本发明涉及atnia1基因在提高杭白菊苗抗重金属污染和抗氧化活性中的应用。
背景技术：
近年来，随着工业化的快速发展，重金属污染日益严重。研究报道表明，以镉、铅、汞等为代表的重金属污染已成为植物生长中主要的环境胁迫因子之一。重金属污染胁迫对植物具有普遍毒害作用，不仅影响植物的生长发育及产量、品质，而且限制了植物的栽培推广。土壤中镉、铅等重金属含量过高已成为制约我国许多地区植物生长和产量的重要因素之一。由于重金属性质十分稳定，土壤一旦被重金属污染，短时间内很难去除，从而成为持久性污染物，而且随着全球工业化进程等人类活动，土壤等环境受重金属污染的情况将会日益严峻。因此，提高作物对重金属的抗性在维护农业高产稳产、农业可持续性发展方面具有越来越重要的作用。
研究报道表明，当植物遭遇重金属等非生物胁迫时，细胞内会产生大量活性氧自由基(ros)，导致氧化胁迫、膜脂过氧化及膜蛋白聚合，质膜透性增加，膜正常结构遭到破坏，从而使植物细胞活力下降，最终出现毒害症状。植物在长期进化过程中形成了一个复杂的抗氧化保护系统来清除或降低ros的伤害，包括非酶促保护系统和酶促保护系统。非酶促抗氧化保护系统主要通过合成一些具有还原能力的代谢产物，如黄酮、多酚类次生代谢产物以及还原性谷胱甘肽、类胡萝卜素、抗坏血酸(asa)等提高植物的抗氧化能力；酶促抗氧化保护系统包括超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、过氧化物酶(pod)和抗坏血酸过氧化物酶(apn)等。研究发现，具有较高非酶促保护力和酶促保护能力的植物往往具有比较强的抵抗重金属污染的能力。因此，在以往的研究中广泛尝试将各种酶促抗氧化保护系统和非酶促抗氧化保护系统的关键基因通过遗传转化的方法导入植物体内来提高植物对重金属的抗性。例如，sod是第一个清除ros的关键抗氧化酶，可以清除胁迫细胞产生的超氧自由基及其衍生物。研究发现，将烟草mn-sod的cdna转人烟草中，转化植株对镉等重金属胁迫的耐性增强；还有研究者将番茄类囊体抗坏血酸过氧化物酶基因let-1p5在番茄中过量表达，结果表明：在铅胁迫条件下转基因番茄apn活性、gsh含量、叶绿素含量、净光合速率、最大光化学效率提高，过氧化氢含量、离子渗漏率、mda含量降低，超表达let-1p1减轻了镉对转基因植株的光抑制并提高了转基因植株的重金属抗性；将芜箐didk-1r基因在拟南芥中超量表达，结果转基因拟南芥asa、gsh、叶绿素含量提高，mda含量降低，提高了转基因植株的耐铝性。
上述研究结果表明，利用转基因技术在植物过量表达各种酶促和非酶促抗氧化因子，可以降低重金属对植物细胞的氧化胁迫伤害，提高植物的重金属抗性。但是由于植物对重金属抗性的形成是一个包括多种酶促和非酶促抗氧化因子共同作用的结果，而目前的研究中大多是利用转基因技术将其中一两个因子导入到植物中，虽然也能提高植物的抗性，但是由于不能全面激活植物体内的酶促和非酶促抗冷保护系统，因此其作用效果往往比较有限。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供atnia1基因或含有atnia1基因的重组载体在提高杭白菊苗抗重金属污染和抗氧化活性中的应用的技术方案。本发明利用转基因技术将atnia1基因导入受体植物，利用atnia1基因激活植物体内多种酶促和非酶促抗氧化因子，从而提高植物重金属抗性。
本发明采用的技术方案是：
所述的atnia1基因或含有atnia1基因的重组载体在提高杭白菊苗抗重金属污染和抗氧化活性中的应用。
所述的应用，其特征在于将atnia1基因或含有atnia1基因的重组载体转入杭白菊细胞中，获得抗重金属污染和抗氧化能力均提高的转atnia1基因的杭白菊。
所述的一种提高杭白菊苗抗重金属污染和抗氧化活性的方法，其特征在于将atnia1基因或含有atnia1基因的重组载体转入杭白菊细胞中并稳定表达。
所述的一种提高杭白菊苗抗重金属污染和抗氧化活性的方法，具体包括：atnia1基因表达载体构建，通过dna重组技术将atnia1（不仅限于atnia1，还包括其他植物中的nia1基因序列）连接到具有35s启动子的表达载体质粒（不仅限于35s启动子的表达载体质粒，还包括其它表达载体质粒），构建atnia1基因重组质粒；以农杆菌eha105（不仅限于eha105，还包括可介导植物基因转移的其它农杆菌）侵染法将atnia1基因导入杭白菊细胞中，经过抗生素筛选和pcr以及rt-pcr检测确定atnia1基因可以在杭白菊中稳定表达，进而通过组织培养再生技术获得稳定表达atnia1基因的转基因杭白菊。
优选的细胞培养条件为：ms基本培养基，ph5.8,外加0.25mg/lnaa，0.35mg/l6-ba,0.20mg/l2,4-d，30g/l蔗糖。温度为28±2°c，黑暗培养。
优选的转基因杭白菊植株再生条件为：1/2ms基本培养基+1.5mg/lnaa诱导5天后再转入1/2ms基本培养基+0.5mg/lba中继续培养一周，诱导不定芽，再转入1/2ms基本培养基+0.15mg/liba中继续培养一周诱导不定根，待小苗长到5厘米时，移到无激素的新鲜ms培养基中进行扩大繁殖。
本发明的有益效果为：提供稳定的转atnia1杭白菊植株。实验结果表明，通过在杭白菊幼苗中过表达atnia1基因，可以显著提高杭白菊幼苗的酶促和非酶促抗氧化活力并降低重金属污染对幼苗的氧化损伤，提高杭白菊幼苗的抗重金属污染能力，在重金属（500mg/kg铅+5mg/kg镉）处理20天后，转atnia1杭白菊苗叶片的·dpph的清除率、·oh自由基的清除能力和总还原力分别比非转基因杭白菊提高104.8%、87.5%和114.3%；sod活性、cat活性、pod活性以及gpx活性分别比野生型杭白菊幼苗提高了87.4%、102.4%、78.0%和97.4%；转atnia1杭白菊苗幼叶细胞膜的受损率比非转基因杭白菊降低了57.3%、细胞活力提高了44.5%；转atnia1基因杭白菊苗单株重量比野生型杭白菊幼苗增加了21.3%。这对于提高杭白菊幼苗抗重金属污染和抗氧化活性具有重要的应用意义。
附图说明
图1为转基因杭白菊幼苗中atnia1表达的rt-pcr检测结果；
图2为重金属处理下转atnia1基因杭白菊幼苗与杭白菊野生型幼苗中·dpph的清除率、·oh自由基的清除能力和总还原力的比较；
图3为重金属处理下转atnia1基因杭白菊幼苗与杭白菊野生型幼苗中sod、cat、gpx和cpx活性的比较；
图4为重金属处理下转atnia1基因杭白菊幼苗与杭白菊野生型幼苗细胞渗透率和细胞活力的比较；
图5为重金属处理下转atnia1基因杭白菊幼苗与杭白菊野生型幼苗单株重量的比较。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：转atnia1基因杭白菊构建
（1）atnia1基因:以genebank等公共数据库中的atnia1基因序列为模板，从拟南芥中扩增atnia1基因或者委托专业生物工程技术公司（如上海生工生物工程技术服务有限公司）合成atnia1基因，atnia1基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。
（2）以ecorⅰ+bamhⅰ酶切atnia1基因，回收酶切片段，与质粒pbin19经ecorⅰ+bamhⅰ酶切后的大片段在16℃下过夜连接得到新质粒pbin19-atnia1。
反应体系如下：
表1pbin19、atnia1连接反应体系
（3）质粒pchs经hindⅲ+xbaⅰ酶切后回收含camv35s启动子的小片段,与质粒pbin19-atnia1经hindⅲ+xbaⅰ酶切后的大段在16°c下过夜连接得到新质粒pbin-35s-atnia1。
（4）pbin-35s-atnia1导入农杆菌eha105。农杆菌感受态的制备和质粒的提取参照《分子克隆实验指南》进行。用冻融法将pbin-35s-atnia1导入农杆菌eha105。操作方法如下：在100μleha105感受态细胞中加入约0.1μg纯化质粒dna,混匀,0℃冰上放置10min,置于液氮速冻5min,立即用28℃水浴热激5min,加入500μllb液体培养基,在28℃振荡培养2h。取100μl菌液分别涂布于lb+50mg/lkm（卡那霉素）+50mg/lstr（链霉素）固体培养基上,28℃培养约48h筛选抗性菌落。
（5）农杆菌eha105介导的遗传转化
eha105/pbin-35s-atnia1抗性菌在lb+50mg/lkm+50mg/lstr液体培养基中28℃、200r/min过夜培养,再取5ml菌液移入50mlms+50mg/lkm+50mg/lstr液体培养基中28℃、200r/min培养至od600为0.5左右,5000r/min、4℃离心10min,收集菌体,用ms培养基清洗3次后,用ms+乙酰丁香酮20mg/l培养基将菌液稀释10倍后作为侵染液。
取0.2-0.4g左右的杭白菊叶愈伤组织,放入侵染液中10min后,取出愈伤组织，用无菌滤纸吸干菌液,置于ms培养基上共培养3d后,转入ms+500mg/lcef（头孢霉素）+50mg/lkm培养基上培养，筛选获得抗性细胞；同时将未经侵染的杭白菊叶愈伤组织培养在相同的培养基上作为阴性对照。
（6）转atnia1基因杭白菊细胞的pcr鉴定
以atnia1dna为模板，对经过抗生素筛选的阳性细胞进行pcr扩增，扩增产物电泳结果呈阳性的为转基因细胞，否则为阴性细胞。
（7）转atnia1基因杭白菊植株再生
将获得的转atnia1基因杭白菊阳性细胞接种到ms基本培养基（ph5.8）+0.25mg/lnaa+0.35mg/l6-ba+0.20mg/l2,4-d+30g/l蔗糖,28±2°c下黑暗培养20天，然后转入1/2ms基本培养基+1.5mg/lnaa诱导5天后再转入1/2ms基本培养基+0.5mg/lba中继续培养一周，诱导不定芽，再转入1/2ms基本培养基+0.15mg/liba中继续培养一周诱导不定根，待小苗长到5厘米时，移到无激素的新鲜ms培养基中进行扩大繁殖。
（8）转基因杭白菊植株atnia1基因表达水平检测
采用rt-pcr技术对转基因杭白菊植株中atnia1基因的表达水平进行检测，结果表明与野生型杭白菊相比，转基因杭白菊植株中atnia1基因可以高水平稳定表达（图1）。
实施例2：atnia1基因对杭白菊幼苗重金属胁迫损伤的抑制作用及幼苗生长的改善作用
（1）将上述获得的转atnia1基因杭白菊幼苗进行扩大繁殖，20天后放入室温下闭瓶炼苗，3天后再打开瓶盖进行炼苗，2天后再将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前按照下述方法进行消毒。移栽前适当遮荫，保持较高的空气湿度（相对湿度98%左右）。
基质配比如下：河沙：腐质土：蛭石=1：1：1。
基质消毒方法：将基质包装严实，放入灭菌锅，121℃灭菌45min。
转atnia1基因杭白菊幼苗在基质中生长30天后，选取生长一致的幼苗移入含重金属（500mg/kg铅+5mg/kg镉）的基质中继续生长（重金属污染处理）。
（2）以未经遗传转化的杭白菊愈伤细胞为材料，按照上述方法进行培养再生，获得杭白菊野生型再生幼苗，并按照与（1）完全相同的培养条件进行培养。
（3）采取重金属污染基质中生长不同时间的转atnia1基因杭白菊幼苗和杭白菊野生型再生幼苗的第一片展开叶，分别测定·dpph的清除率、·oh自由基的清除能力和总还原力以及sod、cat、pod、gpx活性和细胞离子渗透率及细胞活力，考查重金属污染胁迫下转atnia1基因杭白菊幼苗和杭白菊野生型再生幼苗综合抗氧化活性及重金属污染胁迫下细胞损伤的动态变化曲线。结果表明，与野生型杭白菊幼苗相比，在重金属污染胁迫下转atnia1基因杭白菊幼苗中的酶促和非酶促抗氧化能力均显著提高。经重金属处理20天后，转atnia1基因杭白菊苗幼叶·dpph的清除率、·oh自由基的清除能力、总还原力、sod活性、cat活性、pod活性以及gpx活性分别比野生型杭白菊幼苗提高104.8%、87.5%、114.3%、87.4%、102.4%、78.%和97.4%（图2，图3）；而转atnia1基因杭白菊苗幼叶细胞离子渗透率比野生型杭白菊幼苗降低了57.3%、细胞活力则提高了44.5%。（图4）。
（4）实验结果表明，在重金属污染胁迫下atnia1基因可以全面提高杭白菊幼苗的酶促和非酶促抗氧化能力、降低幼苗的重金属胁迫损伤、提高杭白菊幼苗的抗重金属污染能力。
（5）以转atnia1基因杭白菊苗、野生型杭白菊幼苗为材料，按照（1）-（3）方法进行培养，在重金属污染基质中生长20天后取样测定幼苗单株重量，结果如图5。实验结果表明，经重金属处理20天后，转atnia1基因杭白菊苗单株重量比野生型杭白菊幼苗增加了21.3%，说明在杭白菊幼苗中过表达atnia1基因可以改善幼苗在重金属污染环境下的生长。
序列表
<110>杭州师范大学
<120>本发明提供了atnia1基因在提高杭白菊苗抗重金属污染和抗氧化活性中的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>3475
<212>dna
<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)
<400>1
cccctataaatacaacctctcatttactcattcagaaaccaaaaaatttcacaaaccaaa60
ccaaaaccaaaaaaatagcttatctctctcttatcaccggttcaatcactaaaccatggc120
gacctccgtcgataaccgccattatcccaccatgaacggcgtccgtcacgccttcaaacc180
tcctctcgttccttctcctcgctcattcgaccgccaccgtcaccaaaaccaaactctcga240
cgtcatcctcaccgaaactaaaatcgtcaaagaaaccgaagtcatcaccaccgtcgtaga300
cagttacgacgactcctcaagcgacgacgaagacgagagccataaccgtaacgtccctta360
ctacaaagagctggttaaaaaatcaaacagcgatttagaaccgtcgattttagatccgag420
agatgaatcaacggctgatagttggattcaacgtaactcatccatgctccgtctcaccgg480
aaaacatccattcaacgccgaagcacctcttcctcgtcttatgcaccatggattcatcac540
tccagttccactccattacgtccgcaaccacggtgcagttcccaaagcgaattggtcaga600
ctggtcaatcgaaattaccggactcgttaaacgtccggctaaattcaccatggaagagct660
aatctccgagttccccagccgcgaattcccggtgacactcgtctgcgccggtaatcgccg720
caaggaacagaacatggtgaaacaaacgatcggattcaattggggatccgccggagtatc780
tacttctctatggaaaggtattccgttaagcgaaatcctccgtcgatgcgggatctatag840
ccggagaggaggcgcgttaaacgtttgcttcgaaggagcggaggatcttcccggcggcgg900
cggatctaaatacggaacaagtattaagaaggagatggcgatggatccggctagagatat960
tatcttagcttatatgcaaaacggcgagcttttaacgccggatcatgggtttccggttcg1020
ggtcattgtaccgggtttcatcggtggtcggatggttaaatggttaaagagaatcatcgt1080
cacgcctcaagaatctgacagttactatcactataaagacaatcgagtccttccttctct1140
cgttgatgctgagctggcaaattccgaaggtaaactattaacttacccttgtcttctttt1200
acattttagttaccgatgctaatattatttacttgtttttgttacagcttggtggtataa1260
gcctgaatacataatcaacgagcttaatataaactcggtgattacaacacctggtcacgc1320
agagattttaccgattaatgcattcactactcagaagccgtacacattaaaaggctacgc1380
ttattctggtaatttattttaactttgctttagttaaaagttaaaaggattctttactat1440
gtaattaaaatcctgatcggtgtattgatgaaataaacaggaggaggtaagaaggtaacg1500
agggttgaggtgactctagacggaggagacacgtggagtgtttgtgagcttgaccaccag1560
gagaaaccgaacaagtacggtaaattctggtgctggtgtttctggtcacttgacgttgag1620
gttcttgatctgctcagtgctaaagacgtcgcggttcgagcctgggacgagtctttcaat1680
actcagcctgataaactcatctggaacctcatggtaataatcctctctcttgatattttt1740
aaattatagaattaattagtttactttattctttactatatgatttaaatagtttaatct1800
tgtttttgagtaaactattcgattttgatatttgtattcgtcctacaaagttggaactac1860
tgatgatattttcttttgaacgtgatacctaccaatactaatcttacggaatcttttaat1920
agagcactaatcaacatggaactaaagaccaattctttaagtgtctctgttgtacagttc1980
attttagtagtgcgtttaagtattataatctcccttcatgcggggcaattatgtagatta2040
aaatcgaaattatataaaatttacataagtctaagtctagggtctccagctaattgttat2100
ttttttaacgatgttgactaaagcaataacgacgttgacttgtgttaaacaggggatgat2160
gaacaattgctggttcaggattaggaccaacgtgtgcaagcctcatagaggagagatagg2220
gatagttttcgaacacccgaccagacccggaaaccagtcgggtgggtggatggcaaagga2280
gcgtcagcttgagatttcctcagaatccaacaataccttgaagaaatctgtctcatctcc2340
tttcatgaacactgcctcgaagatgtattcaatctctgaagttagaaaacacaacactgc2400
tgactctgcatggatcatcgtccacggtcacatctatgactgtacacgtttcttgaaaga2460
tcatccaggaggcacagattctatcctgataaacgcaggtacagattgcaccgaagagtt2520
tgaagccattcactctgacaaagccaagaagcttttggaagattaccgtatcggtgaact2580
catcaccactggctacgactcttcccctaacgtctcagttcatggtgcctcaaactttgg2640
tcctttgttagctccaatcaaagagctaactcctcaaaagaacattgctttggtcaaccc2700
acgtgagaaaatcccggttaggctcattgagaagacttcgatctcgcacgacgttcgtaa2760
gttccgattcgcattaccatcagaagatcaacagcttggtttacccgtggggaagcacgt2820
tttcgtttgcgccaacataaacgacaaactctgtctcagagcttatactcccaccagcgc2880
catcgacgcggttggtcatatcgacctcgtcgtcaaagtttacttcaaagacgttcatcc2940
aaggtttcccaatggtggactcatgtctcaacacttagactcgttaccaatcgggtcaat3000
gatagatatcaaaggtccactagggcacatcgagtacaaaggcaaaggcaacttcctggt3060
cagcggcaaacctaagtttgccaagaaactagcaatgctcgccggaggaacaggcatcac3120
tcctatctaccagatcattcaatctatattgagtgatccagaggacgaaaccgagatgta3180
tgtggtttacgcaaacagaaccgaggatgacattcttgtgagggaagagctagaaggatg3240
ggctagtaagcataaggagaggctaaagatttggtacgtcgttgaaatcgcaaaggaagg3300
ttggagttacagtaccgggtttataactgaagctgtgcttagggaacatatccctgaagg3360
tttggaaggcgaatcgctagcactcgcatgcggaccaccgcctatgattcagtttgcgtt3420
gcagccaaatctagagaagatgggttacaacgtgaaggaggatctcttaatcttc3475