本发明涉及一种快速检测细胞内次氯酸的荧光探针的制备方法，属于分析化学技术领域。
背景技术：
次氯酸(hclo)作为生物体内的一种活性氧，对于生物体具有十分重要的意义。日常生活中次氯酸(一般是其钠盐)被广泛用作漂白剂、除臭剂和消毒剂。在生物细胞(如嗜中性白细胞)中，次氯酸由过氧化氢和氯离子在髓过氧化物酶(mpo)的催化作用下产生。作为一种重要的活性氧物种，次氯酸在维持细胞内的氧化还原平衡状态起着非常重要的作用，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常,就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病。因此，能够及时有效的检测生物体内及环境中次氯酸浓度的变化已经成为了一项新的重大的课题。与传统检测手段相比，有机小分子荧光探针检测方法由于其具有高灵敏度、高选择性、重现性好、仪器操作简单、生物相容性好、能够实现原位检测等一系列优点受到环境监测、生命科学及疾病诊断等各领域科研工作者的广泛关注。
基于hclo在生理、病理过程的重要作用，发展高性能的hclo荧光探针，为疾病的发病机制、诊断及干预的研究提供可靠信息，具有重要意义。然而目前现有的次氯酸探针在生物体内的选择专一性不是很好，本专利通过分子设计，合成了具有响应速度快，选择性好，灵敏度高的次氯酸荧光探针，并且该探针可用于检测细胞内的次氯酸。
技术实现要素：
针对目前次氯酸分子荧光探针检测所面临的问题的现状，本发明通过分子设计，合成出一种具有响应时间快以及荧光增强型双光子性质的次氯酸荧光探针。
本发明还提供了上述荧光增强型双光子次氯酸荧光探针的制备方法。
本发明采用以下技术方案：
一种荧光增强型双光子次氯酸荧光探针，探针分子的分子式为：c16h17no3s，结构式如下所示：
上述次氯酸荧光探针的合成路线如下：
一种荧光增强型双光子次氯酸荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：
1)将2.0eq的2-羟基水杨醛与3.0eq的2-环己烯-1-酮，5.0eq的三乙烯二胺溶于1,4-二氧六环/水＝1的溶液中，氮气保护，100℃加热回流，反应40h，用tlc板检测反应，反应完全后，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，并用硅胶柱进行分离，可得到化合物1；其中化合物1的结构式如下所示：
2)将1.0eq的化合物1，4.0eq的二甲氨基硫代甲酰氯与100μldiea溶于干燥的二氯甲烷中，氮气保护，常温反应10h，用tlc板检测反应，反应完全后，水洗，无水硫酸钠干燥，旋干，并用硅胶柱进行分离，可以得到目标探针化合物，简记为tp-ha。
所述步骤1)中硅胶柱分离所用洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1:6。
所述步骤2)中硅胶柱分离所用洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1:10。
本发明的荧光增强型双光子次氯酸荧光探针的用途：该荧光探针可以应用于水环境和生物细胞体系中内源性次氯酸的含量检测；所述的检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。
本发明的优点：(1)探针的合成路线简单，只需要两步就可以完成，且后处理过程相对简单；(2)本发明实现了hclo分子的快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强。(3)该探针灵敏度高，颜色变化显著，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，紫外灯照射下也可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。(4)水溶性好，该试剂可作为显示水溶液中次氯酸分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种简单快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。其性能将在实施例中结合附图予以详细说明。
附图说明
图1是实施例一中探针tp-ha的1hnmr图谱。
图2是探针tp-ha(10μmol/l)随次氯酸的加入荧光谱图的变化情况(溶剂：pbs；λex＝360nm)。
图3是探针tp-ha(10μmol/l)对不同离子和分子的选择性荧光谱图(溶剂：pbs；λex＝360nm)。
图4是探针tp-ha对不同离子和分子的选择性柱状图数据(溶剂：pbs；hclo浓度：10μm,其他：400μm；λex＝360nm)。
图5是探针tp-ha的pbs溶液(10μmol/l)溶液在次氯酸(20μmol/l)加入前后溶液颜色的变化。
图6是探针tp-ha的pbs溶液(10μmol/l)溶液在次氯酸(20μmol/l)加入前后紫外灯照射下溶液荧光颜色的变化。
图7是探针tp-ha应用于细胞中对外源性次氯酸进行荧光成像图。
图8是探针tp-ha应用于小鼠肝脏组织的对外源性次氯酸进行双光子断层扫描成像图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对于上述方案中化合物的号码。
实施例1
化合物1的合成：
2-羟基水杨醛(2.76g，20mmol，2.0eq)，2-环己烯-1-酮(2.88mg，30mmol，3.0eq)与三乙烯二胺(dabco5.6g，50mmol，5.0eq)溶于1,4-二氧六环/水＝1的溶液中，氮气保护，100℃加热回流，反应40h。用tlc板检测反应，反应完全后，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚＝1:6，产率为12％。
化合物tp-ha的合成：
化合物1(108mg，0.5mmol，1.0eq)，二甲氨基硫代甲酰氯(250mg，2.0mmol,4.0eq)与diea(100μl，3.0eq)溶于3ml干燥的二氯甲烷中，氮气保护，常温反应10h，用tlc板检测反应，反应完全后，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚＝1:10，产率为43％。其核磁谱图如(图1)所示。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.58–7.34(m,1h),7.31–7.18(m,1h),6.70(d,j＝7.6hz,1h),6.64(s,1h),4.95(d,j＝93.3hz,1h),3.40(d,j＝48.2hz,6h),2.54–2.31(m,2h),2.02(dd,j＝30.3,18.3hz,2h),1.87–1.33(m,2h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ197.36(s),186.93(s),156.54(s),156.46(s),130.91(s),130.08(s),129.79(s),119.98(s),116.87(s),111.09(s),74.80(s),43.28(s),38.81(d,j＝4.5hz),29.63(s),17.97(s).
实施例2
化合物tp-ha次氯酸荧光探针随次氯酸加入当量的增加荧光谱图的变化
取实施例1制备的tp-ha次氯酸荧光探针溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，制成1mmol/l储备液。从储备液中取出30μl加入到5ml的离心管当中，加入不同当量(0-3.3eq)的次氯酸标准溶液后，用pbs缓冲溶液(0.1mol/l，ph＝7.5)稀释至3ml，测量其荧光性质。荧光光谱如图2所示。由图2可见，随着次氯酸加入当量的增加荧光逐渐增强。
实施例3
化合物tp-ha次氯酸荧光探针对不同分子或离子的选择性
从实施例2中荧光探针储备液中取出30μl加入到5ml的离心管当中，分别加入40倍摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入1倍摩尔量的次氯酸标准溶液，30min后检测溶液的荧光发射光谱变化，由图3和图4可以发现，其他金属离子对化合物tp-ha的荧光几乎没有影响，而次氯酸溶液的加入使化合物tp-ha的荧光显著增强。
实施例4
化合物tp-ha荧光探针对次氯酸的可视化检测
从实施例2中荧光探针储备液中取出30μl加入到5ml的样品管当中，加入2倍摩尔量的次氯酸标准溶液如图5所示，次氯酸可以使化合物tp-ha荧光探针的pbs缓冲溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从无色变成淡绿色。伴随着紫外灯下肉眼可视的次氯酸诱导荧光探针发出明亮的绿色荧光(图6)，说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。
实施例5
化合物tp-ha次氯酸荧光探针对细胞外源性次氯酸荧光成像
我们将本发明探针应用于hela细胞中对外源性的次氯酸进行荧光成像应用(图7)具体操作步骤：将10μmtp-ha次氯酸探针的dmf溶液加入到育有hela细胞的培养液中，在二氧化碳培养箱中培养30min后用共聚焦显微镜进行成像。首先进行明场成像(图7a)，可以看到细胞大致的轮廓(图7b)。然后用488nm的光进行激发观察，在未加入次氯酸前的荧光成像情况，此时观察不到荧光发射。将明场图7a和荧光成像图7b进行叠加得到图7c。向体系中加入10μm的次氯酸钠水溶液(2ml)后，孵育5min后再用488nm的光进行激发，可以观察明场成像图(7d)和绿通道的荧光成像图(图7e)，此时可以观察到有明亮的荧光在绿通道发出，将明场图与绿通道荧光成像图进行叠加可以得到图7f。由此可以说明荧光探针tp-ha可以对外源性的次氯酸进行细胞内荧光成像。
实施例6
化合物tp-ha次氯酸荧光探针对小鼠肝脏组织内的外源性次氯酸的双光子断层扫描荧光成像
我们将本发明探针应用于小鼠肝脏组织中对外源性的次氯酸进行双光子荧光成像应用(图8)具体操作步骤：将小鼠肝脏组织切成400μm厚的的组织切片，将切片用10μmtp-ha探针的pbs溶液进行培养30min，用pbs溶液洗涤三次后，将切片在20μm的次氯酸钠水溶液中孵育5min。用双光子共聚焦显微镜进行组织的断层扫描。可以发现在10-100μm区间内有明亮的蓝光发出，说明探针可以应用于组织中对外源性次氯酸进行双光子荧光成像。