分子间相互碰撞机会增加，使多糖的取代度不断增加。当反应温度到60℃时，羧甲基化浒苔多糖的取代度最大。当温度继续升高，造成氯乙酸水解副产物增多和多糖在碱性介质中发生降解而使羧甲基化浒苔多糖取代度降低。因此，选择氢氧化钠-氯乙酸化学法修饰浒苔多糖的反应温度为60℃。

7、不同反应时间对浒苔多糖羧甲基化取代度的影响

设置反应时间1h、2h～5h，研究不同反应时间对浒苔多糖羧甲基化取代度的影响，结果见图4.

随着加热反应时间的增加，羧甲基化浒苔多糖的取代度不断增加。加热时间1～3h，随着加热时间增加，反应活性中心增多，醚化反应速率加快，因此羧甲基化浒苔多糖的取代度显著增加。当加热时间超过3h后，既会造成反应速率加快，但又使其副产物增多或不稳定中间产物分解，造成其取代度几乎不再增加。过长的加热时间不仅费时，也会造成能源浪费。因此，综合考虑选择氢氧化钠-氯乙酸化学法修饰浒苔多糖的反应时间为3h。

8、不同取代度羧甲基化浒苔多糖对dpph自由基清除作用

量取配制的待测样品液2.0ml，加入2.0ml0.04mg/mldpph溶液(无水乙醇作为溶剂)，充分混匀后室温下避光反应30min，在波长517nm处测定其吸光度ai，同时测定无水乙醇(2.0ml)与dpph(2.0ml)混合液的吸光度ac，无水乙醇(2.0ml)和样品液(2.0ml)混合液的吸光度aj则dpph自由基清除率计算公式：k(％)＝[1-(ai-aj)/ac]×100。

由图5可知，当羧甲基化修饰取代度为0.1，dpph自由基的清除率最大，为47.6％，随着取代度的不断增大，羧甲基化浒苔多糖对dpph自由基的清除作用呈下降趋势。总体上取代度和清除率之间并呈较明显线性规律。说明适当的羧甲基化修饰，有助于提高dpph自由基清除率。

9、不同取代度羧甲基化浒苔多糖对羟基自由基清除作用

取0.2ml的feso4-edta混合液(10mmol/l)于带塞试管中，加入0.2ml的α-脱氧核糖溶液(20mmol/l)，然后再加入0.2ml样品，并用磷酸缓冲液(0.2mol/l，ph＝7.4)定容至1.8ml，然后加入0.2ml的h2o2(10mmol/l)，40℃恒温水浴1h，加入1ml2.8％的三氯乙酸终止反应，再加入1ml1％硫代巴比妥酸，混匀之后于沸水浴中加热10min，冷却后于532nm处测光吸收值as。以去离子水为阴性对照，测定吸光值a0，抗坏血酸为阳性对照，测定吸光值ac。则样品的自由基清除能力计算公式：

k(％)＝[1-(as–a0)/(ac–a0)]×100％

由图6可知，随着取代度的不断增大，羧甲基化浒苔多糖对羟自由基的清除作用呈上升趋势，但是取代度和清除率之间并没有呈明显线性规律。当取代度大于0.4时，羧甲基化浒苔多糖对羟自由基的清除率较高，且呈持续上升的趋势。羧甲基化修饰的取代度越大，浒苔多糖的清除羟自由基的能力越强，表明羧甲基化修饰有利于浒苔多糖清除羟自由基。

10、不同取代度羧甲基化浒苔多糖对超氧阴离子自由基清除作用

精确量取4.5mltris-hcl溶液(50mmol/l，ph＝8.2)于试管，在25℃温水中预热20min，之后依次加入同样预热条件下预热的邻苯三酚溶液(25mmo1/l)0.3ml和样品0.2ml，并迅速混匀倒入比色皿，波长319nm处测定吸光度at，每30s测一次，测定8次。以去离子水作为空白对照，同样操作条件下测定并计算邻苯三酚自氧化速率v0。以at为纵坐标，时间为横坐标作图，计算斜率vt。超氧阴离子自由基清除率计算公式：k(％)＝(1-vt/v0)×100。

由图7可知，羧甲基化浒苔多糖对超氧阴离子自由基的清除能力，总体上是随着取代度的变大而增加，但是并不呈现清晰的线性规律，与其羟自由基的清除率有些类似，但是与之相比，羧甲基化浒苔多糖对超氧阴离子自由基的清除能力呈现更复杂的趋势。随着羧甲基化浒苔多糖取代度值的增大，对超氧阴离子自由基的清除作用增强。

11、不同取代度羧甲基化浒苔多糖对fe³⁺还原能力作用

移取0.5ml羧甲基化多糖溶液与试管中，并加入0.5ml0.2mol/lpbs缓冲液(ph＝6.7)和0.5ml1％铁氰化钾溶液，50℃水浴锅恒温20min后冷却，加入0.5ml10％三氯乙酸溶液，依次加入2ml蒸馏水，0.5ml0.1％的fecl3溶液充分混匀，静置10min后，在紫外-可见分光光度计700nm波长处测定溶液吸光值。

由图8可知，随着取代度的不断增大，羧甲基化浒苔多糖的还原性作用呈下降的趋势，但是取代度和清除率之间呈一定程度的负相关系，羧甲基化修饰的取代度越大，浒苔多糖的还原性能力越弱，表明羧甲基化修饰不利于浒苔多糖还原性的发挥。