本发明涉及海洋生物及医药技术领域，具体地说，是一种从北极土壤弯孢聚壳属真菌d-1(eutypellasp.d-1)中经提取、分离纯化得到的一类含四元环的海松烷二萜类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
由于两极地区低温、反复冻融和强辐射的特殊环境，使极地微生物为了适应极端的生存环境，可能具有与温带，热带微生物不同的分子生物学机制和生理生化特征，并产生许多结构新颖、活性独特的次级代谢产物。因而，对极地微生物次级代谢产物的研究越来越受到国内外研究的关注。eutypellasp.d-1分离自北极高纬度(78°55’n)仙女木根基土壤，隶属于子囊菌门ascomycetes、炭角菌目xylariales、胶孢壳科diatrypaceae、弯孢聚壳属eutypella。目前，对于该种属的次级代谢产物研究的比较少，仅有部分报道，该种属的次级代谢产物主要包括桉烷型倍半萜，海松烷二萜，三萜，苯并吡喃衍生物，聚酮类(如：γ-内酯)以及含氮的化合物(如：细胞松弛素、环肽)等。这些化合物都显示了一定的生物活性，如从该菌株中分离得到的化合物libertellenoneh对人乳腺癌细胞株mcf-7生长的抑制率最高，ic50达到了3.31μm，比阳性对照紫杉醇的抑制效果更好(参见文献：lux-l,liuj-t,liux-y,gaoy,zhangj-p,jiaob-h,zhengh.pimaranediterpenesfromthearcticfunguseutypellasp.d-1.thejournalofantibiotics2014,67:171-174.)。
这两个化合物的结构母环属于海松烷型的三环二萜类，结构式如下所示，具有多羟基取代和高不饱和度的特点，是真菌次级代谢产物中一类重要的二萜类化合物。
中国专利文献cn103274915a公开了从北极弯孢聚壳属真菌的次级代谢产物中提取的两种具有抗肿瘤活性的含三元环的二萜类化合物libertellenoneg和libertellenoneh，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。中国专利文献cn103275093a公开了从北极弯孢聚壳属真菌的次级代谢产物中提取的三种新的细胞松弛素cytochalasinz24，cytochalasinz25和cytochalasinz26，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。
但是至今未见从该属真菌中分离得到具有抗肿瘤活性的含四元环的海松烷二萜类化合物的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一类罕见含有四元环骈合海松烷母核的新的二萜类化合物，本发明的另一目的是提供该新化合物的提取方法和医药用途。
本发明的第一方面，提供一种含四元环的海松烷二萜类化合物，其化学结构如下所示：
eutypellenonea，为黄色油状物，分子式c26h34o7，分子量：458；高分辨质谱：493.2001[m+cl]-，1h和13c核磁共振谱数据见表1。
eutypellenoneb，为黄色油状物，分子式c27h36o7，分子量：472；高分辨质谱：471.2388[m-h]-，1h和13c核磁共振谱数据见表2。
所述的含四元环的海松烷二萜类化合物是一种从北极土壤弯孢聚壳属真菌：弯孢聚壳菌d-1(eutypellasp.d-1)中经提取、分离纯化得到的一类具有抗肿瘤活性的新的海松烷二萜类化合物。
本发明所用的菌种是分离自北极
本发明的第二方面，提供上述的含四元环的海松烷二萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(a)制备总提物：
a)从平板上挑取少量保藏编号为cctccno：m2013144的弯孢聚壳菌d-1(eutypellasp.d-1)的菌株的菌丝体，接种到250ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装100ml的种子培养基，28℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养3.5天获得一级种子液，按照5％(v/v)接种量接入相同种子培养基，于28℃、180r/min摇床培养3.5d，获得新鲜二级种子液，用于发酵培养；后将种子培养液接种到2000ml的锥形瓶中进行扩大培养，在装液量为400ml的锥形瓶中按照5％(v/v)的接种量接入新鲜种子液，置于20℃、180r/min摇床培养10d；当发酵培养至72h、96h、120h时，等量添加乙醇，添加终浓度为4％；
所述的种子培养基配方为：葡萄糖125g/l，硝酸钠3.3g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，酵母提取物0.7g/l，六水氯化钴3.125mg/l，硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，l-鸟氨酸盐酸盐15g/l；
所述的发酵培养基配方为：蔗糖51.4g/l，硝酸钠3.3g/l，尿素2.5g/l，酵母提取物0.7g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，七水硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，六水氯化钴3.125mg/l；
b)将步骤a)中培养得到的菌液过滤，分别获得菌体和菌液，菌液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液蒸干溶剂，将菌丝体用二氯甲烷：甲醇＝1:1超声提取3次(30min/次)，浓缩提取液至无有机溶剂，加水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，最后合并菌液、菌体所得浸膏，得总提取物；
(b)分离纯化：
a’)将乙酸乙酯粗提物经减压液相柱色谱(vlc)，以石油醚:乙酸乙酯＝60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1，0:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到12个组分fr.a–l；
b’)对组分fr.e进行反相中压液相色谱，进行梯度洗脱，条件为55％–100％甲醇/水，流速20ml/min，洗脱4h，合并同一峰型下的流分，得到13个组分fr.e1–e13；对组分fr.e9进行正相硅胶柱色谱，最后经反相高效液相，条件为65％乙腈/水，流速2ml/min，检测波长为306nm，保留时间为54.0分钟，即得eutypellenoneb；
c’)对组分fr.g进行反相中压液相色谱，进行梯度洗脱，条件为50％–100％甲醇/水，流速10ml/min，洗脱4h，合并同一峰型下的流分，得到13个组分fr.g1–g13；对组分fr.g11进行正相硅胶柱色谱，最后经反相高效液相，条件为65％乙腈/水，流速2ml/min，检测波长为302nm，保留时间为34.9分钟，即得eutypellenonea。
本发明的第三方面，提供上述的含四元环的海松烷二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述的肿瘤为宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、慢性白血病、胰腺癌。
体外活性试验证明，对人宫颈癌细胞hela，人乳腺癌细胞mcf-7，人结肠癌细胞hct-116，人慢性白血病细胞k562，人胰腺癌细胞sw1990等多种不同的肿瘤细胞均有一定的抑制活性。
其中eutypellenonea和eutypellenoneb对人宫颈癌细胞hela，人乳腺癌细胞mcf-7，人结肠癌细胞hct-116，人慢性白血病细胞k562和人胰腺癌细胞sw1990的ic50值分别为18.05和8.98，12.72和10.25，16.59和10.43，12.55和8.79以及12.34和9.95μm。
本发明优点在于：
本发明的化合物经体外活性试验证明，对人宫颈癌细胞hela，人乳腺癌细胞mcf-7，人结肠癌细胞hct-116，人慢性白血病细胞k562，人胰腺癌细胞sw1990等多种不同的肿瘤细胞均有一定的抑制活性，可用于制备抗肿瘤药物。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)
地址：中国湖北省武汉市武汉大学
保藏日期：2013年4月12日
保藏编号：cctccno：m2013144
分类命名：弯孢聚壳菌d-1(eutypellasp.d-1)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1.制备本发明化合物
本发明所用的菌种是分离自北极
1、制备总粗提物
1)从平板上挑取少量保藏编号为cctccno：m2013144的eutypellasp.d-1的菌株的菌丝体，接种到250ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装100ml的种子培养基，28℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养3.5天获得一级种子液，按照5％(v/v)接种量接入相同种子培养基，于28℃、180r/min摇床培养3.5d，获得新鲜二级种子液，用于发酵培养。后将种子培养液接种到2000ml的锥形瓶中进行扩大培养，在装液量为400ml的锥形瓶中按照5％(v/v)的接种量接入新鲜种子液，置于20℃、180r/min摇床培养10d。当发酵培养至72h、96h、120h时，等量添加乙醇，添加终浓度为4％；
所述的种子培养基配方为：葡萄糖125g/l，硝酸钠3.3g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，酵母提取物0.7g/l，六水氯化钴3.125mg/l，硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，l-鸟氨酸盐酸盐15g/l。
发酵培养基配方为：蔗糖51.4g/l，硝酸钠3.3g/l，尿素2.5g/l，酵母提取物0.7g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，七水硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，六水氯化钴3.125mg/l。
2)将步骤1)中培养得到的菌液过滤，分别获得菌体和菌液，菌液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液蒸干溶剂，将菌丝体用二氯甲烷：甲醇＝1:1超声提取3次(30min/次)，浓缩提取液至无有机溶剂，加水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，最后合并菌液、菌体所得浸膏，得总提取物50g。
2、分离纯化
1)将乙酸乙酯粗提物经减压液相柱色谱(vlc)，以石油醚:乙酸乙酯＝60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1，0:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到12个组分fr.a–l；
2)对组分fr.e进行反相中压液相色谱，进行梯度洗脱，条件为55％–100％甲醇/水，流速20ml/min，洗脱4h，合并同一峰型下的流分，得到13个组分fr.e1–e13；对组分fr.e9进行正相硅胶柱色谱，最后经反相高效液相，条件为65％乙腈/水，流速2ml/min,检测波长为306nm，保留时间为54.0分钟，即得eutypellenoneb；
3)对组分fr.g进行反相中压液相色谱，进行梯度洗脱，条件为50％–100％甲醇/水，流速10ml/min,洗脱4h,合并同一峰型下的流分，得到13个组分fr.g1–g13；对组分fr.g11进行正相硅胶柱色谱，最后经反相高效液相，条件为65％乙腈/水，流速2ml/min，检测波长为302nm，保留时间为34.9分钟，即得eutypellenonea；
3、结构鉴定
本发明化合物经nmr、hresims、ir、uv等多种现代光谱技术，确定了本发明化合物的化学结构如下所示：
eutypellenonea：黄色油状物；uv(meoh)(logε)λmax203.0(3.88),304.0(3.72)nm；ir(kbr)νmax3358,3084,2969,2934,2872,1735,1654,1606,1464,1378,1242,1196,1159,1119,1083,1031,1001,920,843,779,663,623cm-1；hresimsm/z493.2001[m+cl]-(calcdforc26h34o7cl,493.1993).1hand13cnmr核磁共振谱数据见表1。
eutypellenoneb：黄色油状物；uv(meoh)(logε)λmax203.0(4.04),304.0(3.96)nm；ir(kbr)νmax3340,3084,2967,2937,2871,1735,1654,1607,1452,1377,1336,1242,1195,1160,1121,1091,1031,998,920,843,780,623cm-1；hresimsm/z471.2388[m-h]-(calcdforc27h35o7,471.2383).1hand13cnmr核磁共振谱数据见表2。
表1eutypellenonea的核磁共振谱数据
ameasuredat500mhzincdcl3；bmeasuredat100mhzincdcl3。
表2eutypellenoneb的核磁共振谱数据
ameasuredat500mhzincdcl3；bmeasuredat125mhzincdcl3。
实施例2本发明化合物的体外抗肿瘤活性实验：
方法：cck8法(参考文献：tominagah,ishiyamam,ohsetof,etal.awater-solubletetrazoliumsaltusefulforcolorimetriccellviabilityassay[j].analyticalcommunications,1999,36(2):47-50.)
分别取对数生长期的人宫颈癌细胞hela，人乳腺癌细胞mcf-7，人结肠癌细胞hct-116，人慢性白血病细胞k562，人胰腺癌细胞sw1990，各以5000个/孔的细胞密度接种于96孔板中，置于37℃5％co2恒温培养箱中培养。24h后向96孔板中加入不同浓度样品10μl，使板中溶液终体积为100μl，于培养箱内继续培养48h后，加入10μlcck-8溶液继续孵育约1h后取出，用酶标仪检测450nm处吸光度(od值)。每个待测样品在测试过程中均设置五至六个浓度梯度，并设置六个复孔作为平行实验，在实验结果中以标准偏差(sd)表示。计算待测样品对肿瘤细胞生长的抑制率的公式为：抑制率＝[对照组od值-加药组od值]/对照组od值×100％，半数抑制量ic50值采用logit法计算，结果见表3：
表3.化合物eutypellenonea和eutypellenoneb对肿瘤细胞的半数有效抑制浓度(μm)
由表3可见，化合物eutypellenonea和eutypellenoneb对多种不同的肿瘤细胞株均表明有一定的抑制作用，其中eutypellenoneb对人宫颈癌细胞hela，人慢性白血病细胞k562和人胰腺癌细胞sw1990的ic50值分别为8.98，8.79以及9.95μm。因此可用于制备抗肿瘤药物。
本发明为研制新的抗肿瘤药提供了新的先导化合物。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。