一种心脏粘液瘤早期诊断的试剂盒的制作方法

本发明涉及基因突变的检测，具体地涉及一种用于检测人类prkar1a基因突变的引物及试剂盒。

背景技术：

心脏粘液瘤是原发于心腔内最常见的一种真性肿瘤。一般认为属良性，有一些复杂的表现和恶性倾向，但也有人认为是恶性程度较低的真性肿瘤。世界卫生组织对于心脏粘液瘤的定义是由散在于粘液基质中的间质细胞组成的一种肿瘤。心脏粘液瘤不容易诊断，往往在幼儿期便开始出现，但直到中年期才能被发现。心脏粘液瘤的症状是心内血液栓塞引起中风或心力衰竭，粘液瘤能够完全封闭心脏瓣膜的孔，可能引起突然死亡。所以，提高对心脏粘液瘤的认识，早期诊断、早期治疗是改变本病预后的关键。

prkar1a在多种恶性肿瘤包括直肠、乳腺、肾脏和卵巢中起重要作用，是一种抑癌基因。动物实验已经证明，prkar1a的突变可以导致多种内分泌系统恶性肿瘤的发生。anselmo等证明carney综合征家族prkar1a突变会引起包括肾上腺皮质腺瘤等一系列疾病^[4]。prkar1a基因编码蛋白激酶a(pka)的调节亚基α，prkar1α蛋白的减少会导致pka的活性增加在camp信号传导通路中起重要作用。pka参与生物体多个信号通路的调节，参与多个生物活动，对生物体发挥重要作用。

技术实现要素：

本发明提供心脏粘液瘤prkar1a基因突变的引物及试剂盒。

为实现上述目的的本发明采用的技术方案为：

一种检测人类prkar1a突变的引物，具体见表1：

表1.prkar1a基因突变引物

一种检测人类prkar1a突变的方法，以提取待测样品的dna作为模板，采用上述引物，通过pcr方法扩增片段，所述扩增体系为：

所述prkar1a突变的检测方法反应条件是:

附图说明

图1.无义突变，心脏粘液瘤组织中920位碱基c突变为a，对应氨基酸s突变为终止密码子。

图2.移码突变，心脏粘液瘤组织中523-524间插入碱基g，对应176位后的氨基酸突变。

图3.移码突变，心脏粘液瘤组织中30位碱基g缺失，导致10位后的氨基酸改变。

图4.错义突变，心脏粘液瘤组织中89位碱基t突变为a，对应30位氨基酸亮氨酸变为谷氨酰胺。

图5.剪切位点突变，心脏粘液瘤组织769位碱基前的剪切位点a变为g。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。本发明以人心脏粘液瘤组织为模板，建立体外扩增体系，测序分析突变，并将此体系用于prkar1a基因突变检测。此方法主要包括以下步骤：

(1)设计针对prkar1a各外显子的引物。

(2)待测样品处理和模板提取。

(3)pcr扩增片段。

(4)一代测序检测及分析突变。

步骤(1)中根据prkar1a基因序列nm_001278433设计针对各外显子的引物，详见表2。

其中步骤(2)样品处理和模板提取，样品适用范围包括全血和组织。对于样本的处理参照市场上相应的基因组dna提取试剂盒的操作说明。

步骤(3)的pcr扩增的反应体系为：

以上试剂盒组分：10×pcrbuffer、dntpmix和taq酶购自takara生物公司。

反应条件是：

步骤(4)一代测序检测后对比原基因序列分析，根据测序峰图，分析突变类型。

实施例1

以试剂盒中的试剂来检测临床采集的全血和组织样本prkar1a基因突变为例作为样品。采用表1中记载所设计的引物对扩增目的片段。

利用上述pcr体系检测临床采集的全血和组织样本prkar1a基因突变检测的方法包括以下步骤：

(1)使用qiagen公司血液基因组dna提取试剂盒提取全血中的dna，步骤如下：取样品100μl加入20μl蛋白酶k及200μlpbs混匀。加入20μl的细胞裂解液al，涡旋混匀，56℃放置10min。加200μl无水乙醇后转移到一个吸附柱中，8,000rpm离心1min，弃废液。向吸附柱中加入500μl缓冲液aw1，8,000rpm离心1min，弃废液。向吸附柱中加入500μl漂洗液aw2，8,000rpm离心1min，弃废液。向吸附膜中间位置滴加50μl无菌水洗脱，室温放置2min，8,000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。取2μl测浓度，将提取的样品dna稀释到20ng/μl，取2μl进行pcr反应。

(2)使用qiagen公司基因组dna提取试剂盒提取组织dna，步骤如下：取组织25mg放入预冷的研钵，充分研磨，加入440μl缓冲液ap，颠倒混匀。加4μlrnase后，剧烈涡旋，将混合物在65摄氏度下温浴15min，每5min中上下轻轻颠倒试管2-3次。加入130μl缓冲液ap2，上下颠倒混匀，在冰上放置5min，14000rpm/min离心5min。将上层液体置于qiashredderminispincolum中，14000rpm/min离心2min。将上步中的滤液缓慢吸至一新的离心管，在溶解清液中仔细缓慢加入1.5倍体积的缓冲液ap3/e。将混合液加入dneasyminispincolum中，14000rpm/min离心1min，丢弃废液。加入500μl缓冲液aw，放置3-5min，14000rpm/min离心1min,丢弃废液，加入500μl无水乙醇，放置3-5min，14000rpm/min离心3min，丢弃废液和收集管取100μl灭菌的去离子水加到膜上，14000rpm/min)离心1min溶解dna。

(3)pcr扩增，其反应体系为：

pcr反应条件是：

(4)一代测序检测扩增基因序列由英潍捷基辅助完成。

(5)突变分析：总结分析测序结果，分析主要突变类型的判定。无义突变：外显子单个碱基的替换，导致密码子变为终止密码子，测序峰图为对应的碱基位点有两个峰，如图1；移码突变：外显子插入或丢失一个或多个碱基(不是3的倍数个)，导致突变位点后的氨基酸改变，测序峰图为从突变位点开始出现套峰，如图2、3；错义突变：外显子单个碱基的替换，导致密码子改变为另一密码子，但氨基酸并不改变，测序峰图为对应碱基位点有两个峰，如图4；剪切位点突变：外显子剪切位点单个碱基的替换，测序峰图为剪切位点对应的碱基有两个峰，如图5。