一种特异性抑制KCTD1基因表达的shRNA及应用的制作方法

本发明涉及到一种短发夹rna（kctd1shrna）的设计、合成、构建和应用。具体而言，本发明人对人kctd1基因（potassiumchanneltetramerizationdomaincontaining1)的核苷酸序列设计合成shrna,所述shrna构建到慢病毒载体后抑制所述细胞中kctd1基因的表达，并且对产热基因ucp1表达有明显的促进作用。

背景技术：

随着经济发展，人民生活水平的提高，全球肥胖人群比例迅速增加，肥胖患者超过6亿，中国肥胖率高达12%，这严重增加了血脂代谢、糖尿病、肾脏疾病、心血管疾病和癌症的危险性。如何提高新陈代谢效率，找到加速新陈代谢的关键基因，开发治疗肥胖和糖尿病的新方法是当下刻不容缓的迫切任务。

成人体内有三种脂肪组织：棕色脂肪（bat）、白色脂肪(wat)和米色脂肪(beigefat)。bat是哺乳动物体内非颤栗产热的主要来源。棕色脂肪功能的激活会导致能量消耗增加，抑制肥胖，同时也会降低血浆中的葡萄糖和脂质水平，促进机体能量平衡。而位于bat线粒体内膜的解偶联蛋白（ucp）是决定bat功能的关键因素。线粒体内膜的ucp作为质子通道驱散氧化呼吸时形成的h⁺梯度，从而增加呼吸，阻止atp形成，促进产热和能量消耗。白色脂肪细胞主要是将多余的能量以甘油三酯的形式贮存起来，在机体能量缺乏时将其分解产生能量。而米色脂肪则有白色和棕色脂肪的双重特点。在基础状态下，米色脂肪细胞与白色脂肪细胞相似，为单房脂肪细胞；在寒冷刺激下，米色脂肪细胞与棕色脂肪细胞接近，可转变为多房小脂滴的脂肪细胞，并且表达ucp1促进产热。这样米色脂肪即白色脂肪棕色化，具有棕色脂肪相似的产热功能,促进能量消耗（cell,2012,151:400–413）。关键的差别在于棕色脂肪细胞表达高水平的ucp1，它是线粒体燃烧能量生成热量所必需的蛋白。而米色细胞正常表达低水平的ucp1，在对寒冷或某些激素反应时米色细胞会开启高水平的ucp1，使得米色脂肪几乎和棕色脂肪一样有效燃烧能量（cell,2012,150:366–376）。但是ucp1的基因调控十分复杂，既有pparα单独作用于其调控区域（jbc,2001,276,1486-1893），又有pgc-1α和irf4协同作用于ucp1（cell,2014,158,69-83），更多的研究仍需进一步阐明ucp1的产热机制，从而有效地促进能量以热能的形式释放。

kctd1是发明人通过酵母双杂交系统筛选人脑cdna文库识别的转录因子ap-2α结合的新btb/poz蛋白。我们发现细胞核蛋白kctd1具有转录抑制活性（dnaandcellbiology,2008,27:257-265）。进一步证明kctd1与ap-2α在细胞核中发生直接的作用，显著地抑制了ap-2家族的转录激活，提示kctd1是转录因子ap-2的负调节因子（jcellbiochem,2009,106，285-295），也是各类肿瘤中关键wnt/β-catenin信号通路的抑制蛋白(plosone,2014,9:e94343)。但是kctd1在脂肪分化、能量代谢领域中的作用至今没有涉及，也未见kctd1对产热基因ucp1的调控的相关报道。我们近期的研究发现kctd1在内脏白色脂肪组织（ewat）中高表达，明显地抑制产热基因ucp1的转录，kctd1和ucp1在各类脂肪组织中的表达存在明显的负相关性，而且kctd1的干扰促进了产热基因ucp1的表达，这提示kctd1的过表达可能与肥胖表型正相关，是减少体重抑制肥胖的一个新靶点。

近年来，shrna表达系统在疾病治疗中发挥了强大的功能，shrna表达载体转染细胞，在细胞内转录生成shrna，利用细胞内的dicer酶生成相应的sirna，发挥rnai作用。shrna慢病毒系统已经广泛应用到人类肿瘤的治疗（biotechj,2011,6,1130–1146）。如嵌和抗原受体t细胞(cart)的免疫疗法采用候选产品ctl019治疗急性淋巴性白血病的复发性或难治性患者，一次治疗能让近80%的患者完全缓解，该技术就是采用了临床级lentivector（慢病毒载体）基因递送系统(nengljmed,2014,371,1507-1517)。因此，以shrna慢病毒系统特异性干扰kctd1基因的表达，从而可以降低kctd1在ewat中的表达，促进ucp1的表达和新陈代谢效率，抑制肥胖。那么，这一发现有助于开发以kctd1为靶标的治疗肥胖和糖尿病等内分泌疾病的新方法。

技术实现要素：

本发明是提供了一种特异性抑制kctd1基因表达的shrna，以及其在促进脂肪代谢能量消耗中的应用。

本发明提供了一种用于敲低kctd1基因的shrna序列，所述的核苷酸序列包含以下序列：

seqno.1正义链5'-gatccgcgtcccagttcagcgaatatcaagagtattcgctgaactgggacgttttttggaatt-3';

seqno.2反义链5'-aattccaaaaaacgtcccagttcagcgaatactcttgatattcgctgaactgggacgcggatc-3'。

本发明以rnai技术为基础，根据靶序列选择和shrna设计的基本原则，针对kctd1基因设计了发夹茎环结构。本发明中所使用的shrna由本发明人自己设计和构建到慢病毒载体。优选地，所述的构建物为慢病毒载体。

本发明所述kctd1在白色脂肪组织中高度表达，在棕色脂肪组织中低表达。

本发明提供的kctd1shrna可以特异性抑制kctd1基因的表达。

本发明提供了kctd1有效地抑制了产热基因ucp1启动子的转录活性。

本发明所述的kctd1shrna促进产热基因ucp1的转录从而达到抑制肥胖的发生和发展。

本发明提供了一种全新靶点以抵抗肥胖，提出了所述的shrna、所述的构建物在制备治疗肥胖症的药物中应用。

本发明提供了所述的shrna、所述的构建物在制备促进脂肪燃烧和能量平衡的药物中的应用。

本发明的一种具体实施方式，所述的产热基因是ucp1。

本发明还提供了所述的shrna、权利要求2所述的构建物在非治疗目的的促进脂肪燃烧和能量平衡中的应用。

本发明的优点在于：

1、本发明针对kctd1设计了合适的shrna序列，并构建了包含上述双链序列的慢病毒载体。通过效果验证证明发明的shrna以及表达shrna的构建物能够显著降低kctd1的蛋白表达量，敲低作用十分明显。鉴于kctd1为一种潜在的肥胖症治疗靶点，因此本发明的shrna和表达shrna的构建物可用于制备治疗肥胖症的药物。

2、本发明首次证明kctd1在白色脂肪组织中高度表达,有效地抑制了产热基因ucp1启动子的转录活性；kctd1shrna特异性抑制kctd1基因的表达，促进产热基因ucp1的转录，提示kctd1是一个潜在的治疗肥胖症的新靶点，可对内脏白色脂肪细胞高表达kctd1的人群给予降低kctd1的表达以达到抑制肥胖和相关代谢疾病的发生和发展，同时有利于进一步研究产热基因ucp1的复杂调控机制。

附图说明

图1.实时定量pcr检测kctd1在脂肪组织中的mrna表达。***p＜0.001。

图2.westernblotting检测kctd1和ucp1在脂肪组织中的蛋白质表达。a为westernblotting结果，b是用imagej软件分析的蛋白灰度值统计结果。

图3.luciferase分析kctd1对产热基因ucp1的转录活性的影响。***p＜0.001。

图4.kctd1shrna慢病毒系统构建和干扰效果检测图。a为kctd1shrna慢病毒系统构建策略，b为kctd1shrna效果检测的westernblotting结果。

图5.kctd1shrna对产热基因ucp1的转录活性的影响。**p＜0.01。

图6.慢病毒载体psi-lvrh1gp图谱。

具体实施方式

本申请的发明人在脂肪代谢和能量平衡机制研究过程中，利用设计的shrna构建物敲除kctd1，敲除的kctd1促进产热基因ucp1的转录，促成了完成本发明。

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式做详细说明。

实施例1、实时定量pcr检测kctd1在棕色和白色脂肪组织中的mrna表达

c57bl/6小鼠是本实验室保存，选取3月龄的雄鼠3只，分别取棕色脂肪（bat）和内脏白色脂肪组织（ewat），直接加入500μltrizol用匀浆器匀浆组织细胞。在冰上放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。然后加入500μl酚：氯仿，剧烈振荡30sec，室温放置2min。4℃12000×g离心15min。样品分为三层：底层黄色有机相，上层无色水相和中间蛋白层。rna主要在水相中，把水相转移到无rna酶的新管中。接下来用异丙醇沉淀水相中的rna，加入250μl异丙醇，室温放置10min。4℃12000×g离心10min，离心后在管侧和管底出现黄色沉淀。小心移去上清，用1ml75%乙醇洗涤rna沉淀。4℃7500×g离心2min，弃上清。室温放置5-10min干燥rna沉淀。加入50-200μl无rnase的水,用枪头吸打几次使rna溶解。甲醛变性胶电泳检测mrna的质量及用紫外分光光度计测定浓度和纯度。

以总rna为模板，用amv反转录酶和随机引物n9进行反转录，合成cdna的第一链。反转录体系为20μl，其中含有amv反转录酶(promega)，反转录缓冲液，5mmmgcl2，1mmdntp，200pm的随机引物，rna酶抑制剂和1μg总rna。反转录程序：42℃5min，37℃50min，75℃5min灭活反转录酶。所得cdna于-20℃储存或立即进行实时定量pcr反应。其反应总体积均为10μl，其中反应体系中含有：5μlsybrgreenqpcrmix，0.5μl模板cdna，kctd1和beta-actin引物各加1μl。反应程序：首先95℃预变性5min，95℃15sec，60℃30sec共40个循环，72℃5min,4℃终止。反应完成后将产物进行2^-△△ct计算。

q-pcr引物序列如下：

seqno.3and4

kctd1:forword5’-atgtcaagacctctgatcac-3’andreverse5-’tgctgtttgagactgtccaa-3’

seqno.5and6

beta-actin:forword5’-ggctgtgctatccctgtac-3’andreverse5’-cacgcacgatttcccgctc-3’

结果：实时定量pcr结果提示kctd1在棕色脂肪组织中低表达，而在内脏白色脂肪组织中高表达（图1）。

实施例2、westernblotting检测kctd1和ucp1在脂肪组织中的蛋白水平

将收获的8月龄的c57bl/6雄鼠的脂肪组织加入300μl的1×裂解缓冲液[50mmtris–hcl(ph7.2),150mmnacl,1%(v/v)tritonx-100,1%(w/v)sodiumdeoxycholate,0.1%(w/v)sds]用匀浆器匀浆15-30sec，置于冰上5min。12000×g于4℃离心15min。取上清液转移至干净的离心管中。

将蛋白样品用考马斯亮蓝法测定其浓度，然后用15%的sds-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)进行电泳。通过电转移的方法(恒压100v,4℃电转移45min)将蛋白质转印至pvdf膜，然后将膜表面的蛋白质用抗体进行特异性基因检测。将转印好的尼龙膜用含10%脱脂奶粉的tbs缓冲液[10mmtris-hcl(ph7.4),0.9%nacl]封闭1h。膜中加入按1:1000稀释的兔多克隆抗体kctd1(自己制备，dnaandcellbiology,2008,27,257-265)和ucp1(abcam)，于4℃过夜让稀释的抗体与pvdf膜充分结合。用ttbs缓冲液洗膜4次，每次15min。将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg（稀释5000倍）作为第二抗体加入封闭液，使膜浸没其中于脱色摇床中继续结合1h。用ttbs缓冲液洗膜4次。最后用ecl化学发光显色剂显色和化学发光凝胶成像系统记录实验数据。

结果：kctd1在内脏白色脂肪组织（ewat）中高表达,而在皮下白色脂肪组织(iwat和awat)中稍有表达，在棕色脂肪组织(bat)中几乎无表达。相反地，ucp1在wat中低表达而bat中高表达。gapdh作为内参对照以保证各组样品上样量相同。蛋白灰度值分析提示kctd1和ucp1在脂肪组织中的表达呈现明显的负相关性（图2）。

实施例3、luciferase实验发现kctd1抑制产热基因ucp1的转录活性

hek293细胞为本实验室保存。用12孔板在37℃、5%co2、90%相对湿度的培养箱中用dmem完全培养液（10%新生牛血清、2mml-谷氨酸、青霉素和链霉素）进行培养，待细胞密度至80%。用lipofectamine2000转染试剂将构建好的0.2μgucp1报告质粒pgl3-basic、0.2μgpcmv-lacz和不同量的kctd1过表达质粒(pcmv-myc-kctd1)转入hek293细胞中。脂质体转染方法是在转染前将细胞换成0.9ml无血清/抗生素的dmem培养液。每孔转入相同量的质粒0.9μg，不足的用空质粒pcmv-myc补齐。将dna和脂质体（2μl/孔）分别用opti-memⅰ培养基稀释到50μl，轻轻混匀,室温静置5min。将两者混匀，室温静置20min。将100μl质粒/脂质体复合物轻轻混匀，滴加入细胞中，摇匀，常规条件培养。6h后换成完全培养液继续培养。

24h后收获细胞，加入100μl的1×裂解缓冲液（promega试剂盒）摇匀，冰上裂解15min。因为报告载体含lacz基因，而lacz编码β-半乳糖苷酶蛋白，该蛋白与敏感的底物onpg快速反应成黄色产物，用移液枪移取20μl蛋白提取液进行β-半乳糖苷酶检测，加入180μl分析缓冲液,在37℃温育10-20min,有适量黄色物质出现，用100μl1m碳酸钠终止反应。用紫外分光光度计在420nm测od值，根据od值标准化蛋白裂解液的浓度。使用萤光素酶检测试剂盒(promega)，每个样品20μl加入100μl萤光素酶底物于td-20/20luminometer(turnerdesigns)下测量荧光值，记录实验数据。

seqno.7and8

ucp1启动子（-720—+316）的引物：forword5’-cggggtaccacaagttcagagtgctcttg-3’andreverse5’-ccgctcgagggtcacctaccctacctaga-3’

seqno.9and10

全长kctd1的扩增引物：forword5’-ccggaattcttatgtcaagacctctgatcac-3’andreverse5’-acgcgtcgacttagtccagaggctcttgc-3’

结果：luciferase数据显示kctd1的过表达抑制了产热基因ucp-1的转录活性（图3）。

实施例4、kctd1shrna慢病毒载体系统建立和检测

发明所提供的kctd1shrna是发明人根据人kctd1序列设计并合成的一对序列，其具体序列如下：

正义链5'-gatccgcgtcccagttcagcgaatatcaagagtattcgctgaactgggacgttttttggaatt-3';

反义链5'-aattccaaaaaacgtcccagttcagcgaatactcttgatattcgctgaactgggacgcggatc-3'

阴性对照序列（nc）如下：

seqno.11正义链5'-gatccgttctccgaacgtgtcacgttcaagagacgtgacacgttcggagaattttttggaatt-3';

seqno.12反义链5'-aattccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtctcttgaacgtgacacgttcggagaacggatc-3'

在设计的序列5'加上bamhi和3'加上ecori,然后送生工生物有限公司合成，双酶切克隆至慢病毒载体psi-lvrh1gp，并进行测序验证重组克隆中插入序列与设计序列完全一致。用lipofectamine2000将2μg重组慢病毒载体转染至3.5cm培养皿培养的hek293t细胞,24h后以2%的密度铺入4个10cm的培养皿，以2.5μg/ml嘌呤霉素处理细胞以筛选稳定表达的阳性克隆，大约10天后肉眼可见克隆团，在倒置荧光显微镜下挑取5-10个发绿色荧光的阳性克隆，从24孔板-12孔板-6孔板-6cm培养皿-10cm培养皿一级级扩增培养，最后以蛋白质印迹分析鉴定干扰效果，并冻存保种。

结果：第3号阳性克隆中kctd1蛋白的表达量较对照组（nc）显著降低,成功构建出kctd1shrna重组慢病毒载体,为进一步研究kctd1在脂肪代谢中的作用奠定了基础。westernblot验证干扰效果实验重复三次。

实施例5、luciferase分析kctd1shrna对产热基因ucp1的转录活性的影响

如实施例3，将稳定表达的hek293t细胞于12孔板培养至密度85%,将0.2μgucp1报告质粒、0.2μgpcmv-lacz和0.1μgkctd1过表达质粒用lipofectamine2000转染试剂转入细胞中。用opti-memⅰ培养基分别稀释质粒和脂质体(1μl/孔)到50μl，轻轻混匀，室温静置5min。将两者混匀于室温静置20min。将质粒/脂质体复合物轻轻混匀均匀加入细胞，6h后换新鲜的培养液。

24h后进行β-半乳糖苷酶检测以分析细胞转染效率。使用萤光素酶检测试剂盒检测每个样品的荧光强度，记录实验数据。

结果：不论在本底的还是过表达的kctd1细胞中,kctd1shrna均显著地增强了产热基因ucp-1的转录活性（图5）。

综上所述可知，kctd1在内脏白色脂肪组织中高表达，并且发现其抑制产热基因ucp1的转录，进一步设计的kctd1shrna能有效地抑制kctd1蛋白表达水平，从而促进产热基因ucp1的表达，提示kctd1调控能量代谢研究中备受瞩目的ucp1基因，有望发展成一个潜在的肥胖症研究新靶点。此外，本实施例中的kctd1shrna序列起到了显著的敲低作用。更重要的是，后续需深入研究kctd1的分子调控网络以降低潜在的副作用和治疗风险。

以上所述仅是本发明的优中选优实施方案，应当指出，在以本发明方法为基础的前提下，如果做出若干改进和增补，这些也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>湖南师范大学

<120>一种特异性抑制kctd1基因表达的shrna及应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>63

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gatccgcgtcccagttcagcgaatatcaagagtattcgctgaactgggacgttttttgga60

att63

<210>2

<211>63

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aattccaaaaaacgtcccagttcagcgaatactcttgatattcgctgaactgggacgcgg60

atc63