本发明属于化妆品技术领域，具体涉及到多肽类中的短肽的液相合成方法。
背景技术：
类蛇毒三肽(h-β-ala-pro-dab-nh-bzl)是一种模拟蛇毒毒素waglerini活性的小肽，waglerini发现于templeviper毒蛇的毒液(tripidolaemuswagleri)，为肌肉烟碱乙酰胆碱受体(nmachr)拮抗剂。h-β-ala-pro-dab-nh-bzl是dsm荷兰皇家帝斯曼集团全资子公司pentapharm通过高科技生化科技，模仿有效分子蛋白(waglerin1)的片段合成得到小分子三肽，其化学结构与毒蛇血清相似，但是相比肉毒杆菌却更安全有效，故可安全应用到化妆品中，具有优秀的光滑肌肤、迅速祛皱性能。
目前常规合类蛇毒三肽(h-β-ala-pro-dab-nh-bzl)的方法大多采用固相、液相相结合的方法，合成过程比较繁杂、成本高，因此开发工艺简便、成本较低的类蛇毒三肽合成方法对广泛使用于化妆品的类蛇毒三肽有重要意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种工艺简便、成本较低的类蛇毒三肽的液相合成方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、合成boc-β-ala-pro-ome
以硝基甲烷为溶剂，将boc-β-ala-oh、三乙胺、n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐、h-pro-ome·hcl在室温条件下搅拌反应10～12小时，得到boc-β-ala-pro-ome。
2、合成boc-β-ala-pro-oh
将boc-β-ala-pro-ome加入四氢呋喃与甲醇、质量分数为5％～10％的lioh水溶液体积比为2:1:1的混合溶液中，室温搅拌反应2～4小时，用1mol/l盐酸调节ph至4～5，旋转蒸发浓缩，浓缩液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，干燥，得到boc-β-ala-pro-oh。
3、合成boc-β-ala-pro-dab(boc)-ome
按照步骤1的方法将boc-β-ala-pro-oh、三乙胺、n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐和h-dab(boc)-ome·hcl反应，得到boc-β-ala-pro-dab(boc)-ome。
4、合成boc-β-ala-pro-dab(boc)-oh
按照步骤2的方法用四氢呋喃与甲醇、质量分数为5％～10％的lioh水溶液体积比为2:1:1的混合溶液处理boc-β-ala-pro-dab(boc)-ome，得到boc-β-ala-pro-dab(boc)-oh。
5、合成boc-β-ala-pro-dab(boc)-nh-bzl
以四氢呋喃为溶剂，将boc-β-ala-pro-dab(boc)-oh、1-羟基苯丙三唑、n,n-二异丙基碳二亚胺、苄胺在氮气保护下搅拌反应2～4小时，旋转蒸发除四氢呋喃，加入用乙酸乙酯溶解，用0.5mol/l盐酸溶液洗涤2次，水洗涤至中性，有机相减压浓缩至干，得到boc-β-ala-pro-dab(boc)-nh-bzl。
6、合成h-β-ala-pro-dab-nh-bzl
将boc-β-ala-pro-dab(boc)-nh-bzl加入三氟乙酸与水体积比为95:5的混合液中，室温搅拌反应1小时，浓缩反应液，将浓缩液加入冷乙醚中析出沉淀，离心除去上清，沉淀经乙醚洗涤、离心后真空干燥，得到h-β-ala-pro-dab-nh-bzl粗品；将h-β-ala-pro-dab-nh-bzl粗品经hplc纯化、冷冻干燥，得到h-β-ala-pro-dab-nh-bzl，即类蛇毒三肽。
上述步骤1中，优选boc-β-ala-oh和三乙胺、n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐、h-pro-ome·hcl的摩尔比为1:2～2.4:1～1.5:1。
上述步骤3中，优选boc-β-ala-pro-oh、三乙胺、n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐、h-dab(boc)-ome·hcl的摩尔比为1:2～2.4:1～1.5:1。
上述步骤5中，优选boc-β-ala-pro-dab(boc)-oh、1-羟基苯丙三唑、n,n-二异丙基碳二亚胺、苄胺的摩尔比为1:2.5～4:2.5～4:2。
本发明通过液相合成的方法由廉价易得的氨基酸甲酯为原料经氮端逐个延伸完成合成类蛇毒三肽，每步肽键合成生成的副产物有水溶性，易于分离，为类蛇毒三肽合成提供了一种工艺简便、成本较低的液相合成方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、合成boc-β-ala-pro-ome
将3.78g(0.02mol)boc-β-ala-oh加入55ml硝基甲烷中，并加入6.2ml(0.044mol)三乙胺，搅拌溶解至澄清，然后在搅拌下加入5.07g(0.02mol)n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐，搅拌溶解后再加入3.31g(0.02mol)脯氨酸甲酯盐酸盐(h-pro-ome·hcl)，室温搅拌反应10小时，反应完后将反应液旋转蒸发浓缩，浓缩产物用乙酸乙酯溶解后用水洗涤3次，有机相30～40℃浓缩至干，得到5.50gboc-β-ala-pro-ome，收率91.51％。
2、合成boc-β-ala-pro-oh
将步骤1得到的boc-β-ala-pro-ome加入60ml四氢呋喃与甲醇、5％的lioh水溶液体积比为2:1:1的混合溶液中，室温搅拌反应2小时，用1mol/l盐酸调ph至4～5，旋转蒸发浓缩除四氢呋喃，浓缩液用乙酸乙酯萃取(50ml×3次)，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠干燥，30～40℃减压浓缩，干燥得到5.03gboc-β-ala-pro-oh，收率95.99％。
3、合成boc-β-ala-pro-dab(boc)-ome
将5.03g(0.0176mol)boc-β-ala-pro-oh加入55ml硝基甲烷中，并加入6.2ml(0.0352mol)三乙胺，搅拌溶解至澄清，然后在搅拌下加入4.46g(0.0176mol)n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐，搅拌溶解后再加入4.73g(0.0176mol)n'-叔丁氧羰基-l-2,4-二氨基丁酸甲酯盐酸盐(h-dab(boc)-ome·hcl)，室温搅拌反应10小时，反应完后将反应液旋转蒸发浓缩，浓缩产物用乙酸乙酯溶解后用水洗涤3次，有机相30～40℃浓缩至干，得到7.54gboc-β-ala-pro-dab(boc)-ome，收率85.58％。
4、合成boc-β-ala-pro-dab(boc)-oh
将步骤4得到的boc-β-ala-pro-dab(boc)-ome加入80ml四氢呋喃与甲醇、5％的lioh水溶液体积比为2:1:1的混合溶液中，室温搅拌反应2小时，用1mol/l盐酸调ph至4～5，旋转蒸发浓缩除四氢呋喃，浓缩液用乙酸乙酯萃取(50ml×3次)，合并乙酸乙酯相，用无水硫酸钠干燥，30～40℃减压浓缩，干燥得到6.69gboc-β-ala-pro-dab(boc)-oh，收率91.02％。
5、合成boc-β-ala-pro-dab(boc)-nh-bzl
将6.69g(0.0137mol)boc-β-ala-pro-dab(boc)-oh、5.55g(0.0411mol)1-羟基苯丙三唑置于反应容器中，加入150ml四氢呋喃搅拌溶解至澄清，在氮气保护下再加入6.4ml(0.0411mol)n,n-二异丙基碳二亚胺搅、3.0ml(0.0274mol)苄胺，在氮气保护下搅拌反应2小时，旋转蒸发浓缩除四氢呋喃，浓缩产物溶解于150ml乙酸乙酯中，用水洗涤3次，有机相30～40℃浓缩至干，得到6.87gboc-β-ala-pro-dab(boc)-nh-bzl，收率87.07％。
6、合成h-β-ala-pro-dab-nh-bzl
将步骤5得到的boc-β-ala-pro-dab(boc)-nh-bzl加入70ml三氟乙酸与水体积比为95:5的混合液中，完全溶解后室温搅拌反应1小时，浓缩反应液至20ml，将浓缩液加入到100ml冷乙醚中析出沉淀，离心除去上清，将沉淀用乙醚洗涤、离心2次，室温真空干燥，得到3.67gh-β-ala-pro-dab-nh-bzl粗品。将h-β-ala-pro-dab-nh-bzl粗品经hplc纯化，纯化条件：柱子规格为glp-id50mm×450mm，检测波长215nm，流速30ml/min，流动相a为体积分数0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相b为体积分数0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液，洗脱梯度为：b相35％～45％60min，纯化液经减压浓缩、冷冻干燥，得到2.91g纯度98.2％的h-β-ala-pro-dab-nh-bzl，即类蛇毒三肽，收率65.1％。
实施例2
本实施例的步骤1中，boc-β-ala-oh、三乙胺、n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐和h-pro-ome·hcl的摩尔比为1:2.2:1.2:1，反应时间为11小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到5.61gboc-β-ala-pro-ome，收率93.34％。
本实施例的步骤2中，lioh水溶液中lioh的质量分数为7.5％，反应时间为3小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同。
本实施例的步骤3中，boc-β-ala-pro-oh、三乙胺、n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐和h-dab(boc)-ome·hcl的摩尔比为1:2.2:1.2:1，反应时间为11小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到7.59gboc-β-ala-pro-dab(boc)-ome，收率86.15％。
本实施例的步骤4中，lioh水溶液中lioh的质量分数为7.5％，反应时间为3小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同。
本实施例的步骤5中，boc-β-ala-pro-dab(boc)-oh、1-羟基苯丙三唑、n,n-二异丙基碳二亚胺和苄胺的摩尔比为1:2.5:2.5:2，反应时间为3小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到3.03g纯度97.9％的h-β-ala-pro-dab-nh-bzl，即类蛇毒三肽，收率67.78％。
实施例3
本实施例的步骤1中，boc-β-ala-oh、三乙胺、n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐和h-pro-ome·hcl的摩尔比为1:2.4:1.5:1，反应时间为12小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到5.35gboc-β-ala-pro-ome，收率89.59％。
本实施例的步骤2中，lioh水溶液中lioh的质量分数为10％，反应时间为4小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同。
本实施例的步骤3中，boc-β-ala-pro-oh、三乙胺、n-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐和h-dab(boc)-ome·hcl的摩尔比为1:2.4:1.5:1，反应时间为12小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到7.39gboc-β-ala-pro-dab(boc)-ome，收率83.88％。
本实施例的步骤4中，lioh水溶液中lioh的质量分数为10％，反应时间为4小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同。
本实施例的步骤5中，boc-β-ala-pro-dab(boc)-oh、1-羟基苯丙三唑、n,n-二异丙基碳二亚胺和苄胺的摩尔比为1:4:4:2，反应时间为4小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到2.88g纯度98.11％的h-β-ala-pro-dab-nh-bzl，即类蛇毒三肽，收率64.42％。