本发明属于化工分离技术领域，具体涉及一种模拟移动床色谱分离辅酶q10和辅酶q11的方法。
背景技术：
辅酶q10主要存在于植物种子、鱼类、动物肝脏、肾脏和心脏中，是一种脂溶性的醌类化合物，它的化学名称为2-(3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-十甲基-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-四十癸烯基)-5,6-二甲氧基-3-甲基-p-苯醌，分子式为c59h90o4，分子量863.34。
辅酶q10在细胞能量的产生和清除人体自由基方面有着非常重要的作用，近来的研究表明，辅酶q10在人体内的含量随着年龄的增长明显减少，这与许多伴随衰老出现的疾病如帕金森病等密切相关；随着对辅酶q10功能的深入研究，其在医药品、化妆品和食品添加剂领域都将有更为广泛的应用。
辅酶q10的生产工艺主要包括动物组织提取法，植物细胞培养法、微生物发酵法和化学合成法，前三种方法均需要复杂的分离纯化过程才能获得高纯度的辅酶q10，常用的分离纯化方法包括有机溶剂浸提、碱醇皂化提取、硅胶柱层析和重结晶等。
公开号为cn103819326a的专利申请公开了一种依次用超声波破碎、有机溶剂提取、硅胶柱层析和结晶来精制辅酶q10的方法；cn101429108a公开了一种依次用无水乙醇提取、水和正己烷萃取、硅胶柱层析和结晶来提纯辅酶q10的方法；cn102391092a公开了一种用超临界二氧化碳萃取菌渣，然后用硅胶柱层析和结晶，得到纯度大于99.5％的辅酶q10；cn101987815a公开了一种吸附树脂和硅胶柱层析结合的方法制备得到纯度大于98％的辅酶q10；上述方法均用到了硅胶柱层析，然而硅胶柱对于辅酶q10粗提物中的主要杂质之一的辅酶q11的分离能力较弱，需要再经重结晶才能将辅酶q11完全脱除，工艺路线长，总回收率低。
辅酶q10和辅酶q11同为辅酶q类化合物，分子结构上仅在侧链相差一个异戊烯单元，因而分离困难，实现两者高效分离的关键在于寻找合适的分离介质和分离技术。
模拟移动床色谱是化工分离领域十分成熟的制备技术，它由4根以上的色谱柱串联而成，首尾相接成一个闭合的系统。洗脱剂入口、进料液入口、萃取液出口、萃余液出口等四个进出口将所有色谱柱分成流速不同的四个区，分别承担不同的功能。通过定期切换四个进出口来实现流动相与固定相的模拟逆流。在萃取液出口连续收集含强吸附组分和洗脱剂的混合溶液，而在萃余液出口连续收集含弱吸附组分和洗脱剂的混合溶液。一方面，它适合两组分混合物的分离，且对目标混合物的分离度要求不高；另一方面，它实现了生产的连续化，提高了固定相的利用率，减少了溶剂消耗，降低了生产成本。
技术实现要素：
针对现有方法存在的不足，本发明提供一种模拟移动床色谱分离辅酶q10和辅酶q11的方法，本方法制备工艺简单，分离度高、制备量大，回收率高、溶剂消耗少、生产成本低。
根据“相似相溶”原理，c18等表面富含非极性基团的填料可与辅酶q10和辅酶q11中的长碳链和苯环发生疏水相互作用，从而识别辅酶q10和q11在双键数和碳链长度上的差异。以这类填料作为固定相，调节洗脱剂的种类和比例，设计合适的各区流速和切换时间，采用模拟移动床色谱可以实现辅酶q10与杂质的连续分离。为实现本发明目的采用以下技术方案：
一种模拟移动床色谱分离辅酶q10和辅酶q11的方法，其操作示意图如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)将辅酶q10和辅酶q11的混合物溶解在有机溶剂中配成进料液；
(2)将进料液和洗脱剂连续通入模拟移动床色谱系统中，从模拟移动床色谱系统的萃取口连续收集富含q11的萃取液，从萃余口连续收集富含辅酶q10的萃余液；
所述的模拟移动床色谱系统由4～32根装有固定相的色谱柱组成，共四个区，每区由1～8根色谱柱串联而成。各区之间可以串联也可以断开，可以采用等度操作模式也可以采用梯度操作模式。预先设置各区流量、切换时间、切换次数和柱温等操作参数，连续泵入进料液和洗脱剂，待系统达到稳态后，从萃余口连续收集富含辅酶q10的萃余液。
在模拟移动床色谱系统运行前，采用湿法装柱法将固定相颗粒填装到色谱柱中，装柱溶剂为甲醇或乙醇，对各柱的压力、柱效、溶质保留时间、分离度、总孔隙率进行对称性实验，确保每根色谱柱的性能指标一致。依据“三角理论”初步确定可分离区，调节各区流量和切换时间，直到辅酶q10与杂质达到完全分离。
(3)萃余液经后处理后得到辅酶q10单体；萃取液经后处理后得到辅酶q11单体。
所述的有机溶剂为碳原子数为1～4的一元醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯和四氢呋喃中的一种或任意两种的混合物。
所述进料液的浓度为5～500g/l，进一步优选为20～200g/l。若进料浓度过低，则生产能力降低，工艺经济性降低；若进料浓度过高，则完全分离区显著缩小，设计操作条件的难度加大，分离难度增大。
所述的洗脱剂与进料液溶剂的组成相同。
所述的模拟移动床色谱系统的固定相为聚苯乙烯/二乙烯苯型树脂、苯基键合硅胶、c8键合硅胶或c18键合硅胶。
所述固定相的粒径控制在5～200μm，进一步优选为10～100μm。若粒径太大，则柱效降低，不利于辅酶q10与q11的分离；若粒径太小，则柱压太高，不利于操作。
所述固定相的孔径控制在5～100nm，进一步优选为10～50nm。若填料孔径太小，则目标分子不容易进入孔道内部，降低分离效果；若填料孔径太大，则孔内扩散慢，传质阻力大。
所述色谱柱的直径为5～500mm，长度为50～1000mm，进一步优选为直径10～100mm，长度100～500mm。若色谱柱尺寸过小，则生产能力较低；若色谱柱尺寸过大，则填料填装困难，壁面效应明显，色谱柱的分离能力下降。
所述的操作参数控制为：洗脱剂流速1～1000ml/min，进料液流速1～100ml/min，萃取液流速1～100ml/min，萃余液流速1～100ml/min，切换时间1～50min。切换时间进一步优选为3～10min，若切换时间过短，则切换阀容易损坏；若切换时间过长，则系统难以达到稳态。
所述的模拟移动床色谱的分离温度为0～60℃，进一步优选为20～50℃。若温度过低，则辅酶q10在溶剂中的溶解度明显降低，进料液的浓度受到限制；若温度过高，则辅酶q10在分离过程中容易氧化变质。
所述的后处理为将萃余液和萃取液减压浓缩，然后用少量乙醇洗涤，再经真空干燥后分别得到高纯度的辅酶q10单体和辅酶q11单体。
所述的减压浓缩，洗涤和真空干燥均为常规操作。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明采用c18等表面富含非极性基团的填料作为固定相对于辅酶q10和辅酶q11具有较高的选择性分离能力，相比常用的硅胶填料，显著提高了两者的分离效率。
2.制得的辅酶q10和辅酶q11单体纯度高，回收率高。
3.采用模拟移动床色谱技术实现生产的连续化，产率高、溶剂消耗少、生产成本低。
附图说明
图1为本发明模拟移动床色谱的操作示意图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种模拟移动床色谱分离辅酶q10和辅酶q11的方法进行具体描述，但本发明并不限于这些实施例，该领域技术人员在本发明核心指导思想下做出的非本质改进和调整，仍然属于本发明的保护范围。
以下实施例中模拟移动床装置采用德国cespc9116(诺尔，德国)，它装配多口旋转阀，最多可接16根色谱柱，每区色谱柱数相同，在1～4根内变动；配有4台s-100型液相泵，其中进料泵流速0～10ml/min，洗脱剂泵、萃取液泵和萃余液泵的流速0～50ml/min。洗脱剂从4区和1区之间注入，进料液在2区和3区之间注入，辅酶q10在3区和4区之间的萃取液出口收集，辅酶q11在1区和2区之间的萃取液出口收集。每隔一个切换时间(注：这个切换时间是可调节的)，色谱柱朝洗脱剂流向相反的方向切换一个位置。
以下实施例中辅酶q10和辅酶q11含量的测定均按照中国药典中所描述的方法操作，液相色谱法的分析条件为：watersatlantist3分析柱(250mm×4.6mm,5μm)，以甲醇-无水乙醇(1:1)为流动相，流量1ml/min，进样量20μl，检测器为紫外检测器，检测波长275nm。
以下实施例中将收集到的辅酶q10和辅酶q11产品取少量样品用无水乙醇溶解并稀释制成每1ml中含约0.2mg辅酶q10/辅酶q11的溶液，采用外标法以峰面积计算其纯度。
本发明纯度和回收率的计算方法如下：
纯度＝产品中辅酶q10(或辅酶q11)的质量÷产品的总质量×100％
回收率＝产品中辅酶q10的质量÷原料中辅酶q10的质量×100％。
实施例1
辅酶q10和辅酶q11的混合物(辅酶q11/辅酶q10＝13.6％，质量比)，用乙醇和乙酸乙酯的混合物完全溶解(乙醇占总体积的百分比为70％)，配成总浓度为20g/l的进料液。
模拟移动床装有8根色谱柱，尺寸1cm×15cm；固定相为c18，其粒径10μm，孔径12nm；洗脱剂与进料液溶液的溶剂相同；操作温度20℃；操作参数经优化确定为：洗脱剂流速6ml/min，进料液流速2ml/min，萃取液流速4ml/min，萃余液流速4.2ml/min，切换时间3min。连续切换32次后，系统达到平衡。
从萃取液出口收集到富含辅酶q11的溶液，从萃余液出口收集到富含辅酶q10的溶液，经减压浓缩、乙醇洗涤、真空干燥后得到辅酶q10和辅酶q11单体。用液相色谱分析得辅酶q10产品的纯度为99.9％，回收率99.9％；辅酶q11的纯度为99.8％，回收率99.8％。
实施例2
辅酶q10和辅酶q11的混合物(辅酶q11/辅酶q10＝13.6％，质量比)，用乙醇和乙酸乙酯的混合物完全溶解(乙醇占总体积的百分比为70％)，配成总浓度为50g/l的进料液。
模拟移动床装有8根色谱柱，尺寸2cm×25cm；固定相为c8，其粒径30μm，孔径12nm；洗脱剂与进料液溶液相同；操作温度20℃；操作参数经优化确定为：洗脱剂流速9ml/min，进料液流速3ml/min，萃取液流速7ml/min，萃余液流速5ml/min，切换时间8min。连续切换32次后，系统达到平衡。
从萃取液出口收集到富含辅酶q11的溶液，从萃余液出口收集到富含辅酶q10的溶液，经减压浓缩、乙醇洗涤、真空干燥后得到辅酶q10和辅酶q11单体。用液相色谱分析得辅酶q10产品的纯度为99.9％，回收率99.9％；辅酶q11的纯度为99.8％，回收率99.8％。
实施例3
辅酶q10和辅酶q11的混合物(辅酶q11/辅酶q10＝9.48％，质量比)，用乙醇和四氢呋喃的混合物完全溶解(乙醇占总体积的百分比为80％)，配成总浓度为20g/l的进料液。
模拟移动床装16根色谱柱，尺寸1cm×15cm；固定相为amberchromcg300聚苯乙烯型树脂，其粒径35μm，孔径15nm；洗脱剂与进料液溶液相同；操作温度40℃；操作参数经优化确定为：洗脱剂流速16ml/min，进料液流速2ml/min，萃取液流速9.5ml/min，萃余液流速8.5ml/min，切换时间5min。连续切换48次后，系统达到平衡。
从萃取液出口收集到富含辅酶q11的溶液，从萃余液出口收集到富含辅酶q10的溶液，经减压浓缩、乙醇洗涤、真空干燥后得到辅酶q10和辅酶q11单体。用液相色谱分析得辅酶q10产品的纯度为99.1％，回收率99.5％；辅酶q11的纯度为98.0％，回收率99.9％。
实施例4
辅酶q10和辅酶q11的混合物(辅酶q11/辅酶q10＝9.48％，质量比)，用乙醇和四氢呋喃的混合物完全溶解(乙醇占总体积的百分比为80％)，配成总浓度为50g/l的进料液。
模拟移动床装有16根色谱柱，尺寸1cm×25cm；固定相为mcigelchp20y聚苯乙烯型树脂，其粒径30μm，孔径22nm；洗脱剂与进料液溶液相同；操作温度40℃；操作参数经优化确定为：洗脱剂流速15.4ml/min，进料液流速1.5ml/min，萃取液流速8.9ml/min，萃余液流速8.0ml/min，切换时间6min。连续切换48次后，系统达到平衡。
从萃取液出口收集到富含辅酶q11的溶液，从萃余液出口收集到富含辅酶q10的溶液，经减压浓缩、乙醇洗涤、真空干燥后得到辅酶q10和辅酶q11单体。用液相色谱分析得辅酶q10产品的纯度为98.6％，回收率99.3％；辅酶q11的纯度为96.9％，回收率99.9％。