一种邻位连接技术用于定量检测CysC含量的试剂盒、制备及使用方法与流程

本发明涉及一种邻位连接技术用于体外免疫诊断检测人体内Cys C的含量，属于疾病诊断检测领域。

背景技术：

胱抑素C(Cys C)是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为 13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的Cys C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾小球滤过决定，而不依赖任何外来因素，如性别、年龄、饮食的影响，是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。

正常情况下，Cys C在血清和血浆中的浓度为0.51mg/L～1.09mg/L(参考范围)。当肾功能受损时，Cys C在血液中的浓度随肾小球滤过率变化而变化。肾衰时，肾小球滤过率下降，Cys C在血液中浓度可增加10多倍，血清中的Cys C的浓度就由肾小球滤过率决定，Cys C也就成为反应肾小球滤过率的一个非常好的标志物。Cys C的测定用于肾功能早期受损的评价。

目前检测血、尿中Cys C含量的常用方法包括有酶联免疫吸附试验法和免疫比浊法等。这些方法均存在相应的缺点，酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低，免疫比浊法存在液态的胶乳试剂稳定性不佳，检测结果精准性不佳。而本发明提出的基于一种邻位连接技术检测 Cys C含量的免疫诊断检测方法，具有检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设备常见等优势，将其应用于肾小球滤过率变化的监测，可以提高肾功能早期受损诊断的准确率，具有极大的市场价值。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测Cys C的检测试剂盒、其制备及使用方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种制备基于邻位连接技术定量检测Cys C含量的试剂盒的方法，包括如下步骤：

1)抗Cys C抗体偶联寡聚核苷酸的Cys C探针A；

2)抗Cys C抗体偶联寡聚核苷酸的Cys C探针B；

在上述技术方案中，所述抗Cys C抗体为针对Cys C不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。

根据以上任一技术方案所述所制备的基于邻位连接技术的Cys C检测试剂盒。其主要组成包括：

1)Cys C探针A；

2)Cys C探针B；

3)连接缓冲液；

4)qPCR反应液。

以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)将待测样本加入到反应孔中，再加入Cys C探针A和Cys C探针B，孵育5-30min 后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；

2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒原理示意图，其中，1-寡聚脱氧核苷酸，2-偶联剂，3-抗Cys C抗体，4-待测物(Cys C)，5-寡聚脱氧核苷酸，6-偶联剂，7-抗Cys C抗体，8-Taqman荧光探针，9-Taq酶

图2是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒检测线性范围图。

图3是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒结果相关性比较。

具体实施方式

以下参考附图对本发明的一种邻位连接技术用于定量检测Cys C含量的试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。

实施例1

Cys C探针A的制备：

1)取0.1mg抗Cys C抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；

2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；

3)将上述被修饰的抗体加入寡聚脱氧核苷酸a，4℃过夜孵育，即得到Cys C探针A。

实施例2

Cys C探针B的制备：

1)取0.1mg抗Cys C抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；

2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；

3)将上述被修饰的抗体加入寡聚脱氧核苷酸b，4℃过夜孵育，即得到Cys C探针B。

实施例3

试剂盒主要组成：

1)Cys C探针A；

2)Cys C探针B；

3)连接缓冲液；

4)qPCR反应液。

实施例4

试剂盒使用方法，包括如下步骤：

1)将待测样本加入到反应孔中，再加入Cys C探针A和Cys C探针B，孵育5-30min 后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；

2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。

此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。

实施例5

本发明试剂盒方法学评价：

1.线性

配制浓度为0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、4μg/mL、8μg/mL 的Cys C标准品溶液。在反应孔中分别加入10μL标准品、加入100μL Cys C探针A，加入 100μL Cys C探针B，37℃温育10分钟。温育后，加入20μL连接缓冲液反应10min后，再加入20μL qPCR反应液进行qPCR反应，测量计算每个反应孔的Ct值。

以Ct值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。

2.准确度

相关性比对：如图3所示，与北京九强Cys C试剂盒的相关性为：y＝1.028x-0.078，R²＝0.997。

本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。