一种ALDH2的SNP位点的快速扩增检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及一种aldh2的snp位点的快速扩增检测试剂盒及检测方法，属于生物
技术领域：
，尤其是生物样品检测领域。
背景技术：
：乙醛脱氢酶(aldh)是一种催化乙醛氧化为乙酸的反应的醛脱氢酶，乙醛脱氢酶根据所在位置不同分为两种，位于细胞液内的aldh命名为aldh1，位于线粒体内的aldh为aldh2。aldh2基因位于第12号染色体，具有504位置的单核苷酸多态性位点(snp)，该位点的改变会导致酶活大大降低甚至失活，乙醛毒性高于乙醇，是造成酒醉的主要原因之一，而且乙醛还被怀疑具有致癌性，与肿瘤的发生存在一定的关系。据目前的研究发现，aldh2的基因多态性不仅与乙醇代谢相关的饮酒行为好酒精性肝硬化有关，还与肝癌、食道癌、口腔癌、硝酸甘油代谢等多种疾病有关。目前，aldh2的主要的snp检测方法有基因测序法，pcr-rflp法，基因芯片法等，基因测序法是针对snp位点的扩增片段直接测序；pcr-rflp法是将snp扩增产物经hha1酶切后具有不同的片段长度组合，可进行aldh2基因型测定；这些方法均是对pcr扩增产物的双链dna进行检测，不仅对扩增产物的数量要求较多，且检测过程繁琐，存在检测成本高、检测周期长的问题。技术实现要素：针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以现有的检测方法为基础，获得一种aldh2的snp位点的快速扩增检测试剂盒及检测方法。发明的第一个目的是提供一种aldh2的snp位点的快速扩增检测试剂盒的技术方案如下：所述试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，其中：高效扩增组包括测序引物和taqdna聚合酶，扩增引物序列如序列表seqidno：2和seqidno：3所示，扩增产物退火后经焦磷酸测序组测序，退火引物序列如序列表seqidno：4所示。本发明中的测序引物特异性高、准确性好，可以准确地检测aldh2的核心snp位点(rs671)，rs671的序列如序列表seqidno：1所示，序列用于线性指数pcr(late-pcr)可以大量产生便于焦磷酸测序的单链dna，无需对常规的双链dna进行解螺旋和分离。引物序列中有一条为过量引物，一条为限制性引物，过量引物和限制性引物与正向引物和反向引物之间并无明确的制定关系，可以根据需要扩增的片段单链来选择扩增量，扩增量大的链对应的扩增引物即为过量引物，另一条链对应的扩增引物为限制性引物。设计引物时，由于线性指数pcr对于引物的要求较高，要求引物之间的tm值之差≥5℃，扩增产物与过量引物之间的tm值之差≤13～18℃。这样可以保证最佳的延伸效果，但该温度要求不是绝对的，只要能够通过late-pcr扩增出待测的目的产物，就可以采用。优选的，本发明中如序列表seqidno：2所示的引物为过量引物，如序列表seqidno：3所示的引物为限制性引物。更优选的，过量引物与限制性引物在体系中的添加量为指数倍，最少为10倍。作为一种优选的实施方式，本发明中的扩增体系为25μl体系，具体为：1×pcrbuffer、3mmol/lmgcl2、100μmol/ldntps、1.5utaqdna聚合酶、0.1μmol/l限制性引物pl、1μmol/l过量引物pe，13％甘油和4％bsa2mmol/l；1μldna模板，加水补充至25μl。本发明的第二个目的在于提供一种采用上述快速扩增检测试剂盒的检测方法，所述方法包括：a)提取dna样本；b)以提取出的dna样本为模板，利用如序列表seqidno：2和seqidno：3所示的扩增引物，进行线性指数pcr扩增；c)将扩增产物进行退火处理，制备单链模板；d)将制备好的单链模板进行焦磷酸测序，确定snp位点的基因型。其中，dna样本为经过处理的dna模板，样本来源一般为人全血或组织，各类处理方法不限，只要可以起到预处理的目的，尽量减少血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰即可。全血样本也可以进行线性指数扩增，扩增时需要采用全血样品用的pcr缓冲液，或参考现有的全血样品扩增试剂盒进行相应处理。扩增条件为95℃预变性5min，60℃扩增循环，72℃延伸10min，4℃保持，其中每87℃10s、66℃10s和72℃20s组成一个扩增循环。扩增后的产物大部分为单链，但仍有部分区域为双链，为了使焦磷酸检测根据准确和快速，仍对扩增产物进行退火处理，制备为单链模板。优选的，退火处理时采用两种试剂：试剂a为不含apyrase的其他焦磷酸测序用试剂，包括dtt、aps、pvp、atpsulfurylase、klenow、荧光素和荧光素酶，试剂b为试剂a与apyrase的混合液。其中，试剂a的一种最优选的配置方案是：0.1mol/ltris-醋酸(ph7.7)，2mmol/ledta，10mmol/l醋酸镁，0.1％bsa，1mmol/l二硫苏糖醇(dtt)，2μmol/laps，0.4g/lpvp，200u/latpsulfurylase，18u/mlklenow，0.8mmol/ld-荧光素，6mg/l荧光素酶。试剂b最优选的一种配置方案是：试剂a与3.2u/mlapyrase的混合液。退火时，取1～2μllate-pcr产物和1.2μlaps(1mmol/l)，加入30μl试剂a，混匀后放置10～15min，再加40μl试剂b混匀放置3～5min，然后加入退火引物(终浓度达到0.3μmol/l)，室温退火10～15min。本发明采用本公司自行研发的焦磷酸测序仪进行测序，测序结果与现有的市售焦磷酸测序仪相比，不仅结果更加准确，且精度高样本用量小，检测出峰准确，无需重复验证试验。与现有技术相比，本发明采用线性指数扩增的目标片段扩增方法，精准设计的扩增引物扩增效率高且错配少，不仅大大增加了扩增效率，且直接扩增出单链dna可直接用于焦磷酸测序，无需对扩增产物进行标记和双链分离，避免了繁冗的实验步骤，也减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤。本试剂盒中的引物及实验方法均是经过精密的设计和测试得出的，适用于各种样本的aldh2的snp位点检测，并且检测效率高，检测结果准确。直接使用本发明中的扩增检测试剂盒和检测方法，对实验员的操作要求低，对检测环境的耐受力强，可以随时快速地进行扩增检测工作，方便快捷，检测成本低，结果准确且得出时间短，可以最大程度地减轻被检者的负担，具有良好的市场潜在价值。附图说明图1是本发明提供的线性指数扩增产品凝胶电泳图；图2是本发明提供的焦磷酸测序的纯合基因测序图；图3是本发明提供的处理后的焦磷酸测序的杂合基因测序图。具体实施方式下面结合实施例对本发明提供的aldh2的snp位点的快速扩增检测试剂盒及检测方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。本发明中采用的仪器和试剂如下：ptc-255pcr扩增仪，美国mjresearch公司；焦磷酸测序仪，武汉菲思特生物科技有限公司；taqdna聚合酶、dntps(10mmol/l)、10×buffer和mgcl2(25mmol/l)(大连takara公司)；amplitaqgold聚合酶(appliedbiosystems公司)；klenowfragment(无外切酶活性)、乙烯基吡咯烷酮(pvp)和luciferase(promega公司)，牛血清白蛋白(bsa)、aps和apyrase(sigma公司)，α-硫化脱氧三磷酸腺苷(datpαs)、dgtp、dttp和dctp(amershampharmaciabiotech公司)；atpsulfurylase由本公司实验室表达；其它试剂均为分析纯，所有试剂均用灭菌去离子水稀释。试剂盒中引物由上海invitrogen公司合成，具体引物名称及序列请见序列表。本发明中的快速扩增检测试剂盒包括：引物扩增组和焦磷酸测序组，其中引物扩增组包括扩增引物、dna聚合酶、扩增缓冲液、dntps和mg2+，焦磷酸测序组包括退火引物、dna聚合酶(amplitaqgold聚合酶)、atp硫酸化酶(atpsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)和dntp，以及配置反应液用的klenow酶(klenowfragment)。试剂盒中配有完整的操作方法，如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/ltris-hcl，50mmol/lkcl，ph9.3～9.5。一、扩增引物设计本实施例中针对aldh2基因2多态性的核心snp位点rs671进行检测，rs671的基因序列如序列表中seqidno：1所示，该snp位点全长1101bp，snp位点位于501位，发生错配时一般为a/g错配，具体序列如序列表seqidno:1所示，其中r表示aldh2基因2多态性的snp位点，seqidno:1序列具体如下：aggcatagtggcacatacttgttatcttaactacttgggaggctgaggcaggaggatcactgaagaccaggagttggagaccagcctgggtaacataatcagaccctgtctcttaaaaaaaaatttattgccaggcgtggttgcacgtgctggtagtccagctactcaggaagctgaggcaggagaatctcttgaaccccagatgtggaggttgcaacgagccaagatcatgccatggcaactccagcctgggcaacagagaaagattctatctcaaaaaaaaaaatttttttttaagttaaaaataaaataaagactttggggcaatacagggggtcctgggagtgtaacccataacccccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaattacagggtcaactgctatgatgtgtttggagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcgagtacgggctgcaggcatacactraagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggcctgttggggcttgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctgttgggggctcggggcctgccagaggttcaggacctgccggggactcagggcctgctggaagttcaggacctgctggggatcagggcctgccagggatttagggtctgctgggcgggccaccttttggcctctccctcatgcttgaggccatcagtgtttcctactaatttcccattttaagcctgagaagtgacaagagagggtaaagacccagcctctgctctgtcccatgagaaatactgagggacgtgcccccatcaggcctatgcggtcatttgctgggcttcgttatacgccaaggcctgtaggcctgagaagagggagagacttcagggggcggagcggagaggaaaagcttctagtaagaatcttttcagattttcaccaggcgcggtggcttt根据上述基因序列，采用primerprimer5软件设计扩增和退火引物，其中e为过量引物，过量引物序列如序列表seqidno：2所示，l为限制性引物，限制性引物序列如序列表seqidno：3所示，a为扩增产物，过量引物与限制性引物的tm值相差需要≥5℃，扩增产物与过量引物的tm值≤13～18℃。tm值的计算采用oligoanalyzer3.1软件计算。引物序列及参数如下表1所示：表1二、线性指数pcr扩增1.取样本次实施例中选取20例人血样本进行测试，样本来源于武汉市中心血站，样本进行预处理为dna模板，避免血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰。2.线性指数扩增线性指数扩增的反应体系为25μl体系，体系中具体成分如下：1×pcrbuffer(50mmolkcl、15mmoltris-hcl、ph8.0)、3mmol/lmgcl2、100μmol/ldntps、1.5utaqdna聚合酶、0.1μmol/l限制性引物pl、1μmol/l过量引物pe，13％甘油和4％bsa2mmol/l；1μldna模板，加水补充至25μl。扩增条件为：95℃5min，60℃扩增循环(87℃10s，66℃10s，72℃20s)，72℃10min，4℃保持。三、焦磷酸测序3.1引物设计根据扩增产物设计退火引物，退火引物序列如序列表seqidno：4所示：5'ggacaggcaaaggccatcgcag3'。3.2反应液的配制试剂a:0.1mol/ltris-醋酸(ph7.7)，2mmol/ledta，10mmol/l醋酸镁，0.1％bsa，1mmol/l二硫苏糖醇(dtt)，2μmol/laps，0.4g/lpvp，200u/latpsulfurylase，18u/mlklenow，0.8mmol/ld-荧光素，6mg/l荧光素酶；试剂b:试剂a，3.2u/mlapyrase。3.3单链模板的制备取1～2μllate-pcr产物和1.2μlaps(1mmol/l)，加入30μl试剂a，混匀后放置10～15min，再加40μl试剂b混匀放置3～5min，然后加入退火引物(终浓度达到0.3μmol/l)，室温退火10～15min。3.4焦磷酸测序将3.3步骤中的反应溶液全部转入焦磷酸测序反应池中，按照设计好的引物顺序加入dntp，采用本公司生产报批的焦磷酸测序仪进行测序，dntp加入顺序及检测结果如图2和图3所示，其中图2所示为aa型和gg型检测结果图，图3所示为处理后的ag型检测结果图。3.5统计结果根据对本实施例中20例样本的检测结果进行统计分析，aldh2基因2多态性基因型频率分布情况如下表2所示：表2aldh2基因2多态性基因型频率分布统计表aa型ag型gg型检出例1811总数占比(％)54055本实施例中的检测样本较小，加之aldh2基因2多态性的基因频率具有比较强的地域性，分布不均，故本次检测结果不代表该基因型的整体分布情况，仅表示本次实施例检测的统计结果。四、检测结果验证4.1琼脂糖凝胶电泳将经过线性指数扩增的扩增产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果图如图1所示，图中m为dnamarker，1～5道为随机抽取的扩增产物，条带6为阴性对照，图中目的条带位置显示扩增的目的片段大小正确。最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。序列表<110>湘潭智联技术转移促进有限责任公司<120>一种aldh2的snp位点的快速扩增检测试剂盒及检测方法<130>2017<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1001<212>dna<213>homosapiens<220><221>gene<222>(1)..(1001)<223>aldh2基因2型多态性基因序列<400>1aggcatagtggcacatacttgttatcttaactacttgggaggctgaggcaggaggatcac60tgaagaccaggagttggagaccagcctgggtaacataatcagaccctgtctcttaaaaaa120aaatttattgccaggcgtggttgcacgtgctggtagtccagctactcaggaagctgaggc180aggagaatctcttgaaccccagatgtggaggttgcaacgagccaagatcatgccatggca240actccagcctgggcaacagagaaagattctatctcaaaaaaaaaaatttttttttaagtt300aaaaataaaataaagactttggggcaatacagggggtcctgggagtgtaacccataaccc360ccaagagtgatttctgcaatctcgtttcaaattacagggtcaactgctatgatgtgtttg420gagcccagtcaccctttggtggctacaagatgtcggggagtggccgggagttgggcgagt480acgggctgcaggcatacactraagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcag540ggcctgttggggcttgagggtctgctggtggctcggagcctgctgggggattggggtctg600ttgggggctcggggcctgccagaggttcaggacctgccggggactcagggcctgctggaa660gttcaggacctgctggggatcagggcctgccagggatttagggtctgctgggcgggccac720cttttggcctctccctcatgcttgaggccatcagtgtttcctactaatttcccattttaa780gcctgagaagtgacaagagagggtaaagacccagcctctgctctgtcccatgagaaatac840tgagggacgtgcccccatcaggcctatgcggtcatttgctgggcttcgttatacgccaag900gcctgtaggcctgagaagagggagagacttcagggggcggagcggagaggaaaagcttct960agtaagaatcttttcagattttcaccaggcgcggtggcttt1001<210>2<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>aldh2过量引物序列<400>2ctacaagatgtcggggagtggc22<210>3<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>aldh2限制性引物序列<400>3cccaacagaccccaatccccca22<210>4<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>aldh2退火引物序列<400>4ggacaggcaaaggccatcgcag22当前第1页12