一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用与流程

本发明属于天然高分子多孔材料领域，具体涉及一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用。

背景技术：

微载体技术是实现大规模细胞培养的有效手段，目前国外已有部分实心或多孔微载体实现商品化，如cytodex、cultispher等，同时还有多种微载体处于实验室研究阶段。与传统的平板培养相比，这些微载体能为贴壁性细胞提供充足的粘附位点，实现细胞大规模悬浮培养，但现有的微载体均忽视了让细胞进入其内部孔隙生长并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接，从而未能实现真正的细胞三维培养。

壳聚糖是由自然界广泛存在的甲壳素经过脱乙酰基后的产物，具有良好的生物相容性、血液相容性与微生物可降解性等优良性能，在生物医学领域有广阔的应用前景。近年来，基于壳聚糖的细胞微载体已有报道，包括实心微载体(中国发明专利cn201210000553.8)与多孔微载体(中国发明专利cn200910041768.2，cn200910041767.8)，但没有证据表明这些微载体能让细胞进入内部孔隙生长并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接，同时其制备技术往往采用戊二醛、环氧氯丙烷等交联剂或聚乙二醇等致孔剂，增加了微载体的生物毒性及制备成本。

现有技术中多孔微载体(含壳聚糖微载体)的孔隙率都不超过95％(cn201110305547.9,cn201210000554.2,cn200910041767.8)；目前文献报道的多孔微载体的比表面积也仅为1～10m²/g，例如商品化多孔微载体cytopore的比表面积为1.0～3.0m²/g(healthcare,g.e.；biosciences,a.microcarriercellculture:principlesandmethods.generalelectriccompany2005.)；由此微体内部没有相互联通的空隙，不能让细胞进入内部孔隙生长，并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接。尽管，“内部相互联通”的多孔微球现有技术中已有报道，但其孔隙太大或太小在细胞微载体方面都是没有应用意义的。

技术实现要素：

本发明为克服现有技术当中的多孔壳聚糖微载体孔隙率低、表面和内部没有相互联通的空隙而不利于细胞粘附和增长、不能支持大量细胞生长且不能形成细胞-细胞连接，因而不能实现真正的三维培养等缺陷，提供一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用。本发明的多孔壳聚糖微载体尺寸均一，且表面和内部具有相互联通的孔隙，孔隙率高达95％以上；利用本发明的多孔壳聚糖微载体培养细胞，细胞不仅可以粘附于载体表面，还能进入内部空隙生长，并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接，实现真正的三维培养；且所述多孔壳聚糖微载体不包含致孔剂和交联剂，因此降低了培养细胞过程中的生物毒性，具有良好的生物相容性。

本发明提供一种多孔壳聚糖微载体，其以壳聚糖为主要成分，所述多孔壳聚糖微载体的直径为100～300μm，其表面和内部具有相互联通的孔隙，所述孔隙的尺径为10～70μm，且孔隙率为95％以上。所述的“主要成分”的含义为本领域常规，于本发明中指的是多孔壳聚糖为载体可以完全由壳聚糖构成，或者可以含有部分杂质，例如在制备过程中难以完全去除的原料。

所述多孔壳聚糖微载体的直径优选165～220μm，更优选180～200μm。

所述孔隙的尺径(又称“孔径”)优选20～60μm，更优选25～50μm，进一步更优选30～40μm；当所述孔隙为不规则形状时，其尺径指的是其平均直径。

较佳地，所述多孔壳聚糖微载体的孔隙率为97～99％，更精确地为97.2％～98.5％；优选98％。

上述多孔壳聚糖微载体的比表面积可为本领域常规，较佳地其比表面积大于10m²/g；优选28～32m²/g，更精确地为28.8～31.5m²/g；进一步更优选30.1m²/g或者30.8m²/g。

其中，所述多孔壳聚糖微载体的直径、孔隙率以及比表面积的数值为均值，如本领域技术人员公知，其均有一定的标准差，例如所述微载体直径的标准偏差可为50μm，所述孔隙率的标准偏差为1％左右，所述比表面积的标准偏差为2m²/g左右。

上多孔壳聚糖微载体的弹性模量可为本领域常规，优选130～160kpa，更优选135～155kpa，进一步更优选140～150kpa，最优选145kpa。

上述任一种多孔壳聚糖微载体的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将分散相与连续相混合均匀，乳化后得w/o乳液；所述分散相为壳聚糖的醋酸水溶液，所述连续相为含乳化剂的有机溶剂溶液；

(2)将所述w/o乳液在-50℃～-5℃淬火2～6小时进行热致相分离；

(3)将相转变液倒入淬火后的乳液中进行反相再生，即得多孔壳聚糖微载体；所述相转变液为含碱的乙醇和水混合液。

其中，步骤(1)的操作可根据本领域常规，所述壳聚糖的脱乙酰化程度可为本领域常规，其脱乙酰化程度越高，越利于微体的形成以及所形成的微体的性质；本发明中，所述壳聚糖的脱乙酰化程度取决于目前市售壳聚糖产品的脱乙酰化程度，较佳地大于80％，更佳地为95％；所述壳聚糖的粘均分子量可为本领域常规，较佳地为10～15万，更佳地为10万。

较佳地，所述壳聚糖的含量为1％～3％，优选1％；所述醋酸水溶液的醋酸含量为1％～3％，优选1％；所述乳化剂的含量为3％～7％，优选5％；所述乳化剂优选span80与tween60的混合物；所述span80与所述tween60的质量比为24:(1～5)；优选20:1；所述有机溶剂为石油醚和/或矿物油；和/或，所述分散相与所述连续相的体积比为1:(3～10)，优选1:5；所述百分比为质量体积百分比g/ml。

步骤(1)中所述乳化的温度较佳地为30～50℃，更佳地为40℃。

步骤(1)中所述乳化的时间可为本领域常规，优选2～6小时，更优选4小时；更佳地，为了获得分散均匀的乳液，所述乳化在搅拌下进行，所述搅拌的速度优选800～1500转/分钟，更优选1000转/分钟。

步骤(1)中所述有机溶剂可为本领域常规，较佳地为石油醚和/或矿物油。

步骤(1)中所述乳化剂可为本领域常规，较佳地为span80与tween60的混合物，所述span80与所述tween60的质量比优选24:(1～5)，更优选20:1。

步骤(2)中所述淬火的时间优选4小时；

步骤(2)中所述淬火的温度若不在-50℃～-5℃的范围内不利于孔隙的形成或形成的孔隙尺寸不合适，所述淬火的温度优选-40℃～-10℃，更优选-20℃。

步骤(3)的操作可为本领域常规，较佳地，所述相转变液与所述淬火后的乳液的体积比为(1～2):1，优选1.67:1；所述相转变液为碱含量为1％～3％的乙醇和水混合液，所述碱含量优选1％，所述百分比为质量体积百分比g/ml；

步骤(3)中所述乙醇与所述水的体积比为20:(1～5)，优选14:1。

所述碱在制备方法中的作用是的中和分散相中的醋酸，可以使用任何无机碱或有机碱，然而为了便于碱在制备相转变液时的溶解、以及后期多孔壳聚糖微载体的洗涤，较佳地使用无机碱；所述无机碱优选常见金属的碱，例如钾碱、钠碱等，较佳地为氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种或多种。

上述制备方法利用的是微乳化技术结合热致相分离原理，因此所述制备方法可以不使用交联剂和/或致孔剂。

上述制备方法较佳地还包括步骤(4)：对步骤(3)所得多孔壳聚糖微载体进行洗涤和干燥，所述洗涤进行至洗脱液ph为6.5～7.8。

本发明还提供一种上述多孔壳聚糖微载体在细胞三维培养中的应用；所述细胞优选贴壁性细胞；更优选l-02肝细胞、血管内皮细胞或hela细胞。

所述的细胞三维培养包括如下步骤：

(1)将所述多孔壳聚糖微载体以3～5mg/ml浸泡于无血清培养液中；所述无血清培养液优选rpmi-1640；所述浸泡的时间优选6小时以上；

(2)将浸泡过的所述多孔壳聚糖微载体转入细胞培养板中，加入等体积细胞，所述细胞的密度优选5×10⁴个细胞/孔；

(3)将所述细胞培养板置于二氧化碳培养箱中。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的多孔壳聚糖微载体尺寸均一，且表面和内部具有相互联通的孔隙，孔隙率最高可达95％以上；利用本发明的多孔壳聚糖微载体培养细胞，细胞不仅可以粘附于载体表面，还能进入内部孔隙生长，并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接，实现真正的三维培养，有效地模拟体内环境，更好地保持细胞的活力与功能，同时充分利用内部孔隙还有望提高细胞产量；且所述多孔壳聚糖微载体可不包含致孔剂和交联剂，因此降低了培养细胞过程中的生物毒性，具有良好的生物相容性。

附图说明

图1为多孔壳聚糖微载体的形态及物理性质示意图，其中：a.扫描电镜图；b.局部放大的扫描电镜图；c.切面光镜图；d.孔径分布；e.弹性模量。

图2为l-02细胞在多孔壳聚糖微载体表面及内部粘附的扫描电镜图。

图3为多孔壳聚糖微载体的细胞毒性与血液相容性评价，其中，a.间接接触的细胞毒性分析；b.直接接触的细胞毒性分析；c.溶血率分析。

图4为l-02细胞在多孔壳聚糖微载体表面及内部存活与增殖的激光共聚焦显微镜图。注：绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞；明场，也称为明视场，一般作为普通观察用。

图5为经多孔壳聚糖微载体培养的l-02细胞的肝功能检测：a.白蛋白分泌；b.尿素合成。

注：图中csm为本发明多孔壳聚糖微载体。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1多孔壳聚糖微载体的制备

1、配制1％(w/v)壳聚糖脱乙酰化程度95％，粘均分子量10万(供应厂商为)的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量1％(w/v)；配制5％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由span80与tween60按20:1(w/w)混合组成；配制1％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为14:1(v/v)。

2、将10ml上述分散相溶液缓慢加入到50ml连续相溶液中，在40℃、1000r/min搅拌下乳化4小时，得到w/o乳液。

3、将所得w/o乳液在-20℃下淬火4小时进行热致相分离。

4、将100ml上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液ph为7.0，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。

根据图1的扫描电镜(sem)结果所示，本实施例制备所得多孔壳聚糖微载体为多孔微球形态(图1a)，根据图1b可以看到其具有内部相互联通的孔隙，根据图1c可以进一步确认其内部孔隙是相互联通的。该实施例制备的多孔壳聚糖微载体采用扫描电镜测得多孔微球的平均直径为180μm，采用液体置换法测得孔隙率为98.5％，用压汞仪法测得孔隙的孔径为10～60μm(图1d)，采用氮气吸附-脱吸附等温分析法测得比表面积达30.1m²/g，采用原子力显微镜的扫描力显微镜模式测得弹性模量约为150kpa(图1e)。

实施例2多孔壳聚糖微载体的制备

1、配制1％(w/v)壳聚糖(脱乙酰化程度95％，粘均分子量10万)的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量1％(w/v)；配制7％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由span80与tween60按24:1(w/w)混合组成；配制1.5％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为20:1(v/v)。

2、将10ml上述分散相溶液缓慢加入到30ml连续相溶液中，在30℃、1000r/min搅拌下乳化4小时，得到w/o乳液。

3、将所得w/o乳液在-50℃下淬火2小时进行热致相分离。

4、将80ml上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液ph为6.5，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。

本实施例制备的多孔壳聚糖微载体为平均直径200μm的多孔微球，孔隙率为99.0％，其表面和内部具有相互联通、尺径10～40μm的孔隙，比表面积达31.5m²/g，弹性模量约为135kpa。

实施例3多孔壳聚糖微载体的制备

1、配制3％(w/v)壳聚糖(脱乙酰化程度大于80％，粘均分子量15万，供应厂商为)的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量3％(w/v)；配制7％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由span80与tween60按24:5(w/w)混合组成；配制3％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为20:5(v/v)。

2、将10ml上述分散相溶液缓慢加入到100ml连续相溶液中，在50℃、1500r/min搅拌下乳化2小时，得到w/o乳液。

3、将所得w/o乳液在-5℃下淬火6小时进行热致相分离。

4、将110ml上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液ph为7.8，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。

本实施例制备的多孔壳聚糖微载体为平均直径220μm的多孔微球，孔隙率为97.2％，其表面和内部具有相互联通、尺径30-70μm的孔隙，比表面积达28.8m²/g，弹性模量约为155kpa。

实施例4多孔壳聚糖微载体的制备

1、配制2％(w/v)壳聚糖(脱乙酰化程度95％，粘均分子量10万，供应厂商为)的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量2％(w/v)；配制3％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由span80与tween60按20:1(w/w)混合组成；配制2％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为14:1(v/v)。

2、将10ml上述分散相溶液缓慢加入到50ml连续相溶液中，在40℃、800r/min搅拌下乳化6小时，得到w/o乳液。

3、将所得w/o乳液在-40℃下淬火4小时进行热致相分离。

4、将100ml上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液ph为6.5，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。

本实施例制备的多孔壳聚糖微载体为平均直径200μm的多孔微球，孔隙率为98.0％，其表面和内部具有相互联通、尺径10～50μm的孔隙，比表面积达30.8m²/g，弹性模量约为145kpa。

实施例5多孔壳聚糖微载体的制备

1、配制1％(w/v)壳聚糖(脱乙酰化程度95％，粘均分子量10万，供应厂商为)的醋酸水溶液作为分散相，其中醋酸含量1％(w/v)；配制5％(w/v)乳化剂的石油醚溶液作为连续相，其中乳化剂由span80与tween60按20:1(w/w)混合组成；配制1％(w/v)氢氧化钠的乙醇/水溶液作为相转变液，其中乙醇与水的比例为14:1(v/v)。

2、将10ml上述分散相溶液缓慢加入到50ml连续相溶液中，在40℃、1000r/min搅拌下乳化4小时，得到w/o乳液。

3、将所得w/o乳液在-10℃下淬火6小时进行热致相分离。

4、将100ml上述相转变液倒入上述已淬火的乳液，在温和搅拌下进行反相再生，离心，收集沉淀，分别用水和乙醇清洗沉淀，直至洗脱液ph为7.8，将沉淀在室温下真空干燥，即得到多孔壳聚糖微载体。

本实施例制备的多孔壳聚糖微载体直径165μm的多孔微球，孔隙率为98.0％，其表面和内部具有相互联通、尺径25～70μm的孔隙，比表面积达29.1m²/g，弹性模量约为140kpa。

上述制备所得壳聚糖微载体的直径、孔隙率、尺径以及比表面积均在本发明的设定范围内，现选用实施例1a制备得到的壳聚糖微载体进行下述应用实施例以及实施例的实验。

应用实施例1多孔壳聚糖微载体用于肝细胞的三维培养

将实施例1所得多孔壳聚糖微载体以2mg/ml在rpmi-1640培养液中浸泡过夜，转入24-孔板中，再将等体积的l-02细胞(购自武汉仝干医疗科技股份有限公司)悬浮液接种入培养板中，l-02细胞的接种密度为5×10⁴细胞/孔，置于二氧化碳培养箱中(37℃、5％co2)分别培养12、24、48和72小时，用pbs溶液清洗3遍除去未粘附的细胞。采用扫描电镜(sem)观察细胞在微载体表面及内部的粘附情况，采用激光共聚焦荧光显微镜(lscm)观察细胞在微载体表面及内部的存活与增殖情况，并采用蛋白质印迹法(westernblot)和实时荧光定量多聚酶链式反应法(pcr)分别从蛋白质、基因水平评价细胞肝功能的表达情况。

本实施例获得的细胞培养结果如图2所示，实施例1所得多孔壳聚糖微载体不仅能促进l-02细胞粘附于表面，也能使细胞进入内部相互联通的孔隙生长，合成大量细胞外基质，并形成细胞-细胞连接。随着培养时间增加，微载体上的细胞数量逐渐增加，表明l-02细胞能在该微载体上很好地存活、增殖，如图4所示通过死细胞/活细胞双染试剂染色后，钙黄绿素-am可对活细胞进行绿色荧光标记，碘化丙啶对死细胞进行红色荧光标记，在共聚焦荧光显微镜下观察到微载体上的细胞基本上都是被绿色荧光标记的活细胞；此外，通过白蛋白分泌、尿素合成等评价证明经该微载体培养的l-02细胞具有正常的肝功能，如图5所示，通过酶联免疫吸附实验(elisa)试剂盒检测l-02细胞的白蛋白分泌和尿素合成，发现在微载体上培养的l-02细胞的白蛋白分泌和尿素合成量显著高于对照组，表明该微载体有利于l-02细胞肝功能的表达。

应用实施例2多孔壳聚糖微载体用于肝细胞的三维培养

将实施例2～5所得多孔壳聚糖微载体以2mg/ml在rpmi-1640培养液中浸泡过夜，转入500ml转瓶中，再将等体积的l-02细胞悬浮液接种入培养板中，置于振荡二氧化碳培养箱中(37℃、5％co2)在转速100r/min条件下培养12、24、48和72小时，用pbs溶液清洗3遍除去未粘附的细胞。采用应用实施例1所述方法对细胞培养情况、细胞功能进行评价。本实施例获得的细胞培养结果与应用实施例1基本一致，l-02细胞不仅能粘附于微载体表面，也能进入微载体内部孔隙生长，形成细胞-细胞连接，细胞数量随着培养时间增加而逐渐增加，此外，通过相关蛋白、基因表达分析证明细胞具有正常的肝功能。

应用实施例3多孔壳聚糖微载体用于其他细胞的三维培养

以应用实施例1为基础，不同点为：将l-02细胞分别换成血管内皮细胞和hela细胞，细胞培养液、接种密度也做相应的调整，其他与应用实施例1相同。本实施例获得的血管内皮细胞和hela细胞均具有良好的形态，细胞在微载体表面和内部孔隙均有分布，且能观察到大量细胞外基质以及细胞-细胞连接，细胞数量随着培养时间增加而逐渐增加，通过相关蛋白和基因表达分析表明细胞均具有正常的功能。

应用实施例4多孔壳聚糖微载体的细胞毒性与血液相容性评价

根据iso10993-5，将实施例1所得多孔壳聚糖微载体于37℃分别以0.5，1，2mg/ml在rpmi-1640培养液中浸泡72小时，10000转/分钟离心5分钟除去固体成分，将收集的上清液经0.22μm滤膜过滤，所得清液作为多孔壳聚糖微载体浸提液备用。将l-02细胞以1×10⁴细胞/孔的密度接种于96孔板，置于二氧化碳培养箱中(37℃、5％co2)培养过夜，随后去掉培养液，并加入等体积的多孔壳聚糖微载体浸提液，分别培养12、24、48与72小时后，往每个孔中加入10μlcck-8溶液(cck-8全称为cellcountingkit-8，即：细胞计数试剂盒-8，购自日本同仁dojindo)，振荡均匀，置于二氧化碳培养箱中(37℃、5％co2)培养30分钟，采用酶标仪在450nm波长处测量吸光值。通过以下公式(1)计算出细胞存活率。

其中ods、odb与odn分别表示样品组、空白对照组、阴性对照组的吸光值。对于直接接触的细胞毒性分析，将实施例1所得多孔壳聚糖微载体分别以0.5，1，2mg/ml直接加入到接种有相同数量l-02细胞的培养液中，置于二氧化碳培养箱中(37℃、5％co2)分别培养12、24、48与72小时后，采用上述同样方法检测细胞毒性。

对实施例1所得多孔壳聚糖微载体进行溶血试验，步骤如下：取健康兔子的新鲜血液，迅速加入少量肝素防止凝固，并用生理盐水稀释1.25倍备用。用生理盐水分别配制0.5mg/ml,1mg/ml与2mg/ml多孔壳聚糖微载体分散液，并浸泡过夜。将50μl稀释的血液分别加入到1.5ml上述多孔壳聚糖微载体分散液中，于37℃静置30分钟。以蒸馏水和生理盐水分别作为阳性对照和阴性对照。将上述试验样品于1000转/分钟离心5分钟，收集上清液，采用酶标仪在545nm处检测吸光值，并通过以下公式(2)计算溶血率。

溶血率＝[(ods-odn)/(odp-odn)]×100％(2)

其中ods、odp与odn分别表示样品组、阳性对照组、阴性对照组的吸光值。

细胞毒性分析结果如图3a(间接接触)与3b(直接接触)所示，所有测试组的细胞存活率都在100％以上，由此可知，不管是间接接触还是直接接触，在所测试的浓度范围内，实施例1所得多孔壳聚糖微载体均没有表现出细胞毒性，反而在一定程度上促进了细胞的增殖，具有良好的细胞相容性。血液相容性测试结果如图3c所示，0.5mg/ml,1mg/ml与2mg/ml多孔壳聚糖微载体的生理盐水分散液所对应的溶血率值分别为0.14％，0.70％与1.07％。根据标准astm-f/756-08(2000)，溶血率值低于2％时可认为非溶血，因此，在所测试的浓度范围内，实施例1所得多孔壳聚糖微载体均不导致溶血，具有良好的血液相容性。