本申请是申请号200980138340.8的专利申请的分案申请。
发明背景
本申请要求2008年8月12日提交的美国申请号61/088,054的优先权，该申请的全部内容无所放弃地通过引用方式特别并入本文。
1.发明领域
本申请大体上涉及干细胞领域。更具体而言，本申请涉及体细胞的重编程(reprogramming)。
2.相关技术描述
一般而言，干细胞是未分化的细胞，其可以产生成熟的功能性细胞的演替。例如，造血干细胞可以产生任意的不同类型的末端分化的血液细胞。胚胎干(es)细胞源自胚胎，其是多潜能的，因此具有发育成任意器官或组织类型，或至少潜在地发育成完整胚胎的能力。
诱导的多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcell)，通常简称为ips细胞或ipsc，是一类通过插入某些基因人工地从非多潜能细胞(通常为成年体细胞)衍生而来的多潜能干细胞。人们相信，在很多方面，诱导的多潜能干细胞与天然多潜能干细胞例如胚胎干细胞是相同的，例如在以下方面：某些干细胞基因和蛋白的表达、染色质甲基化的式样、加倍时间、胚状体(embryoidbody)的形成、畸胎瘤的形成、活嵌合体的形成以及潜能和分化能力，但是其与天然多潜能干细胞的相关性的完整程度仍待确定。
ips细胞首先于2006年从小鼠细胞中产生(takahashi等人,2006)，于2007年从人类细胞中产生(takahashi等人,2007；yu等人,2007)。这在干细胞研究中被认为是重要的进展，因为这可以允许研究人员获得多潜能干细胞而不必争议性地使用胚胎，多潜能干细胞在研究中具有重要意义并且具有潜在的治疗性应用。
但是，在这些诱导的多潜能干(ips)细胞的研究的现阶段，产生ips细胞的效率低下，这阻碍了ips细胞在临床研究中的应用。因此，需要开发一种增强产生诱导的多潜能干细胞的效率的方法。
发明概述
本发明通过以改善的效率提供诱导的多潜能干细胞而克服了本领域中的主要缺陷。在第一个实施方式中，提供了用于产生诱导的多潜能干(ips)细胞群体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得一个或多个重编程载体，每个载体包含表达盒，所述表达盒包含：(i)转录调节元件；(ii)与所述转录调节元件可操作地连接的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码重编程因子或报告分子；(iii)位于所述第一核苷酸序列的3’端的ires；和(iv)编码重编程因子或报告分子的第二核苷酸序列，其位于所述ires的3’端，从而所述第二核苷酸序列受到所述ires的翻译控制，其中：(1)，如果所述第一核酸编码重编程因子，则所述第二核苷酸序列编码另一重编程因子或报告分子；和(2)如果所述第一核酸编码报告分子，则所述第二核苷酸序列编码重编程因子；(b)将所述重编程载体导入体细胞群体的细胞中；(c)培养所述细胞以扩展所述群体；(d)选择所述经扩展的群体的子代细胞，其中所述子代具有胚胎干细胞的一个或多个特征；和(e)培养所选择的子代细胞以提供ips细胞群体。
在一些方面，所述第一核苷酸序列编码重编程因子并且所述第二核苷酸序列编码报告分子，反之亦可，因此报告基因的同时表达辅助如下文描述的重编程细胞的选择。
为了在同一转录调节元件下共表达多个重编程因子，表达盒可以包含第二ires和位于第二ires的3’端的第三核苷酸序列，从而所述第三核苷酸序列受到所述第二ires的翻译控制。在一些实施方式中，所述第一和第二核苷酸序列可以编码不同的重编程因子。在以上任意情况下，报告分子可由第一、第二或第三核苷酸序列编码以改善转染和ips细胞选择效率。
本发明的能力部分依赖于报告分子的表达，例如荧光蛋白，其作为感染效率的指示，一般与来自同一多顺反子转录本的重编程基因的表达水平相关联，一旦细胞被完全诱导为多潜能，则所述报告分子即沉默。例如，上述方法的步骤c)可以进一步包括选择体细胞的群体，其中所述体细胞表达报告分子，并且培养所选细胞以扩展该群体。因此，在一些方面，可以使用荧光辅助的细胞分选法(facs)基于报告分子例如荧光蛋白的表达水平来选择被感染(从最低效率感染至最高效率感染)的细胞。
在示例性的实施方式中，报告分子可以是细胞表面标志物、荧光蛋白、表位、氯霉素乙酰转移酶(cat)、萤光素酶或β-半乳糖苷酶。例如，所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)或黄色荧光蛋白(yfp)，或其变体。取决于所用的报告分子，步骤c)中的选择可以包括荧光激活的细胞分选(facs)、cat测定、发光测定或本领域普通技术人员已知的任何用于检测或筛选报告分子表达的方法，以选择有效转染的细胞。替代性的或互补性的方法是，使用常规方法例如rt-pcr、原位杂交、rna阵列或杂交法(例如northern印迹)测定子代细胞中外源性报告分子转录本的不存在。
在本发明的进一步的实施方式中，一个或多个重编程载体中包含的任意核苷酸序列所编码的ips重编程因子可以包括来自sox家族的至少一个成员和来自oct家族的至少一个成员。sox和oct被认为是指定es细胞特征的转录调节层级的中心。例如，sox可以是sox-1、sox-2、sox-3、sox-15或sox-18；oct可以是oct-4。另外的因子可以增强重编程效率，例如nanog、lin28、klf4或c-myc；重编程因子的特定组可以是包含sox-2、oct-4、nanog和任选的lin-28的组；或包含sox-2、oct4、klf和任选的c-myc的组。
在另一个实施方式中，载体可以是病毒载体，更具体而言可以是逆转录病毒载体，例如鼠白血病病毒(mlv)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(mmlv)、akv-mlv、sl-3-3-mlv或其它密切相关的病毒。病毒载体还可以是慢病毒载体。在一些方面，转录调节元件可以包含长末端重复区(ltr)以介导病毒基因的整合。
在一些实施方式中，可以通过使用一个或多个内部核糖体进入位点(ires)来使用多顺反子转录本。示例性的ires可以是脑心肌炎病毒ires、小核糖核酸病毒ires、口蹄病病毒ires、甲肝病毒ires、丙肝病毒ires、人类鼻病毒ires、脊髓灰质炎病毒ires、猪水疱病病毒ires、芜菁花叶马铃薯y病毒属病毒ires、人类成纤维细胞生长因子2mrnaires、瘟病毒属ires、利什曼原虫rna病毒ires、莫洛尼氏鼠白血病病毒ires、人类鼻病毒14ires、口蹄疫病毒ires、人类免疫球蛋白重链结合蛋白mrnaires、果蝇触角足基因(antennapedia)mrnaires、人类成纤维细胞生长因子2mrnaires、庚型肝炎病毒ires、烟草花叶病毒属ires、血管内皮生长因子mrnaires、柯萨奇b组病毒ires、c-myc原癌基因mrnaires、人类myt2mrnaires、人类双埃可病毒属1型病毒ires、人类双埃可病毒属2型病毒ires、真核启动因子4gimrnaires、plautiastali肠道病毒ires、泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒ires、牛肠道病毒ires、连接蛋白43mrnaires、同源域蛋白gtxmrnaires、aml1转录因子mrnaires、nf-κb阻抑因子mrnaires、x-连锁凋亡抑制剂mrnaires、蟋蟀麻痹病毒rnaires、p58(pitslre)蛋白激酶mrnaires、鸟氨酸脱羧酶mrnaires、连接蛋白-32mrnaires、牛病毒性腹泻病毒ires、胰岛素样生长因子i受体mrnaires、人类免疫缺陷病毒1型gag基因ires、猪瘟病毒ires、卡波西肉瘤相关疱疹病毒ires、选自随机寡核苷酸文库的短ires、jembrana病病毒ires、凋亡蛋白酶激活因子1mrnaires、禾谷缢管蚜(rhopalosiphumpadi)病毒ires、阳离子型氨基酸转运子mrnaires、人类胰岛素样生长因子ii引导蛋白2mrnaires、贾第鞭毛虫病毒属ires、smad5mrnaires、猪捷申病毒-1talfanires、果蝇无毛基因(hairless)mrnaires、hsnm1mrnaires、cbfa1/runx2mrnaires、epstein-barr病毒ires、木槿褪绿环斑病毒ires、大鼠垂体加压素v1b受体mrnaires、人类hsp70mrnaires或其变体。特别地，ires元件可以是脑心肌炎病毒ires。
在其它实施方式中，可以通过脂质体转染、电穿孔、颗粒轰击、磷酸钙、多聚阳离子或多聚阴离子或适合用于将外源遗传元件导入细胞的任何方法导入所述重编程载体。
在本发明的其它方面，体细胞可以来自哺乳动物，或更具体而言，来自人。所述体细胞可以是末端分化的细胞，或组织干细胞，包括但不限于，成纤维细胞、造血细胞或间质细胞。例如，所述体细胞是成纤维细胞。所述体细胞可以来自组织细胞库或来自选择的人类受试者，特别是活的人类受试者。来自这些体细胞的子代的基因组将被认为是源自一定来源的这些体细胞，例如选择的人类个体。
在一些方面，可以就下列项来选择子代细胞：基本上丧失报告分子的表达、未分化的形态、胚胎干细胞特异性标志物或多潜能或多谱系分化潜力或本领域已知的任何特征，或其组合。可以在转染后的一个或多个时间点执行该选择步骤，以确保细胞处于多潜能状态并且不回到分化的状态。因此，选择步骤可以在子代细胞进入自我持续的多潜能状态之后的时间，例如将重编程载体导入细胞之后至少大约10天至至少30天。
具体而言，可以就未分化的形态来选择子代细胞，因为这比较方便。胚胎干细胞特异性标志物可以是选自下列的一个或多个特异性标志物：ssea-3、ssea-4、tra-1-60或tra-1-81、tra-2-49/6e、gdf3、rex1、fgf4、esg1、dppa2、dppa4和htert。
在具体的方面，可以基于基本上无导入的报告基因的表达将子代细胞选定为ips细胞，这是因为，随着细胞变成多潜能的，重编程的细胞能够使外源导入的物质沉默。因此，基本上丧失报告分子的表达(例如荧光)是除了形态学特征之外的指征：指示该细胞已被重编程。可以基于导入的报告基因通过荧光激活的细胞分选(facs)、cat测定法或发光测定法来选择此类特征。“基本上丧失”报告基因表达意思是ips细胞群体的少于1％、0.5％、0.1％、0.05％或任何其中间百分率的细胞包含外源报告分子表达。
在其它方面，重编程载体也公开为：包含表达盒，所述表达盒包含：(a)转录调节元件；(b)与所述转录调节元件可操作地连接的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码重编程因子或报告分子；(c)位于所述第一核苷酸序列的3’端的ires；和(d)编码重编程因子或报告分子的第二核苷酸序列，其位于所述ires的3’端，从而所述第二核苷酸序列受到所述ires的翻译控制，其中：(i)，如果所述第一核酸编码重编程因子，则所述第二核苷酸序列编码另一重编程因子或报告分子；和(ii)如果所述第一核酸编码报告分子，则所述第二核苷酸序列编码重编程因子。
在一些方面，所述第一核苷酸序列编码重编程因子并且所述第二核苷酸序列编码报告分子，反之亦可；或者，所述第一和第二核苷酸序列编码不同的重编程因子。为了在同一转录调节元件的控制下共表达多个重编程因子，表达盒可以包含第二ires和位于所述第二ires的3’端的第三核苷酸序列，从而所述第三核苷酸序列受到所述第二ires的翻译控制。在以上任意情况下，报告分子可由第一、第二或第三核苷酸序列编码以改善转染和ips细胞选择的效率。
在其它方面，还提供了重编程载体，其包含多顺反子表达盒，所述表达盒包含：(a)转录调节元件；和(b)与所述转录调节元件可操作地连接的第一和第二编码序列，其中所述第一编码序列编码重编程因子并且所述第二编码序列编码第二重编程因子或报告分子。例如，所述转录调节元件可以包含长末端重复区、启动子、增强子、转录控制元件等。包含在所述多顺反子表达盒中的第二编码序列可以编码用于促进选择编码序列的表达或基本上丧失表达的报告分子，以辅助重编程方法。或者，所述第二编码序列可以是第二或更多重编程因子，以通过表达来自同一多顺反子转录本的两个或更多个重编程因子来减少前病毒拷贝数和插入型突变的机会。类似地，多顺反子表达盒可以包含与转录调节元件可操作地连接的一个或多个另外的编码序列(例如，第三、第四或第五编码序列等)，其中所述一个或多个另外的编码序列编码重编程因子、报告分子或选择标志物。例如，所述选择标志物可以是抗生素抗性标志物或表面选择标志物。
在以上描述的重编程载体的示例性实施方式中，报告分子可以是细胞表面标志物、荧光蛋白、表位、氯霉素乙酰转移酶(cat)、萤光素酶或β-半乳糖苷酶。例如，所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)或黄色荧光蛋白(yfp)，或其变体，例如egfp、erfp、ebfp、ebfp2、ecfp、eyfp。在一些方面，重编程载体还可以包含选择标志物，例如抗生素抗性标志物。
在重编程载体的进一步实施方式中，由重编程载体中包含的任意核苷酸序列所编码的ips重编程因子可以包括sox、oct、nanog、lin28、klf4或c-myc。例如，sox可以是sox-1、sox-2、sox-3、sox-15或sox-18；oct可以是oct-4。另外的因子可以增强重编程效率，例如nanog、lin28、klf4或c-myc。在另一个实施方式中，载体可以是病毒载体，更具体而言可以是逆转录病毒载体，例如鼠白血病病毒(mlv)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(mmlv)、akv-mlv、sl-3-3-mlv或其它密切相关的病毒。病毒载体还可以是慢病毒载体、腺病毒载体、基于epstein-barr病毒(ebv)的载体。在一些方面，转录调节元件可以包含长末端重复区(ltr)以介导外源基因的整合和转录。
在一些实施方式中，重编程载体可以包含一个或多个内部核糖体进入位点(ires)或任何足以驱动编码序列的独立翻译的序列。示例性的ires可以是脑心肌炎病毒ires、小核糖核酸病毒ires、口蹄病病毒ires、甲肝病毒ires、丙肝病毒ires、人类鼻病毒ires、脊髓灰质炎病毒ires、猪水疱病病毒ires、芜菁花叶马铃薯y病毒属病毒ires、人类成纤维细胞生长因子2mrnaires、瘟病毒属ires、利什曼原虫rna病毒ires、莫洛尼氏鼠白血病病毒ires、人类鼻病毒14ires、口蹄疫病毒ires、人类免疫球蛋白重链结合蛋白mrnaires、果蝇触角足基因(antennapedia)mrnaires、人类成纤维细胞生长因子2mrnaires、庚型肝炎病毒ires、烟草花叶病毒属ires、血管内皮生长因子mrnaires、柯萨奇b组病毒ires、c-myc原癌基因mrnaires、人类myt2mrnaires、人类双埃可病毒属1型病毒ires、人类双埃可病毒属2型病毒ires、真核启动因子4gimrnaires、plautiastali肠道病毒ires、泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒ires、牛肠道病毒ires、连接蛋白43mrnaires、同源域蛋白gtxmrnaires、aml1转录因子mrnaires、nf-κb阻抑因子mrnaires、x-连锁凋亡抑制剂mrnaires、蟋蟀麻痹病毒rnaires、p58(pitslre)蛋白激酶mrnaires、鸟氨酸脱羧酶mrnaires、连接蛋白-32mrnaires、牛病毒性腹泻病毒ires、胰岛素样生长因子i受体mrnaires、人类免疫缺陷病毒1型gag基因ires、猪瘟病毒ires、卡波西肉瘤相关疱疹病毒ires、选自随机寡核苷酸文库的短ires、jembrana病病毒ires、凋亡蛋白酶激活因子1mrnaires、禾谷缢管蚜(rhopalosiphumpadi)病毒ires、阳离子型氨基酸转运子mrnaires、人类胰岛素样生长因子ii引导蛋白2mrnaires、贾第鞭毛虫病毒属ires、smad5mrnaires、猪捷申病毒-1talfanires、果蝇无毛基因(hairless)mrnaires、hsnm1mrnaires、cbfa1/runx2mrnaires、epstein-barr病毒ires、木槿褪绿环斑病毒ires、大鼠垂体加压素v1b受体mrnaires、人类hsp70mrnaires或其变体。特别地，ires元件可以是脑心肌炎病毒ires、小核糖核酸病毒ires或口蹄病病毒ires。
在其它实施方式中，提供了用于产生诱导的多潜能干(ips)细胞群体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得如上所述的一个或多个重编程载体；和(b)将所述重编程载体导入体细胞群体的细胞中以提供ips细胞群体。在一些方面，用于产生ips的一个或多个重编程载体可以包括编码包含sox和oct的重编程因子的编码序列。
所述方法还可以包括以下步骤：(c)培养细胞以扩展群体；和(d)选择经扩展的群体的子代细胞，其中所述子代细胞具有胚胎干细胞的一个或多个特征。该方法中还可以包括另外的步骤(e)：培养所选择的子代细胞以提供ips细胞群体。
对于包含编码报告分子的编码序列的重编程载体，步骤(c)还可以包括选择体细胞的群体，其中所选择的体细胞表达报告分子，因为在导入重编程载体之后，在报告分子的表达与重编程因子之间存在关联。在一些方面，步骤(c)中的选择可以包括目测、荧光激活的细胞分选(facs)、cat测定法或发光测定法，以检测报告分子的表达。
在一些方面，通过脂质体转染、电穿孔、颗粒轰击、磷酸钙、多聚阳离子、多聚阴离子或本领域已知的任何用于核苷酸进入细胞的方法将一个或多个重编程载体导入体细胞中。
对于重编程，体细胞可以是哺乳动物体细胞，例如人类体细胞。体细胞的类型可以是成纤维细胞、造血细胞、淋巴细胞(例如t细胞或b细胞)、间质细胞、胰岛细胞或组织干细胞。
在子代细胞建立自给自足的多潜能状态的预定时间段之后，关闭病毒载体中包含的表达盒的表达。因此，可以就某些特征来选择子代细胞，例如基本上丧失报告分子的表达，或其它已知的胚胎细胞样特征，例如未分化的形态、胚胎干细胞特异性标志物或多潜能性。可以通过目测、荧光激活的细胞分选(facs)、cat测定法或发光测定法来选择报告分子表达的丧失或减少，或es细胞特异性表面标志物，例如ssea-3、ssea-4、tra-1-60或tra-1-81、tra-2-49/6e、gdf3、rex1、fgf4、esg1、dppa2、dppa4和htert，从而选择子代细胞。
本发明的方法和/或组合物的上下文中所讨论的实施方式可以就本文描述的任何其它方法或组合物来应用。因此，涉及一种方法或组合物的实施方式也可以应用于本发明的其它方法和组合物。
提及核酸时，如本文使用的术语“编码(encode)”或“编码(encoding)”用于使本发明易于被技术人员所理解，但是这些术语可以分别与“包含(comprise)”或“包含(comprising)”相互替换地使用。
如本文说明书中使用的“一种(a)”或“一种(an)”可以指一个或多个。如本文权利要求中所使用，当与词语“包含”一起使用时，词语“一种(a)”或“一种(an)”可以指一个或多个。
除非明确指明仅指替代物或者替代物是相互排除的，否则权利要求中使用的术语“或”可用于指“和/或”，虽然本公开支持仅指替代物和“和/或”的定义。如本文使用的“另一个”可以指至少第二个或更多个。
在本申请全文中，术语“大约”用于表示某数值包括用于测定该数值的设备、方法的误差的内在差异，或者存在于研究受试者之间的差异。
本发明的其它内容、特征和优势将通过以下详细描述变得明显。但是应该理解，虽然详细描述和具体实施例指明了本发明的优选实施方式，但是仅是为了解释目的而提供，因为本发明精神和范围内的多种改变和修饰对于阅读了该详细描述的本领域技术人员将是明显的。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，包括这些附图是为了进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并联合本文提供的具体实施方式的详细描述将更好地理解本发明。
图1a-b：ires依赖性的多顺反子系统的实例。
具体实施方式
1.本发明
驱动人类体细胞或完全分化的人类细胞回到多潜能或“干细胞”状态的能力将克服关于使用源自胚胎的干细胞的很多严重的科学和社会学挑战，并辅助实现再生医学(regenerativemedicine)的希望。但是，目前的重编程方法效率差，因此阻止了其应用。本发明以改进的效率产生诱导的多潜能干细胞，克服了目前的重编程技术中存在的几个主要问题。与之前的方法相反(之前的方法一般使用仅仅基于胚胎干细胞样形态学来进行选择)，这些方法的一些方面使用表达多顺反子转录本的载体，所述多顺反子转录本除了编码重编程因子之外还编码报告分子，以改善选择并优化重编程细胞的效率。以下描述了本发明的其它实施方式和优势。
ii.定义
“重编程”是这样的方法：其赋予细胞与在没有重编程的相同条件下相比，可测的增加的形成至少一种新细胞类型的能力(无论是在培养物中还是在体内)。更具体而言，重编程是赋予体细胞多潜能潜力的方法。意思是，在足够的增殖之后，可测比例的子代具有新细胞类型的表型特征(如果在重编程之前基本上没有此类子代可以形成)；或者，具有新细胞类型的特征的子代比例比重编程之前是可测的增加。在某些条件下，具有新细胞类型的特征的子代比例可以是至少大约1％、5％、25％或更高，按次序以渐增为优选。
“载体”或“构建体”(有时称作基因递送或基因转移“介质”)是指大分子或分子复合物，其包含要被递送(体外或体内)进入宿主细胞的多核苷酸。
“表达构建体”或“表达盒”意思是能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括启动子或功能上等同于启动子的结构。还可以包括另外的元件，例如增强子和/或转录终止信号。
当用于与细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸相关时，术语“外源的”是指通过人工或天然方法被导入该细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸；或者，当用于与细胞相关时，是指通过人工或天然方法被分离然后被导入其它细胞或导入生物体的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者其可以是天然存在于生物体或细胞中的核酸的一个或多个另外的拷贝。外源细胞可以来自不同的生物体，或者其可以来自相同的生物体。通过非限制性举例来讲，外源核酸位于与天然细胞中的不同的染色体位置上，或者其两侧是不同于天然状态下的核酸序列。
术语“对应于”在本文中用于意指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的(即相同的，或在进化上严格相关)；或，多肽序列与参考多肽序列是相同的。与此对比，术语“互补于”在本文中用于意指互补性序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分是同源的。举例解释：核苷酸序列"tatac"对应于参考序列"tatac"并且互补于参考序列"gtata"。
“编码”特定蛋白的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是指：当被置于合适的调节序列控制下时，转录并任选也被翻译成基因产物例如多肽(在体外或体内)的核酸分子。编码区可以以cdna、基因组dna或rna形式存在。当以dna形式存在时，核酸分子可以是单链的(即正义链)或双链的。编码区的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。基因可以包括但不限于，来自原核或真核mrna的cdna，来自原核或真核dna的基因组dna序列，以及合成的dna序列。转录终止序列通常位于基因序列的3’端。
术语“控制元件”共同指启动子区域、多腺苷化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起始点、内部核糖体进入位点("ires")、增强子、剪接点等，其共同提供受体细胞中的编码序列的复制、转录、转录后加工和翻译。这些控制元件不是必须总是全部存在，只要所选的编码序列能够在合适的宿主细胞中复制、转录和翻译。
如本文使用的术语“ltr”是指存在于前病毒(例如逆转录病毒的整合形式)的每个末端的长末端重复序列。ltr包含多个调节信号，包括转录控制元件、多腺苷化信号和病毒基因组复制和整合所需的序列。病毒ltr被分成三个区域：u3、r和u5。u3区含有增强子和启动子元件。u5区含有多腺苷化信号。r(重复序列)区将u3和u5区间隔开，并且r区的转录序列出现在病毒rna的5’和3’末端。
“荧光蛋白”是指一类包含荧光发色团的蛋白，所述发色团由至少3个氨基酸形成，其特征在于产生对-羟基苯亚甲基-咪唑啉酮发色团的环化反应。发色团不含辅基并且能够发射选择性能量的光，所述能量通过之前的来自外部光源(包括正确的波长)的照射而储存在所述发色团中。自发的荧光蛋白可以是任意结构，具有包含任意数目氨基酸的发色团，条件是该发色团包含如上所述的对-羟基苯亚甲基-咪唑啉酮环结构。sfp通常包括(但不绝对)β-筒结构，例如在绿色荧光蛋白中发现的，其描述见chalfie等人(1994)。
荧光蛋白特异性显示出“荧光特征”，即响应于蛋白吸收的特定波长的入射光而产生较长波长的光的能力。
术语“启动子”在本文中以其通常含义用于指包含dna调节序列的核苷酸区域，其中所述调节序列源自能够结合rna聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列的转录的基因。
“增强子”意思是指这样的核酸序列：当被置于靠近启动子时，赋予比不存在增强子域时从启动子产生的转录活性增强的转录活性。
提及核酸分子时的“可操作地连接”意思是两个或更多个核酸分子(例如要被转录的核酸分子、启动子和增强子元件)以允许核酸分子转录的方式连接。提及肽和/或多肽分子时的“可操作地连接”意思是两个或更多个肽和/或多肽分子以产生单一多肽链即融合多肽(具有融合体的每个肽和/或多肽组分的至少一个性质)的方式连接。融合多肽优选是嵌合的，即由异源分子组成。
术语“细胞”在本文中以其在本领域中最宽的含义使用，是指作为多细胞生物体的组织的结构单元的活体，其由膜结构环绕，所述膜结构将其与外界隔离，其具有自我复制的能力，并且具有遗传信息和用于表达它的机制。如本文使用的“细胞”可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如，融合细胞、遗传修饰的细胞等)。
如本文使用的术语“干细胞”是指能够自我复制和具有多潜能性的细胞。通常而言，干细胞可以使受损的组织再生。本文的干细胞可以是但不限于，胚胎干(es)细胞或组织干细胞(也称作组织特异性干细胞，或成体干细胞)。任何具有上述能力的人工产生的细胞(例如本文使用的融合细胞、重编程细胞等)都可以是干细胞。
“胚胎干(es)细胞”是源自早期胚胎的多潜能干细胞。es细胞首先于1981年建立，从1989年开始，其也被用于产生敲除小鼠。在1998年建立了人es细胞，目前正开始应用于再生医学。
与es细胞不同，组织干细胞具有有限的分化潜力。组织干细胞存在于组织中的特定位置，并且具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多潜能性通常较低。组织干细胞具有较高的核质比并且具有极少的细胞内细胞器。多数组织干细胞具有低的多潜能性、长的细胞周期和超出个体生命的增殖能力。基于细胞所来源的位点例如皮系统、消化系统、骨髓系统、神经系统等，组织干细胞被分成多个类别。皮系统中的组织干细胞包括表皮干细胞、毛囊干细胞等。消化系统中的组织干细胞包括胰腺(普通)干细胞、肝脏干细胞等。骨髓系统中的组织干细胞包括造血干细胞、间质干细胞等。神经系统中的组织干细胞包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
“诱导的多潜能干细胞”通常简写为ips细胞或ipsc，是指通过插入被称作重编程因子的基因以人工方式从非多潜能细胞制备的一类多潜能干细胞，所述非多潜能细胞通常是成年体细胞或末端分化的细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等。
“多潜能性”是指干细胞具有分化成构成一种或多种组织或器官或优选三个胚层中的任意个的所有细胞的潜力：内胚层(胃内层、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。如本文使用的“多潜能干细胞”是指能够分化成源自三个胚层中的任意个的细胞的细胞，例如，全能细胞或诱导的多潜能细胞的后代。
“自我更新”是指经过多个细胞分裂循环但仍保持未分化状态的能力。
如本文使用的术语“体细胞”是指除了生殖细胞例如卵子、精子等之外的任意细胞，其不直接将其dna转移至下一代。通常而言，体细胞具有有限的多潜能性或没有多潜能性。如本文使用的体细胞可以是天然存在的或经遗传修饰的。
iii.诱导的多潜能干细胞的一般背景
在本发明的一些实施方式中，公开了以表达编码报告分子和重编程因子的多顺反子转录本的重编程载体重编程体细胞的方法。例如，可以首先就报告基因的表达来选择这些细胞，以富集转化的细胞；然后就报告基因的沉默来选择其子代以选择诱导的多潜能干细胞。除了这些方法以外，理解胚胎干细胞的特征可以辅助选择诱导的多潜能干细胞。从干细胞重编程研究中获知的重编程因子可用于这些新方法。还考虑到这些诱导的多潜能干细胞可以潜在地用于替换胚胎干细胞以用于治疗性和研究性应用(因为使用后者具有伦理方面的阻碍)。
a.干细胞
多数情况下(如果不是全部)干细胞是发现于多细胞生物体中的细胞。其特征在于通过有丝细胞分裂进行自我更新的能力以及分化为多种特化细胞类型的能力。两种主要类型的哺乳动物干细胞是：发现于胚泡的胚胎干细胞，和发现于成体组织中的成年干细胞。在发育中的胚胎中，干细胞能够分化成所有的特化胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞作为身体的修复系统，补充特化细胞，但也维持再生器官例如血液、皮肤或肠组织的正常周转。
由于干细胞可以通过细胞培养生长并转化为具有与多种组织例如肌肉或神经的细胞一致的特征的特化细胞，所以已经建议其用于医学治疗。尤其是，通过治疗性克隆产生的胚胎细胞系、自体同源胚胎干细胞，以及来自脐带血或骨髓的高度可塑性的成年干细胞被认为是有前景的候选物。最近，成年细胞重编程为诱导的多潜能干细胞已经具有替代胚胎干细胞的巨大潜力。
b.胚胎干细胞
胚胎干细胞系(es细胞系)是源自胚泡或更早的桑葚胚时期的胚胎的内细胞群(icm)的外胚层组织的细胞培养物。胚泡是早期胚胎——在人类中是大约4至5天，由50-150个细胞组成。es细胞是多潜能的，在发育过程中产生三个主要胚层：外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生物。换言之，当给予特定细胞类型的足够和必需的刺激时，它们可以发育为成体的200种以上的细胞类型中的任一种。它们对胚胎外的膜或胎盘没有贡献。
到目前为止，几乎所有的研究都是使用小鼠胚胎干细胞(mes)或人类胚胎干细胞(hes)进行的。二者都具有实质上的干细胞特征，但是它们需要差异极大的环境以维持未分化状态。小鼠es细胞可以生长于明胶层上，并且需要白血病抑制因子(lif)的存在。人es细胞可以生长于小鼠胚胎成纤维细胞(mef)饲养层上，通常需要碱性成纤维细胞生长因子(bfgf或fgf-2)的存在。如果没有最佳培养条件或遗传操作(chambers等人,2003)，胚胎干细胞将迅速分化。
人类胚胎干细胞还可以根据数种转录因子和细胞表面蛋白的存在来确定。转录因子oct-4、nanog和sox2构成核心调节网络，其确保引起分化的基因的阻抑和多潜能性的维持(boyer等人,2005)。最常使用的鉴定hes细胞的细胞表面抗原包括糖脂ssea3和ssea4以及硫酸角质素抗原tra-1-60和tra-1-81。
经过20年的研究之后，没有经批准的使用胚胎干细胞的治疗或人类试验。es细胞是多潜能细胞，其需要特定的信号以进行正确的分化——如果直接注入体内，es细胞将分化成很多不同类型的细胞，引起畸胎瘤。使es细胞分化为可用的细胞并避免移植排斥仅仅是胚胎干细胞研究仍然面临的障碍中的一小部分。很多国家目前禁止es细胞的研究或新的es细胞系的产生。由于胚胎干细胞具有无限扩展和多潜能性的组合能力，胚胎干细胞仍然是损伤或疾病之后的再生医学和组织替换的理论潜在来源。比较而言，解决这些问题的一种方案是通过直接重编程在体细胞中诱导多潜能状态。
c.重编程因子
用于诱导的基因对于ips细胞的产生具有关键意义。以下因子或其组合可用于本发明公开的载体系统中。在一些方面，重编程载体中将包括编码sox和oct(优选oct3/4)的核酸。例如，重编程载体可以包含编码sox2、oct4、nanog和任选的lin-28的表达盒，或编码sox2、oct4、klf4和任选的c-myc的表达盒。编码这些重编程因子的核酸可以包含在同一表达盒中、不同表达盒中、同一重编程载体中，或不同重编程载体中。
oct-3/4和sox基因家族的一些成员(sox1、sox2、sox3和sox15)已经被鉴定为参与诱导过程的关键性转录调节子，其缺失会使诱导不能进行。另一方面，另外的基因，包括klf家族的一些成员(klf1、klf2、klf4和klf5)、myc家族的一些成员(c-myc、l-myc和n-myc)、nanog和lin28已经被鉴定为增强诱导效率。
oct-3/4(pou5f1)是八聚合体(octamer，"oct")家族转录因子之一，在维持多潜能性方面具有关键作用。oct-3/4+细胞例如卵裂球和胚胎干细胞中oct-3/4的缺失会导致自发的滋养层分化，因此oct-3/4的存在产生胚胎干细胞的多潜能性和分化潜力。"oct"家族中的多个其它基因，包括oct-3/4的近亲oct1和oct6，不能引发诱导，因此证明了oct-3/4在诱导过程中的专有性。
与oct-3/4类似，sox基因家族与维持多潜能性相关，虽然其与多能(multipotent)和单能干细胞相关，而oct-3/4与此相反，oct-3/4专有性地在多潜能干细胞中表达。虽然sox2是yamanaka等人(2007)、jaenisch等人(1988)和yu等人(2007)最初使用的用于诱导的基因，但是发现sox家族中的其它基因也在诱导过程中起作用。sox1以类似于sox2的效率产生ips细胞，基因sox3、sox15和sox18也产生ips细胞，虽然效率较低。
在胚胎干细胞中，至少一个oct成员例如oct-3/4和至少一个sox成员例如sox2是促进多潜能性所需的。yamanaka等人(2007)报道：nanog对于诱导不是必需的；但yu等人(2007)报道可以使用nanog作为因子之一来产生ips细胞，并且nanog确实以剂量依赖性方式增强重编程效率。
lin28是一种mrna结合蛋白，其在胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达，与分化和增殖相关。yu等人(2007)证明其是产生ips的一个因子，虽然其不是必需的。
klf基因家族的klf4最初由yamanaka等人鉴定，并由jaenisch等人(1988)确认为用于产生小鼠ips细胞的因子，并由yamanaka等人(2007)证明是用于产生人类ips细胞的因子。然而，thompson等人报道：klf4对于人类ips细胞的产生不是必需的，事实上其不能产生人类ips细胞。发现klf2和klf4是能够产生ips细胞的因子，相关的基因klf1和klf5同样也是，虽然效率较低。
myc基因家族是参与癌症的原癌基因。yamanaka等人和jaenisch等人(1988)证明c-myc是参与产生小鼠ips细胞的因子，yamanaka等人证明其是参与产生人类ips细胞的因子。然而，thomson等人和yamanaka等人(2007)报道c-myc对于产生人类ips细胞不是必需的。将"myc"基因家族用于诱导ips细胞对于ips细胞作为临床治疗的偶然性具有麻烦，因为25％的移植了c-myc诱导的ips细胞的小鼠产生致命性畸胎瘤。n-myc和l-myc已经被鉴定为以类似的效率进行诱导(替代c-myc)。
d.使用重编程因子诱导多潜能干细胞
通常通过将某些干细胞相关的基因转染进入非多潜能细胞例如成体成纤维细胞来衍生ips细胞。在目前的实践中，通常通过整合病毒载体例如逆转录病毒来实现转染。转染的基因包括主转录调节子oct-3/4(pouf51)和sox2，虽然有人提出其它基因增强诱导效率。在关键时期之后，少数的转染细胞开始变成在形态上和生物化学上与多潜能干细胞类似，通常通过形态学选择、加倍时间或通过报告基因和抗生素感染来进行分离。
在2007年11月，来自两个独立研究团队的研究实现了里程碑：从成年人细胞中产生了ips(yu等人,2007；yamanaka等人,2007)。根据之前在小鼠模型中使用的相同原理，yamanaka使用相同的4个关键基因oct3/4、sox2、klf4和c-myc通过逆转录病毒系统(但是c-myc是致瘤性的)成功地将人成纤维细胞转化为多潜能干细胞。thomson及同事使用的是oct4、sox2、nanog和一种不同的基因lin28，使用了慢病毒系统，避免了使用c-myc。
但是，目前的用于产生诱导的多潜能干细胞的方法是缓慢且低效的，多数细胞是失败的。为了改进该方法的效率，在一些方面，本发明的方法和载体使用包含重编程因子和报告分子的多顺反子构建体，以便通过就报告分子的存在进行选择以优化转染效率，随后通过就报告基因表达的不存在进行选择以改善多潜能细胞的选择(因为在多潜能细胞中转基因沉默是非常有效的)。
iv.用于产生诱导的多潜能干细胞的多顺反子系统
在本发明的一些方面，从这种ires依赖性多顺反子系统的灵活性和有效表达促成其优势并使其成为增强产生ips细胞的效率的有用工具。该系统的多种改变包括但不限于(例如见图1)：1)改变所使用的报告分子(例如青色荧光蛋白、红色荧光蛋白等)；2)将报告基因替换为另一个重编程基因，从而需要合成的病毒更少；或3)产生具有两个ires的盒，从而ltr将驱动oct4iressox-2iresegfp的表达。
a.内部核糖体进入位点(ires)
在本发明中包括了ires序列以允许产生多顺反子转录本。这使本发明的表达系统从单一转录单元产生多个重编程因子，或者容易地将报告分子掺入到多顺反子转录本中，而不产生融合蛋白或需要另外的调节元件以控制另外的基因的表达。
多数真核和病毒信使通过涉及识别mrna的5’末端的7-甲基鸟苷帽的机制来启动翻译。但是在少数情况下，翻译通过帽非依赖性机制进行，其中，位于从mrna的帽区翻译而来的基因3’下游的内部核糖体进入位点(ires)被核糖体识别，从而允许翻译来自该转录本的第二编码区。因此，ires元件能够绕过5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型，并且在内部位点启动翻译(pelletierandsonenberg,1988)。
这在本发明中具有特别重要的意义，因为ires序列允许从单一遗传基因座同时表达多个蛋白。ires元件可以与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框可以一起转录，每个被ires间隔开，从而产生多顺反子信使。通过ires元件，核糖体可以靠近每个开放阅读框以进行有效翻译。可以使用单一启动子/增强子转录单一信使，以有效表达多个基因(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，各篇皆通过引用并入本文)。
特别优选的实施方式包括在同一多顺反子转录本中包括编码想要的重组产物和报告分子的编码序列。成功的转化事件由想要的重编程因子和容易检测的报告分子二者的表达指示，这促进了成功转染的细胞的选择。
已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的ires元件(pelletierandsonenberg,1988)，以及来自哺乳动物信使的ires(macejakandsarnow,1991)。一些实例包括来自下列的ires元件：脊髓灰质炎病毒i型、脑心肌炎病毒(emv)的5’utr、泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒(tmev)、口蹄病病毒(fmdv)、牛肠道病毒(bev)、柯萨奇b组病毒(cbv)、或人类鼻病毒(hrv)、或人类免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)5′utr、果蝇触角足基因5′utr或果蝇超双胸5′utr，或上述序列的遗传杂合体或片段。ires序列的描述见kim等人(1992)和mcbratney等人(1993)。
b.报告分子
本发明的一些实施方式使用报告基因以指示成功的转化。例如，报告基因可以位于表达盒内并且在通常与编码重编程基因的编码区结合的调节元件的控制之下，以同时表达。报告分子允许包含重编程载体的细胞被分离而无需将它们置于药物或其它选择性压力下或使细胞具有存活性的风险。另外的好处是以沉默的报告分子表达来富集诱导的多潜能干细胞。
此类报告分子的实例包括编码细胞表面蛋白(例如cd4、ha表位)、荧光蛋白、抗原决定簇和酶(例如β-半乳糖苷酶)的基因。包含载体的细胞可以被分离，例如使用针对细胞表面蛋白的荧光标记的抗体通过facs分离或通过可以被载体编码的酶转化为荧光产物的底物来分离。
在具体的实施方式中，报告基因是荧光蛋白。已经开发了众多荧光蛋白遗传变体，其特征荧光发射光谱几乎跨越整个可见光谱(见表1中的非限制性实例)。在最初的维多利亚水母(aequoreavictoriajellyfish)绿色荧光蛋白中进行的诱变已经产生了新的荧光探针，其颜色范围从蓝色到黄色，它们是生物研究中最常在体内使用的报告分子中的一些。已经从海洋中的海葵(discosomastriata)和珊瑚(属于珊瑚纲)中开发了在橙色和红色光谱区发射的较长波长的荧光蛋白。还开发了其它种类以产生类似的具有青色、绿色、黄色、橙色和深红色荧光发射的蛋白。正在进行开拓性研究努力以改善荧光蛋白的亮度和稳定性，从而改善它们的总体效用。
表1荧光蛋白的特征
v.载体构建和递送
在一些实施方式中，重编程载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，以在细胞中表达这些重编程因子。这些方法的新颖性特征在于使用如上文描述的多顺反子转录本，其促进转化的细胞和诱导的多潜能细胞的选择。以下公开了构建这些载体和递送方法的详细信息。
a.载体
本领域技术人员将完全具备通过标准重组技术构建载体的能力(参见，例如sambrook等人,2001和ausubel等人,1996,二者通过引用并入本文)。载体包括但不限于，质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如yac)，例如逆转录病毒载体(例如源自莫洛尼氏鼠白血病病毒(momlv)、mscv、sffv、mpsv、snv等的载体)、慢病毒载体(例如，源自hiv-1、hiv-2、siv、biv、fiv等的载体)、腺病毒(ad)载体，包括它的有复制能力、无复制能力和裸腺病毒形式，腺相关病毒(aav)载体、猿猴病毒40(sv-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、epstein-barr病毒、疱疹病毒载体、痘病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体。
在一个优选的方式中，载体是病毒载体。特别地，逆转录病毒和慢病毒载体已被成功用于重编程体细胞。病毒载体可以有效地将细胞导入宿主细胞并将其自身dna导入宿主细胞。在产生重组病毒载体时，通常将非必需基因替换为异源(或非天然)蛋白的基因或编码序列。
病毒载体是一类表达构建体，其利用病毒序列以将核酸(也可能将蛋白)导入细胞。某些病毒通过受体介导的细胞内吞作用感染细胞或进入细胞并整合进入宿主细胞基因组并稳定且有效表达病毒基因的能力使其成为将外源核酸转移进入细胞(例如哺乳动物细胞)的优良候选者。以下描述了可用于递送本发明的多顺反子转录本的病毒载体的非限制性实例。
a.逆转录病毒载体
逆转录病毒具有作为基因递送载体的前景是由于它们具有以下能力：将其基因整合进入宿主基因组，转移大量的外源遗传物质，感染多种物种和细胞类型，并且在特殊的细胞系内装配(miller,1992)。
为了构建逆转录病毒载体，将核酸插入病毒基因组中以替换某些病毒序列，从而产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，构建装配细胞系，其包含gag、pol和env基因但不含ltr和装配组分(mann等人,1983)。当包含cdna以及逆转录病毒ltr和装配序列的重组质粒被导入特殊细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀法)，装配序列允许重组质粒的rna转录本被装配进入病毒颗粒，然后其被分泌到培养基中(nicolasandrubenstein,1988；temin,1986；mann等人,1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒能够感染多种类型的细胞。但是，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(paskind等人,1975)。
b.慢病毒载体
慢病毒是复合的逆转录病毒，除了普通的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，还包含具有调节或结构功能的其它基因。慢病毒载体是本领域熟知的(参见，例如naldini等人,1996；zufferey等人,1997；blomer等人,1997；美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒载体能够感染非分裂中的细胞，并且可用于体内和离体基因转移以及核酸序列的表达。例如，在美国专利5,994,136中描述了能够感染非分裂中的细胞的重组慢病毒，其中以携带装配功能基因即gag、pol和env以及rev和tat的两个或更多个载体转染合适的宿主细胞，该文献通过引用并入本文。
b.调节元件
载体还可以包含其它成分或功能性，它们进一步调节基因递送和/或基因表达，或为靶向的细胞提供有益特征。此类其它成分包括例如，影响与细胞的结合或影响靶向细胞的成分(包括调节细胞类型或组织特异性结合的成分)；影响细胞对载体核酸的摄取的成分；影响摄取之后多核苷酸在细胞内的定位的成分(例如调节细胞核定位的试剂)；以及影响多核苷酸表达的成分。
载体中包括的真核细胞表达盒优选包含(以5’至3’的方向)：与蛋白编码序列可操作地连接的真核细胞转录启动子、剪接信号(包括插入序列)以及转录终止/多腺苷化序列。
a.启动子/增强子
“启动子”是控制序列，其为核酸序列的区域，在该区域控制转录的启动和速率。其可以包含可被调节性蛋白和分子例如rna聚合酶和其它转录因子结合的遗传元件，以启动核酸序列的特定转录。词语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在……控制下”和“在……转录控制下”意思是启动子相对于核酸序列而言处于正确的功能位置和/或方向，以控制该序列的转录启动和/或表达。
启动子一般包含这样的序列：其作用是定位rna合成的起始位点。这样的序列的最有名的实例是tata盒，但是一些启动子缺少tata盒，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸基转移酶基因的启动子，以及sv40晚期基因的启动子，起始位点本身之上的离散元件辅助固定起始位置。另外的启动子元件调节转录启动的频率。通常而言，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，虽然已经表明很多启动子也包含位于起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“在启动子的控制之下”，人们将转录阅读框的转录起始位点的5’端置于所选的启动子的下游(即置于其3’端)。处于上游的“启动子”刺激dna的转录并促进所编码的rna的表达。
启动子元件之间的间隔通常是灵活可变的，所以，当元件被倒置或彼此相对发生移动时，能够保持启动子的功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以增至相隔50bp，此后发生活性的下降。取决于启动子，似乎单个元件可以协调发挥作用或独立地激活转录。启动子可以与增强子联用或者不与之联用，增强子是指参与核酸序列的转录激活的顺式调节序列。
启动子可以是与核酸序列天然结合的启动子，其可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列来获得。此类启动子可以被称作“内源性的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然结合的增强子，位于该序列的下游或上游。可替代地，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子(即在其天然环境中通常不与核酸序列结合的启动子)控制下将会产生某些益处。重组或异源增强子是指在其天然环境中通常不与核酸序列结合的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，以及分离自任意其它病毒或原核或真核细胞的启动子或增强子，以及“天然不存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，在构建重组dna时最常使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了通过合成方式产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术来产生序列，包括pcrtm，并联合本文公开的成份(参见美国专利号4,683,202和5,928,906，每篇通过引用并入本文)。此外考虑到，也可以使用非细胞核细胞器例如线粒体、叶绿体等内的指导序列转录和/或表达的控制序列。
通常而言，使用有效指导dna区段在所选的用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中的表达的启动子和/或增强子具有重要意义。分子生物学领域技术人员一般知晓用于蛋白表达的启动子、增强子和细胞类型的组合之使用(参见例如sambrook等人1989，通过引用并入本文)。所使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或可用于在合适条件下指导所导入的dna区段的高水平表达的启动子，这在大规模生产重组蛋白和/或肽中具有优势。启动子可以是异源的或内源的。
另外，任何启动子/增强子组合(按照例如真核细胞启动子数据库epdb,http://www.epd.isb-sib.ch/)也可用于驱动表达。使用t3、t7或sp6细胞质表达系统是另一个可能的实施方式。如果提供合适的细菌聚合酶(作为递送复合物的一部分或作为另外的遗传表达构建体)，真核细胞可以支持从某些细菌启动子进行细胞质转录。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如sv40早期或晚期启动子，细胞巨化病毒(cmv)立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒(rsv)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子(ng,1989,quitsche等人,1989)、gadph启动子(alexander等人,1988,ercolani等人,1988)、金属硫蛋白启动子(karin等人,1989；richards等人,1984)；以及级联应答元件启动子，例如环式amp应答元件启动子(cre)、血清应答元件启动子(sre)、佛波酯启动子(tpa)和最简tata盒附近的应答元件启动子(tre)。还可以使用人类生长激素启动子序列(例如，描述于genbank的人类生长激素最简启动子，登记号x05244的核苷酸283-341)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可以从atcc,cat.no.atcc45007获得)。具体实例可以是磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子。
b.启动信号
编码序列的有效翻译还可能需要特定的启动信号。这些信号包括atg起始密码子或邻近的序列。可能需要提供外源的翻译控制信号，包括atg起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这一点并提供必要的信号。熟知的是起始密码子必须与想要的编码序列的阅读框处于框架内(in-frame)，以确保整个插入子的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过加入合适的转录增强子元件来增强表达效率。
c.多克隆位点
载体可以包括多克隆位点(mcs)，其是包含多个限制性酶位点的核酸区域，所述酶中的任意种可用于根据标准重组技术来消化该载体(参见，例如carbonelli等人,1999,levenson等人,1998,和cocea,1997,通过引用并入本文)。“限制性酶消化”是指以仅在核酸分子的特定位置发挥作用的酶催化性切割核酸分子。很多这样的限制性酶是商业上可以获得的。本领域技术人员普遍理解此类酶的使用。通常，使用在mcs内切割的限制性酶将载体线性化或片段化，以使外源序列连接进入载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可以是彼此连续的或不连续的。涉及限制性酶和连接反应的技术是重组技术领域技术人员熟知的。
d.剪接位点
多数经转录的真核rna分子将经历rna剪接以从初级转录本中除掉内含子。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保转录本的正确加工以表达蛋白(参见，例如chandler等人,1997,通过引用并入本文)。
e.终止信号
本发明的载体或构建体可能需要至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”包含参与通过rna聚合酶特异性终止rna转录本的dna序列。因此，在一些实施方式中涉及结束rna转录本产生的终止信号。终止子可能是体内所必需的以实现想要的信使水平。
在真核系统中，终止子区域还可以包含特定的dna序列，其允许新转录本的位点特异性切割，从而暴露多腺苷化位点。这会向专职的内源聚合酶发出信号，使其将一串大约200个残基a(多聚a)添加到转录本的3’末端。经此多聚a尾巴修饰的rna分子表现得更加稳定并且更有效地被翻译。因此，在其它涉及真核细胞的实施方式中，优选地，终止子包含用于rna切割信号，更优选地，终止子信号促进信使的多聚腺苷化。终止子和/或多聚腺苷化位点元件可用于增强信使水平，并使从盒读入其它序列的读取最小化。
考虑到用于本发明的终止子包括如本文描述的或本领域普通技术人员已知的任意已知的转录终止子，包括但不限于，例如，基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如sv40终止子。在一些实施方式中，终止信号可以是可转录或可翻译序列的缺失，例如由于序列截短所造成的。
f.多腺苷化信号
在表达时，尤其是真核表达时，通常会包括多腺苷化信号以进行转录本的正确的多腺苷化。人们认为多腺苷化信号的性质对于本发明的成功实施不是关键性的，可以使用任意此类序列。优选的实施方式包括sv40多腺苷化信号或牛生长激素多腺苷化信号，它们在多种靶细胞中是方便的且已知它们的作用是很好的。多腺苷化可以增强转录本的稳定性或者可以促进细胞质转运。
c.载体递送
在本发明中，将重编程载体导入体细胞中可以使用任何合适的用于核酸递送以转化细胞的方法，如本文所描述或如本领域普通技术人员已知的。此类方法包括但不限于，dna的直接递送，例如通过离体转染(wilson等人,1989,nabel等人,1989)，通过注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，每篇通过引用并入本文)，包括微注射(harlandandweintraub,1985；美国专利号5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过引用并入本文；tur-kaspa等人,1986；potter等人,1984)；通过磷酸钙沉淀(grahamandvandereb,1973；chenandokayama,1987；rippe等人,1990)；通过使用deae-葡聚糖，然后通过聚乙二醇(gopal,1985)；通过直接的声波载入(sonicloading)(fechheimer等人,1987)；通过脂质体介导的转染(nicolauandsene,1982；fraley等人,1979；nicolau等人,1987；wong等人,1980；kaneda等人,1989；kato等人,1991)和受体介导的转染(wuandwu,1987；wuandwu,1988)；通过微弹轰击(pct申请号wo94/09699和95/06128；美国专利号5,610,042；5,322,783,5,563,055,5,550,318,5,538,877和5,538,880，每篇通过引用并入本文)；通过以碳化硅纤维搅拌(kaeppler等人,1990；美国专利号5,302,523和5,464,765，每篇通过引用并入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利号5,591,616和5,563,055，每篇通过引用并入本文)；通过peg介导的原生质体转化(omirulleh等人,1993；美国专利号4,684,611和4,952,500，每篇通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的dna摄取(potrykus等人,1985)，以及任意此类方法的组合。通过应用诸如此类的技术，可以稳定地或瞬间地转化细胞器、细胞、组织或生物体。
a.脂质体介导的转染
在本发明的一些实施方式中，核酸可以包载在脂复合物例如脂质体中。脂质体是囊泡结构，其特征在于磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。在形成封闭结构并将水和溶解的溶质包载在脂双层之间以前，脂成分会经历自我重排(ghoshandbachhawat,1991)。还考虑到核酸与lipofectamine(gibcobrl)或superfect(qiagen)的复合。所使用的脂质体的量可以根据脂质体的性质以及所使用的细胞而变化，例如，考虑到大约5μg至大约20μg载体dna/1-10x106个细胞。
在体外进行脂质体介导的核酸递送和外源dna的表达已经是非常成功的(nicolauandsene,1982；fraley等人,1979；nicolau等人,1987)。也已经证明了脂质体介导的外源dna递送和在培养的鸡胚胎、hela和肝细胞瘤细胞中表达的可行性(wong等人,1980)。
在本发明的一些实施方式中，脂质体可以与血凝病毒(hvj)复合。已经表明这会促进与细胞膜的融合并促进脂质体包载的dna进入细胞(kaneda等人,1989)。在其它实施方式中，脂质体可以与细胞核非组蛋白染色体蛋白(hmg-1)复合或与之结合使用(kato等人,1991)。在其它实施方式中，脂质体可以与hvj和hmg-1二者复合或与之结合使用。在其它实施方式中，递送介质可以包含配体和脂质体。
b.电穿孔
在本发明的一些实施方式中，通过电穿孔法将核酸导入细胞。电穿孔包括将细胞悬浮液和dna暴露于高压放电。可以通过机械击伤使受体细胞变得更加易于转化。同样，所使用的载体数量可以根据所使用的细胞的性质而变化，例如，考虑到大约5μg至大约20μg载体dna/1-10x106个细胞。
通过电穿孔法转染真核细胞已经是相当成功的做法。已经以人类κ-免疫球蛋白基因转染了小鼠pre-b淋巴细胞(potter等人,1984)，也已经按照这种方式以氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(turkaspa等人,1986)。
c.磷酸钙
在本发明的其它实施方式中，使用磷酸钙沉淀法将核酸导入细胞中。已经使用该技术以腺病毒5dna转染了人类kb细胞(grahamandvandereb,1973)。同样，按照这种方式，已经以新霉素标志物基因转染了小鼠l(a9)、小鼠c127、cho、cv-1、bhk、nih3t3和hela细胞(chenandokayama,1987)，并且以多种标志物基因转染了大鼠肝细胞(rippe等人,1990)。
d.deae-葡聚糖
在其它实施方式中，使用deae-葡聚糖、然后以聚乙二醇将核酸递送进入细胞中。按照这种方式，将报告分子质粒导入了小鼠骨髓瘤和红白血病细胞(gopal,1985)。
e.声波载入
本发明的另外的实施方式包括通过直接声波载入法来导入核酸。已经通过声波载入法以胸苷激酶基因转染了ltk-成纤维细胞(fechheimer等人,1987)。
f.受体介导的转染
另外，可以通过受体介导的递送介质将核酸递送进入靶细胞。这利用了“靶细胞内发生的受体介导的细胞内吞作用选择性摄取大分子”这一优势。鉴于多种受体的细胞类型特异性分布，该递送方法增加了本发明的另外的特异性程度。
一些受体介导的基因靶向囊泡包括细胞受体特异性的配体和核酸结合试剂。其它的包括细胞受体特异性配体，待递送的核酸与之可操作地连接。有数种配体已被用于受体介导的基因转移(wuandwu,1987；wagner等人,1990；perales等人,1994；myers,epo0273085)，其建立起了该技术的可行性。已经描述了另一种哺乳动物细胞类型情况下的特异性递送(wuandwu,1993；通过引用并入本文)。在本发明的一些方面，将配体选择为对应于在靶细胞群体上特异性表达的受体。
在其它实施方式中，细胞特异性核酸靶向囊泡的核酸递送介质成分可以包括与脂质体联合的特异性结合配体。待递送的核酸装在所述脂质体内，并且所述特异性结合配体官能地掺入所述脂质体的膜中。因此脂质体将特异性与靶细胞的受体结合并将内容物递送进入细胞。已经表明此类系统是功能性的，使用了这样的系统：例如，其中表皮生长因子(egf)用于通过受体介导的核酸递送，递送进入显示出egf受体上调的细胞中。
在其它实施方式中，靶向递送介质的核酸递送介质成分可以是脂质体本身，其优选包含一种或多种指导细胞特异性结合的脂或糖蛋白。例如，已经将乳糖酰基神经酰胺，半乳糖末端神经节苷脂，掺入脂质体，并且观察到肝细胞对胰岛素基因摄取的增加(nicolau等人,1987)。考虑到可以按照类似方式将本发明的组织特异性转化构建体特异性递送进入靶细胞中。
g.微弹轰击
微弹轰击技术可用于将核酸导入至少一个细胞器、细胞、组织或生物体(美国专利号5,550,318；美国专利号5,538,880；美国专利号5,610,042；和pct申请wo94/09699；每篇通过引用并入本文)。该方法依赖于将dna包被的微弹加速至高速的能力，以允许它们穿过细胞膜并进入细胞而不杀死细胞(klein等人,1987)。本领域已知有多种微弹轰击技术，其中很多可用于本发明。
在这种微弹轰击方法中，可以使用至少一个核酸包被一个或多个颗粒并通过推进力将其递送进入细胞。已经开发了数种用于加速小颗粒的装置。一种此类装置利用高压放电以产生电流，继而提供驱动力(yang等人,1990)。所使用的微弹由生物惰性物质组成，例如钨或金颗粒或珠子。示例性的颗粒包括那些包含钨、铂和优选金的颗粒。考虑到在一些情况下dna沉淀到金属颗粒上对于通过微弹轰击将dna递送进入受体细胞而言不是必需的。另一方面，也考虑到颗粒可以包含dna而不是被dna包被。dna包被的颗粒可以增强通过颗粒轰击递送的dna的水平，但是就其本身而言不是必需的。
为了进行轰击，将悬浮液中的细胞浓缩于纤维或固体培养基上。可替代地，可以将未成熟的胚胎或其它靶细胞排列于固体培养基上。将待轰击的细胞置于微弹阻停板下合适的距离。
vi.ips细胞的选择
在本发明的一些方面，在将重编程载体导入体细胞之后，培养这些细胞以进行扩展。可以就载体元件例如报告分子或选择标志物的存在来选择细胞，以浓缩经转染的细胞。重编程载体将在这些细胞中表达重编程因子，并随着细胞分裂而复制和分割。这些被表达的重编程因子将会重编程体细胞基因组，以建立自我持续的多潜能状态，同时或在除掉存在的载体的阳性选择之后，外源遗传元件将逐渐丧失。转基因表达的沉默允许仅就报告基因表达的关闭来选择诱导的多潜能干细胞，或与就其它胚胎干细胞特征进行的选择联合来选择诱导的多潜能干细胞，因为预期它们与多潜能胚胎干细胞是基本上相同的。
a.就报告基因表达进行选择
导入了本发明的重编程载体的细胞可以同时表达报告分子和重编程因子，并且可以在不同的时间点就报告基因表达的存在或不存在来进行选择。例如，可以就报告分子的存在来选择细胞，并且可以通过使用报告分子优化转染。可以就报告分子的丧失来筛选诱导的多潜能干细胞，因为在重编程过程中转基因会被沉默。此类选择或筛选是基于由报告基因的表达产生的可检测信号，其作为转基因表达的指示。
可以通过多种方式中的任一种来产生可检测信号，这取决于本发明的方法中所使用的报告基因的性质。例如，可检测信号可以是发光，例如荧光信号，例如gfp。gfp是一种荧光多肽，其产生荧光信号而无需底物或辅因子。gfp的表达和检测技术是本领域熟知的，可以从商业上获得试剂盒，例如从clontech获得。可以在完整细胞中测定gfp的表达，无需将其裂解或添加另外的试剂。或者，所述可检测信号可以是由酶活性或细胞表面标志物例如lngfr的识别而产生的信号。
流式细胞术，例如，荧光激活的细胞分选(facs)被普遍用于基于报告基因的表达来选择可检测信号。facs提供了将细胞的异质混合物分选进入两个或更多个容器的方法，每次分选一个细胞，其基于每个细胞的特定光散射和荧光特征。这提供了从单个细胞中发出的荧光信号的快速的、客观的和定量的记录，并提供了诱导的多潜能细胞的物理分离。
萤光素酶也可用作测定的基础。萤光素酶的表达是本领域已知的，萤光素酶的表达和检测试剂盒可以从clontech(paloalto,calif.)通过商业渠道获得。有利地，在通过闪烁计数器监视发光信号之前，将细胞裂解并向细胞中加入萤光素底物，以测定萤光素酶的存在。
基于酶的测定法的执行方式与基于萤光素酶的测定法类似，不同之处在于检测不一定是通过发光进行。检测技术将取决于酶，因此可以是目测(例如在β-半乳糖苷酶的情况下)。
物理和生物化学方法也可用于鉴定或定量本发明的报告基因的表达。这些方法包括但不限于：1)southern分析或pcr扩增，以检测并确定重组dna插入子的结构；2)northern印迹、s-1rnase保护、引物延伸或逆转录酶-pcr扩增，以检测并检查基因构建体的rna转录本；3)酶测定法，以检测酶活性(当此类基因产物由基因构建体编码时)；4)蛋白凝胶电泳、western印迹技术、免疫沉淀或酶联免疫测定(当基因构建体产物是蛋白时)；和5)由于所导入的基因构建体的表达而产生的化合物的生物化学测定。另外的技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色也可用于检测特定细胞中报告基因的存在或表达。
b.就胚胎干细胞特征进行选择
之前的研究中成功产生的ipsc在以下方面与天然分离的多潜能干细胞(例如小鼠和人胚胎干细胞，分别是mesc和hesc)是显著相似的，由此确认了ipsc相对于天然分离的多潜能干细胞的性质、真实性和多潜能性。因此，除了报告基因表达的存在或不存在以外，可以基于下列一个或多个胚胎干细胞特征来选择根据本发明公开的方法产生的诱导的多潜能干细胞。
a.细胞生物学特征
形态学：ipsc在形态上类似于esc。每个细胞可以具有圆形、大的核仁并缺乏细胞质。ipsc的群落也可以与esc类似。人类ipsc形成具有明显边界的、平坦的、紧密聚集的群落，这与hesc类似；小鼠ipsc形成与mesc类似的群落，不如hesc的群落平坦，比hesc的群落聚集度更高。
生长特征：加倍时间和有丝分裂活性是esc的要素，因为干细胞必须自我更新(作为其定义的一部分)。ipsc在有丝分裂活性、自我更新活性、增殖和分裂速率方面可以与esc相同。
干细胞标志物：ipsc可以表达在esc上表达的细胞表面抗原性标志物。人类ipsc表达hesc特异性的标志物，包括但不限于ssea-3、ssea-4、tra-1-60、tra-1-81、tra-2-49/6e和nanog。小鼠ipsc表达ssea-1但不表达ssea-3也不表达ssea-4，这与mescs是类似的。
干细胞基因：ipsc可以表达在未分化的esc中表达的基因，包括oct-3/4、sox2、nanog、gdf3、rex1、fgf4、esg1、dppa2、dppa4和htert。
端粒酶活性：端粒酶是维持细胞分裂不受hayflick极限(～50次细胞分裂)限制所必需的。hesc表达高端粒酶活性，以维持自我更新和增殖，ipsc也显示出高端粒酶活性并表达htert(人端粒酶逆转录酶)，其为端粒酶蛋白复合物中的必要成分。
多潜能性：ipsc将能够以类似于esc的方式分化为完全分化的组织。
神经的分化：ipsc可以分化成神经元，表达βiii-微管蛋白、酪氨酸羟化酶、aadc、dat、chat、lmx1b和map2。儿茶酚胺相关的酶的存在可以指示ipsc(类似于hesc)可以分化成为多巴胺能神经元。在分化之后，干细胞相关的基因将会被下调。
心脏的分化：ipsc可以分化为心肌细胞，其自发开始跳动。心肌细胞表达tntc、mef2c、myl2a、myhcβ和nkx2.5。在分化之后，干细胞相关的基因将会被下调。
畸胎瘤形成：注射进入免疫缺陷型小鼠的ipsc可能在一定时间之后(例如9周)自发形成畸胎瘤。畸胎瘤是含有源自三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层的组织的多谱系肿瘤；这与其它肿瘤不同，其它肿瘤通常仅是一种细胞类型。畸胎瘤的形成是多潜能性的标志测定。
胚状体：培养中的hesc自发形成球状胚胎样结构，其被称作“胚状体”，其由具有有丝分裂活性的和分化中的hesc的核心和来自所有三个胚层的完全分化的细胞的外围组成。ipsc也可能形成胚状体并具有外周分化的细胞。
胚泡注射：hesc天然地驻留于胚泡的内细胞群(成胚区)内，在成胚区中分化为胚胎；而胚泡的壳(滋养层)分化为胚胎外的组织。中空的滋养层不能形成活的胚胎，因此，成胚区中的胚胎干细胞必须分化并形成胚胎。通过微量吸液将ipsc注射进入滋养层以产生被转移进入雌性受体的胚泡，这可能导致产生嵌合的活的小鼠幼崽：具有10％-90％的嵌合性，遍布其身体掺入了ipsc衍生物的小鼠。
b.表观遗传学的重编程
启动子去甲基化：甲基化是甲基被转移至dna碱基，通常是甲基被转移至cpg位点(邻近的胞嘧啶/鸟嘌呤序列)中的胞嘧啶分子。基因的广泛甲基化会通过抑制表达蛋白的活性或募集干扰表达的酶而对表达产生干扰。因此，基因的甲基化会通过阻止转录而有效地使其沉默。内源的多潜能性相关的基因(包括oct-3/4、rex1和nanog)的启动子可能在ipsc中被去甲基化，显示出其启动子活性以及多潜能性相关的基因在ipsc中的活性启动和表达。
组蛋白去甲基化：组蛋白是在结构上定位于dna序列的紧凑的蛋白，其可以通过多种染色质相关的修饰发挥其活性。与oct-3/4、sox2和nanog相关的h3组蛋白可以被去甲基化以激活oct-3/4、sox2和nanog的表达。
vii.培养ips细胞
使用所公开的方法将重编程载体导入体细胞之后，可以将这些细胞在足以维持多潜能性的培养基中培养。可以使用为了培养灵长类多潜能干细胞(更具体而言胚胎干细胞)而开发的多种培养基和技术来培养本发明中产生的诱导的多潜能干(ips)细胞，如美国专利申请20070238170和美国专利申请20030211603中所描述。
例如，与人类胚胎干(hes)细胞一样，可以将ips细胞维持在以下培养基中：80％dmem(gibco#10829-018或#11965-092),20％未经热灭活的确定的胎牛血清(fbs),1％非必需氨基酸,1mml-谷氨酰胺和0.1mmβ-巯基乙醇。或者，可以将es细胞维持在以下无血清培养基中：80％knock-outdmem(gibco#10829-018),20％血清替代物(gibco#10828-028),1％非必需氨基酸,1mml-谷氨酰胺和0.1mmβ-巯基乙醇。在临使用前，加入人bfgf至终浓度为大约4ng/ml(wo99/20741)。
与es细胞一样，ips细胞具有可以通过免疫组化或流式细胞术鉴定的特征性抗原，使用针对ssea-1、ssea-3和ssea-4的抗体(developmentalstudieshybridomabank,nationalinstituteofchildhealthandhumandevelopment,bethesdamd.)，以及针对tra-1-60和tra-1-81的抗体(andrews等人,1987)。可以通过将大约0.5-10x106个细胞注射进入8-12周龄的雄性scid小鼠的后腿肌肉中来确认胚胎干细胞的多潜能性。产生畸胎瘤证明三个胚层中的每一个的至少一种细胞类型。
viii.实施例
包括了以下实施例以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应该认识到，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在实施本发明时效果良好的技术，因此可以被认为是构成其实施的优选模式。但是，根据本公开文本，本领域技术人员应该认识到，可以不脱离本发明的精神和范围而对所公开的具体实施方式作出很多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。
实施例1-逆转录病毒载体的构建
之前在kennedy等人(2003)中已经报道了用于导入重编程基因和选择标志物的亲本逆转录载体。简而言之，最简载体包含5’和3’mmlv长末端重复区(ltr)，其中5’ltr包含用于驱动重编程和选择所需的基因之表达的启动子(图1)。便利地，在5’ltr的紧邻上游还存在细胞巨化病毒启动子，从而逆转录病毒质粒可用于瞬间转染，而当该质粒被用作病毒合成的模板时，其保持无功能状态。
如图1所示，将sox-2、nanog、oct4和lin28各自导入基于mmlv的逆转录病毒骨架，所述骨架还编码荧光蛋白。sox-2和oct4均被置于编码增强型绿色荧光蛋白(egfp)的逆转录病毒骨架；而nanog和lin28被置于能够表达单体红色荧光蛋白(mrfp)的骨架。编码重编程基因的转录本的翻译在规范的atg起始密码子处起始；而下游荧光蛋白通过源自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(ires)被翻译。
实施例2-使用逆转录病毒载体产生病毒
按照以下方式使用逆转录病毒载体来产生病毒。首先，以单独转染方式制备编码sox-2、oct4、nanog或lin-28的4种逆转病毒载体中的每一种。将10μg每种逆转录病毒载体各自与编码水疱性口炎病毒-假糖蛋白(1μg)、gag聚合酶(3ug)和nfkb(1ug)的dna混合。然后将dna与500uloptimem混合。单独将40μl聚乙烯亚胺(1mg/ml)与500μloptimem混合。然后将dna/optimem混合物、pei/optimem混合物置于室温，温育5分钟，然后混合在一起以产生大约1ml的溶液，将该溶液在室温温育至少20分钟。
本发明人转染的是过表达sv40t-抗原蛋白的293细胞，在转染前一天稀释所述细胞，使所述细胞在转染当天达到大约80％的汇合度。在转染当天，使用1xpbs清洗细胞，然后加入4mloptimem或dmem(不含血清和抗生素)。一旦在20分钟的温育期内形成亲脂复合物，则向细胞中逐滴加入dna复合物(1ml)。在37℃以dmem,10％胎牛或小牛血清和50mmhepes缓冲盐水温育4小时之后，更换培养基。转染48小时之后，通过从转染的平板中收集5ml培养基来收获病毒。然后在1000rpm将含有病毒的培养基离心5分钟，以除掉细胞碎片，然后通过45um的针筒过滤器过滤该培养基。
实施例3-细胞的感染和铺板
通过以下两种方法中的一种进行感染和转变至允许发生重编程的环境的程序。一种方法包括感染并将感染的和未感染的细胞铺入经辐射的mef以进行重编程；另一种方法包括通过分选，仅将经感染的细胞铺入mef，以此来增强重编程的效率。
方法1：以表达重编程基因的病毒感染的未经分选的imr-90细胞进行重编程
imr-90细胞已被成功用作感染的受体宿主，但是该程序适用于其它细胞类型例如原代皮肤细胞和造血细胞的感染。在感染前72小时，将大约50,000个imr-90细胞种入6孔板的每个孔中。准备另外的细胞平板，用于测定每种病毒的感染效率。例如，使一个孔中的细胞接受单一病毒而非接受多个病毒。以1至10的感染复数(multiplicityofinfection,moi)，使用从转染的293t细胞新鲜收获的病毒进行感染。moi的范围是由于用于产生病毒的转染与转染之间的内在差异造成的。
转染在6孔板中进行：首先除掉培养基并更换为等体积的4种病毒中的每一种，终浓度为大约5x104至1x105个细胞/毫升培养基(即每种病毒为500μl，总体积为2ml)。细胞保持粘附，将其置于4℃摇床，持续2个小时；然后置于37℃和5％co2中。或者，可以立即将细胞置于温育箱中，对感染效率无明显影响。感染日定为时间点0，其后每一天为“感染后”。然后将感染的细胞温育48小时，然后使用0.2至0.5ml0.05％胰蛋白酶-edta收获来自6孔板的每个孔的经全部4种病毒感染的细胞。收集细胞、汇集并以含有10％fbs的最简必需培养基(m10f)定容至10-15ml。然后在1000rpm离心5分钟，除掉上清液，将细胞重悬于10ml不含抗生素的m10f，并置于经辐射的单层的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)的上面。
以大约7.5x104个细胞/ml的密度将mef铺板于在添加经感染的imr-90细胞之前3天以0.1％的明胶包被的10cm平板。在mef铺板后的那一天，除掉培养基并更换为不含fgf的人es(hes)培养基(80％dmem-f12；20％敲除血清替代物(knock-outserumreplacer)；1％非必需氨基酸；1mml-谷氨酰胺；0.1mmb-巯基乙醇)。在铺板后第3天，以1xpbs(不含ca和mg)将mef清洗一次，将重悬于10mlm10f的经感染的imr-90细胞置于mef上面。过夜温育允许imr-90细胞粘附，将培养基更换为10ml含有100ng/ml斑马鱼fgf的条件化培养基(cm)(表示感染后3天)。cm是这样制备的：将hes培养基在高密度经辐射的mef基底上温育过夜，收集并补充100ng/mlzfgf。然后通过将消耗的培养基更换为10ml新鲜的含有zfgf的cm来每日饲养经感染的imr-90细胞。
方法2：以表达重编程基因的病毒感染的经分选的imr-90细胞进行重编程
按照方法1中的描述进行感染，区别在于：在感染前，将5x104个imr-90细胞/孔接种于2个完整的6孔板。经感染的细胞的更大的汇集物会促进分选并增强分选后的存活性。为了为分选作准备，在感染后3天按照方法1中的描述通过胰蛋白酶收获所有的孔中包含的imr-90细胞并汇集在一起。过滤汇集的细胞以除掉聚块，置于冰上直至分选。
使用facsdiva(压力为25psi，具有能测量10微米的尖端大小)将经选择的细胞分选进入含有m20f/50mmhepes缓冲液的15ml锥型管中。分选是基于低水平至中等水平的egfp，其与oct4和sox-2的表达水平相关，以及基于低水平至中等水平的mrfp，其与nanog和lin28的表达水平相关。本发明人还在不存在lin28的情况下进行了该实验，其中表达不同水平的nanog的细胞可以被特异性分选出来。重编程效率与数量渐增的nanog相关联，因此，表达中等水平至高水平的nanog的细胞(由mrfp强度反映)被分选。
根据如facs所测的对于egfp或mrfp呈阳性的细胞分数，平均来讲，大约有85％的imr-90细胞被每种病毒感染；收集了大约3x104至2x105个细胞。在分选过程中细胞保持在冰上并受冷，直至铺板。同一天，使用m10f将细胞定容至总体积为10ml，然后置于单层的经辐射的在1至6天前铺板的mef上(大约7.5x104个细胞/毫升)。将细胞在m10f(不含抗生素)中的mef上再培养3天，以允许分选后的恢复和附着。(按照方法1中的描述制备mef)。在感染后6天，使用补充了100ng/ml斑马鱼fgf的10mlcm替换m10f，并且每日进行更换直至形成重编程的群落。
实施例4-重编程的细胞的选择
首先通过形态学以及egfp和mrfp表达的丧失来鉴定重编程的细胞。群落包含高度紧凑的细胞，其具有扩大的细胞核和多个核仁。目前，本发明人挑选了感染后20至40天时间范围内的群落。通过手工挑取群落并转移至含有经辐射的mef的孔(48、24至6个孔)中(7.5x104个细胞/毫升)。转移后那天不对其进行饲养，然后开始每天以cm进行饲养，直至群落数目扩大至足以进行分离和冷冻。使用细胞表面标志物(即ssea3、ssea4、tra-1-60、ssea1和oct4)进一步表征ips克隆并进行核型分析，以鉴定染色体内的任何异常。
根据本公开文本，无需过量实验即可实现并执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经以优选实施方式的形式描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员明显的是，可以不脱离本发明的概念、精神和范围而对如本文描述的方法、方法的步骤或步骤的次序进行改变。更具体而言，明显的是，某些化学和生理学上均相关的试剂可以替换如本文描述的试剂，但仍然获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有的此类相似的替换和修饰都被认为是在如随附的权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
参考文献
通过引用的方式将以下参考文献特别并入本文，达到它们提供示例性的程序上的或其它的细节以补充本文所示的那些内容的程度。
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