本发明属于甾体生物技术领域，特别涉及利用一种微生物转化制备睾内酯及其衍生物的方法。
背景技术：
睾内酯（testolactone，17α-氧代-d-扩环-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮，cas：968-93-4），其化学结构式如下所示：
睾内酯也称去氢睾内酯，为睾酮的衍生物，白色或类白色结晶性粉末，是一种内源性甾体芳香酶抑制剂，通过非竞争性地结合芳香酶来抑制雄激素转化为雌激素，因而，睾内酯在临床上主要作为抗肿瘤药物使用，用于治疗绝经后妇女所发生的乳腺癌，此外，其还可用于治疗女孩性早熟和男性特发性少精子症。
目前，文献j.braz.chem.soc.，vol.14，970-974，2003报道了化学合成法制备睾内酯，采用的氧化剂有毒、易爆，对环境污染大，不符合工业化生产的环保要求，而利用微生物转化法制备睾内酯具有反应条件温和，环境友好等特点，因此更符合现代化生产理念。美国专利us2823171和us2744120分别报道了以黄体酮及其衍生物为起始底物，经柱孢霉属菌和镰刀菌为菌种转化制备睾内酯，但起始底物投料浓度仅为0.5g/l；文献researchjournalofbiotechnology.2013,8(7),56-61）报道了以黄体酮为起始底物，经腐皮镰孢霉转化成睾内酯的研究，但转化时间为240h，转化周期太长；中国专利cn103484375a公开了以雄甾-1,4-二烯-3，17-二酮（add）为底物，利用一株尖孢镰霉菌fusariumoxysporumsc1301转化制备睾内酯，起始投料浓度仅为1g/l，产率为82.9%；中国专利cn102703560a报道了以去氢表雄酮为底物，经尖孢镰刀菌和戈登氏菌两菌联用制备睾内酯，但该工艺采用静息培养方法，工艺中使用了磷酸盐，对环境污染大，且两株菌协同转化工艺较复杂，不利于工业化生产。
虽然上述微生物转化工艺取得了一定的研究成果，但利用微生物转化制备睾内酯仍然存在转化率不高，副产物多，投料浓度低，工序复杂，周期长和成本高等问题。因此，利用不同菌株转化不同底物得到更适合工业化生产的睾内酯工艺仍然需要深入研究。
技术实现要素：
为解决现有技术中微生物转化制备睾内酯技术存在转化率和投料量低、副产物多等不足，本发明的目的是提供一种腐皮镰孢霉转化制备睾内酯及其衍生物的新方法。
发明人对转化所使用的微生物种类、投料底物、菌种培养及转化条件等进行了细致的研究，获得了高效制备睾内酯及其衍生物的生物转化工艺路线。
具体地说，本发明提供的的方案是：以化合物ⅰ为起始物，利用单一菌种腐皮镰孢霉菌（拉丁命名：fusariumsolani，菌种编号：as3.2889）一次性转化得到睾内酯及其衍生物，转化过程如下式：
其中，r1基团是-h；r2基团选自-h，或r1、r2形成环氧，或r1、r2形成双键；r3选自-coch2r4；r4选自-h、-cl、-br、-ococh3和-oh中的一种。
进一步地，本发明提供的的方案，所述转化过程包括如下步骤：
（1）菌体培养：从腐皮镰孢霉菌固体斜面上切下0.5～2cm2大小的菌块接入种子培养基中，在有氧条件下，于26～37℃的温度下，150～250rpm的转速下，培养2天后移入已经灭菌的发酵培养基中，经与种子培养在相同的温度和转速培养条件下，再培养1～2天后得到培养好的菌体；
（2）菌体转化：称取一定量的化合物ⅰ加入到步骤（1）培养好的菌体中，添加增溶剂后，于26～37℃的温度下，150～250rpm的转速下，转化反应24～72h，采用tlc方法跟踪底物转化情况；
（3）转化结束后终止反应，将发酵液升温至50～70℃而使菌体灭活，用乙酸乙酯萃取发酵液中的转化产物，得到睾内酯及其衍生物。
进一步地，步骤（1）中所述种子培养基与发酵培养基中均包含葡萄糖、玉米浆和黄豆粉成分。
进一步地，步骤（2）中所述增溶剂选自浓度为0.01%～0.3%的tween-80、甲醇、乙醇、丙酮、dmf和dmso中的一种。
进一步地，上述培养瓶为500ml，培养基装液50～150ml，具体视底物情况加以增减。
本发明的有益效果是：本发明利用单一菌种腐皮镰孢霉菌（fusariumsolani，菌种保藏编号为as3.2889）将起始底物化合物i一次性转化得到睾内酯及其衍生物，具有原辅料廉价易得，底物投料量和转化率高，副产物少，工艺路线简便，生产成本低，环保压力小等优点，克服了原有生产工艺的不足，可放大进行工业化生产。
具体实施方式
现在结合实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的应用并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通都将落入本发明的保护范围。
下述实施例中，各种培养基的组分配比均为含量百分比，除特别说明之外，均为重量百分比。
实施例1：以孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮为底物，即化合物ⅰ；
腐皮镰孢霉菌培养过程：在固体斜面培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph5.1）上接种腐皮镰孢霉菌，30℃培养6天后，从腐皮镰孢霉菌斜面上切下约1cm2大小的菌块接入种子培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8）中，220rpm，28℃培养2天后以5%的移种量移入发酵转化培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8）中，220rpm，28℃培养2天后用于投料。
称取2g的起始底物孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮，投入到100ml培养好的腐皮镰孢霉菌中，加入质量浓度为0.03%的tween-80后，于30℃，220rpm转化60h，转化完成后升温至60℃终止反应，取2ml转化液，加入4ml醋酸乙酯混匀后取上层萃取液进行tlc点样分析，当在tlc上看不到底物条带时，转化结束即制得所需的睾内酯。
实施例2：以孕甾-4,9,16-三烯-3,20-二酮为底物，即化合物ⅰ；
腐皮镰孢霉菌培养过程：在固体斜面培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph5.1）上接种腐皮镰孢霉菌，28℃培养7天后，从腐皮镰孢霉菌斜面上切下约0.5cm2大小的菌块接入种子培养基（1.5%葡萄糖，2%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为5.1）中，220rpm，28℃培养2天后以5%的移种量移入发酵转化培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为5.1）中，220rpm，28℃培养2天后用于投料。
称取1g起始底物孕甾-4,9,16-三烯-3,20-二酮，投入到100ml培养好的腐皮镰孢霉菌中，加入质量浓度为0.1%的dmf摇匀后于28℃～30℃，220rpm转化48h，转化完成后升温至60℃终止反应，取2ml转化液，加入4ml醋酸乙酯混匀后取上层萃取液进行tlc点样分析，当在tlc上看不到底物条带时，转化结束即制得所需的睾内酯衍生物。
实施例3：以9,11-环氧-孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮为底物，即化合物ⅰ；
腐皮镰孢霉菌培养过程：在固体斜面培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph5.1）上接种腐皮镰孢霉菌，28℃培养7天后，从腐皮镰孢霉菌斜面上切下约1cm2大小的菌块接入种子培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%蛋白胨，0.5%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8）中，200rpm，28～30℃培养2天后以5%的移种量移入发酵转化培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为5.1）中，200rpm，30℃培养2天后用于投料。
称取0.5g的起始底物9,11-环氧-孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮，加入质量浓度为0.03%的tween-80中，加入到100ml培养好的腐皮镰孢霉菌中，于28℃～30℃，200rpm转化60h，转化完成后升温至60℃终止反应，取2ml转化液，加入4ml醋酸乙酯混匀后取上层萃取液进行tlc点样分析，当在tlc上看不到底物条带时，转化结束即制得所需的9,11-环氧睾内酯。
实施例4：以9,11-环氧-21-羟基-孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮为底物，即化合物ⅰ；
腐皮镰孢霉菌培养过程：在固体斜面培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph5.1）上接种腐皮镰孢霉菌，28℃培养7天后，从腐皮镰孢霉菌斜面上切下约1cm2大小的菌块接入种子培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，2%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为5.1）中，220rpm，28～30℃培养2天后以5%的移种量移入发酵转化培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8）中，220rpm，30℃培养2天后用于投料。
称取1g的起始底物9,11-环氧-21-羟基-孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮，加入到100ml培养好的腐皮镰孢霉菌中，添加质量浓度为0.03%的甲醇，于32℃，200rpm转化60h，转化完成后升温至60℃终止反应，取2ml转化液，加入4ml醋酸乙酯混匀后取上层萃取液进行tlc点样分析，当在tlc上看不到底物条带时，转化结束即制得所需的9,11-环氧睾内酯。
实施例5：以9,11-环氧-21-氯-孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮为底物，即化合物ⅰ；
腐皮镰孢霉菌培养过程：在固体斜面培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph5.1）上接种腐皮镰孢霉菌孢子，28℃培养7天后，从腐皮镰孢霉菌斜面上切下约2cm2大小的菌块接入种子培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%酵母粉，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为5.1）中，200rpm，28℃培养2天后以5%的移种量移入发酵转化培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%酵母粉，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8～5.1）中，200rpm，28～30℃培养1天后用于投料。
称取1g的起始底物9,11-环氧-21-氯-孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮，投入到100ml培养好的腐皮镰孢霉菌中，添加质量浓度为0.2%的dmf后，于28℃～30℃，200rpm转化48h，转化完成后升温至60℃终止反应，取2ml转化液，加入4ml醋酸乙酯混匀后取上层萃取液进行tlc点样分析，当在tlc上看不到底物条带时，转化结束即制得所需的9,11-环氧睾内酯。
实施例6：以9,11-环氧-21-溴-孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮为底物，即化合物ⅰ；
腐皮镰孢霉菌培养过程：在固体斜面培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph5.1）上接种腐皮镰孢霉菌孢子，28℃培养7天后，从腐皮镰孢霉菌斜面上切下约1cm2大小的菌块接入种子培养基（1%葡萄糖，2%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8～5.1）中，200rpm，30℃培养2天后以5%的移种量移入发酵转化培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8～5.1）中，200rpm，30℃培养2天后用于投料。
称取1g起始底物9,11-环氧-21-溴-孕甾-4,16-二烯-3,20-二酮，投入到100ml培养好的腐皮镰孢霉菌中，加入质量浓度为0.1%的dmso后，于28℃～30℃，220rpm转化48h，转化完成后升温至60℃终止反应，取2ml转化液，加入4ml醋酸乙酯混匀后取上层萃取液进行tlc点样分析，当在tlc上看不到底物条带时，转化结束即制得所需的9,11-环氧睾内酯。
实施例7：以21-溴-孕甾-4,9,16-三烯-3,20-二酮为底物，即化合物ⅰ；
腐皮镰孢霉菌培养过程：在固体斜面培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph5.1）上接种腐皮镰孢霉菌孢子，28℃培养7天后，从腐皮镰孢霉菌斜面上切下约2cm2大小的菌块接入种子培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%酵母浸粉，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8～5.1）中，200rpm，28℃～30℃培养2天后以5%的移种量移入发酵转化培养基（2%葡萄糖，2%玉米浆，1%酵母浸粉，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8～5.1）中，200rpm，28～30℃培养2天后用于投料。
称取2g的起始底物21-溴-孕甾-4,9,16-三烯-3,20-二酮，加入到150ml培养好的腐皮镰孢霉菌中，添加质量浓度为0.05%的乙醇，于28～30℃，200rpm转化60h，转化完成后升温至60℃终止反应，取2ml转化液，加入4ml醋酸乙酯混匀后取上层萃取液进行tlc点样分析，当在tlc上看不到底物条带时，转化结束即制得所需的睾内酯中间体。
实施例8：以21-氯-孕甾-4,9,16-三烯-3,20-二酮为底物，即化合物ⅰ；
腐皮镰孢霉菌培养过程：在固体斜面培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph5.1）上接种腐皮镰孢霉菌孢子，28℃培养7天后，从腐皮镰孢霉菌斜面上切下约2cm2大小的菌块接入种子培养基（2%葡萄糖，1.5%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8～5.1）中，200rpm，28℃～30℃培养2天后以5%的移种量移入发酵转化培养基（2%葡萄糖，1.5%玉米浆，1%蛋白胨，0.25%黄豆粉，0.1%k2po4，ph为4.8～5.1）中，200rpm，28～30℃培养2天后用于投料。
称取1g起始底物21-氯-孕甾-4,9,16-三烯-3,20-二酮，加入到120ml培养好的腐皮镰孢霉菌中，添加质量浓度为0.1%的dmf后于28～30℃，220rpm转化48h，转化完成后升温至60℃终止反应，取2ml转化液，加入4ml醋酸乙酯混匀后取上层萃取液进行tlc点样分析，当在tlc上看不到底物条带时，转化结束即制得所需的睾内酯中间体。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。