本发明属于蛙类分子遗传学领域，具体涉及棘胸蛙抗菌肽spinosan-d原核表达的技术方法。
背景技术：
：随着青霉素等传统抗生素的大规模使用和不恰当应用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，临床上已经出现了大量可以完全耐受青霉素等传统抗生素的病原体微生物。传统的抗生素耐药问题的日益严重，已有的抗生素对这些耐药性病原体微生物已经无能为力，因此对难诱导微生物产生耐受性的新型抗生素的需求变的越来越迫切。抗菌肽(antibacterialpeptides，ap)又叫抗微生物肽、肽抗生素，是广泛存在于生物界中的生物体应对外界病原物侵染而产生的一类具有强抗菌作用的阳离子多肽，是生物先天免疫的重要组成成分，其分子小，性能稳定，具有较强的广谱抗菌能力。抗菌肽作用于微生物膜(细胞膜、外膜)，破坏其屏障而达到杀伤细菌细胞的效果。迄今已发现了上百种抗菌肽，广泛分布于病毒、细菌、植物、昆虫、软体动物、甲壳动物、两栖动物、鱼类、鸟类及哺乳动物等生物体内。抗菌肽具有传统抗生素无法比拟的优越性，如不会诱导抗药菌株的产生，并且可能与抗生素联合使用，在耐抗生素病原株不断出现，病毒和肿瘤等疾病对人类健康造成极具威胁的今天，抗菌肽将有望成为新一代的抗病原微生物及肿瘤的药物。两栖类动物享有“生物活性肽的巨大储备库”的美称，是极具有研究开发潜力的资源宝库。由于两栖动物皮肤裸露，为抵御病原微生物的侵染，两栖类已经成功进化出了一套有效的皮肤防御系统。哺乳动物与之相比，无论在种类还是数量方面都是无法匹敌的。由于抗菌肽天然资源来源极其有限，分离提取有一定困难，对技术和成本要求高；而超过10个氨基酸残基多肽的化学合成成本很高，用于研究，较难规模化生产。相比之下，技术成本低，回收效率高的基因工程表达法成为大量生产的首选解决方案。本实验室前期已利用分子生物技术筛选并获得四种不同的棘胸蛙皮肤抗菌肽，经比对选择抗菌效果最好的spinosan-d进行原核表达研究。该spinosan-d的相应内容在文章《cdnacloningandfunctionalcharacterisationoffourantimicrobialpeptidesfrompaaspinosa》被告知。20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过40多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容，通过基因重组技术，可以由微生物进行生产，这是基因工程技术的最大贡献。随着重组dna技术的迅猛发展，对于基因克隆表达问题的研究也日益深入，外源基因表达系统的研究也日益深入，主要分为原核表达系统和真核表达系统，而以大肠杆菌为代表的原核表达系统具有高效、方便操作等特点而被广泛应用。原核表达系统主要是将已克隆入目的基因片段的载体转化细菌，通过诱导表达、纯化获得所需要的目的蛋白。该系统是最早被采用、目前研究得最为清楚的表达系统，其优点是能够在较短的时间内获得基因表达产物，且所需成本相对较低，故为外源基因的首选表达系统。其中由于对大肠杆菌的背景了解甚多，构建表达系统的经验丰富，材料也多，因此将其作为首选的表达系统。由于抗菌肽对宿主菌大肠杆菌具有毒性，会反馈性地抑制宿主细胞的增值，因此不能直接运用大肠杆菌系统进行表达，从而影响抗菌肽的进一步表达；并且抗菌肽对蛋白酶非常敏感，容易被大肠杆菌细胞内的酶降解，难以实现大量表达。目前采用融合表达的方式已完成多种抗菌肽在大肠杆菌中的表达，大肠杆菌的基因克隆表达系统成熟完善，具有生长快、成本低和表达量高、遗传稳定等优势，是原核表达系统的代表，应用也最多。但抗菌肽对大肠杆菌有毒性，所以要进行融合表达，这有利于重组蛋白的高水平表达和蛋白的纯化。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d原核表达的技术方法，以实现低成本且高效地得到大量棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d，为抗菌肽的大规模制备，开发和利用该抗菌肽提供契机。为了解决上述技术问题，本发明一种棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d，编码该棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d成熟区的核苷酸序列如seqidno:1所述。备注说明：在该基因序列前后分别加上酶切位点和甲酸切割位点及终止密码子后再进行原核表达。作为的棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的改进：该抗菌肽为23个氨基酸残基，分子量为2753da，理论等电点为4.51，不稳定性指数为12.82，有较强的两亲性。此23个氨基酸残基的序列为：meelykeiddcvnygncktlklm。本发明还同时提供了上述棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的原核表达方法，编码该棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的原核表达按以下步骤实现：1)、将棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d成熟区基因序列前后分别加入酶切位点ecorⅰ(gaattc)和hindⅲ(aagctt)以及甲酸切割位点(gatccg)及终止密码子(taa)；以此作为pcr模板；备注说明：上述加入酶切位点ecorⅰ(gaattc)和hindⅲ(aagctt)以及甲酸切割位点(gacccg)及终止密码子(taa)的基因序列为(seqidno:2)：gaattcgatccgatggaggagctctacaaagaaatcgacgattgtgtgaattatggcaattgtaaaaccttgaaactcatgtaaaagctt；基因模板通过可宝生物工程(大连)有限公司合成，提供的基因模板合在载体t-vectorpmdtm19(simple)上；2)、设计infusion引物，pcr扩增得到infusion克隆连接的基因片段(该基因片段前后带有15bp与目的载体的2个酶切位点处同源的基因片段)；所述infusion引物：上游引物：atcggatccgaattcgatccgatggaggagctctacaaa下游引物：tgcggccgcaagcttttacatgagtttcaaggttttacaattgccataa；对应的序列为：前：atcggatccgaattc后：aagcttgcggccgca；3)、用限制性内切酶ecorⅰ和hindⅲ切割质粒pet-32a，回收双酶切后的质粒；4)、通过设计infusion体系，使双酶切后的质粒pet-32a和经pcr后得到的基因进行反应，以获得pet-32a-spionsan-d；5)、棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d原核表达诱导：将pet-32a-spionsan-d转化至感受态细胞e.colibl21(de3)plyss，挑取含氨苄霉素和氯霉素(氨苄霉素的浓度为100mg/ml，氯霉素的浓度为30mg/ml)的lb固体培养基上的阳性菌；将所述阳性菌进行原核表达诱导：温度为16℃～37℃，iptg浓度为0.1mmol/l～1.0mmol/l，诱导时间4h～16h，iptg浓度0.1～1.0mmol/l。备注说明：通过对比12％的sds-page电泳检测结果确定最佳诱导表达条件。具体而言：温度，iptg浓度，诱导时间分别都有3个条件，分别为：16℃，28℃，37℃；iptg浓度分别为0.1mmol/l，0.5mmol/l，1.0mmol/l；诱导时间分别为4h，8h，过夜(12-16h)，总共27个条件诱导表达。作为本发明的棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的原核表达方法的改进：所述步骤5)的最佳诱导表达条件为：温度：37℃，诱导时间4h，转速：160rpm/min，iptg浓度：1mmol/l。作为本发明的棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的原核表达方法的改进，还包括以下步骤：所述步骤4)之后还进行了如下的步骤：将pet-32a-spionsan-d转化至感受态细胞dh5α，挑取含氨苄霉素(氨苄霉素浓度为100mg/ml)的lb固体培养基上的阳性菌进行菌落pcr鉴定(并送上海生工生物有限公司测序)；备注说明：此步骤用于确定是否已成功构建重组质粒pet-32a-spionsan-d；鉴定合格的才进行后续步骤。作为本发明的棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的原核表达方法的进一步改进：还包括以下步骤：在步骤5)的棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d原核表达诱导之前先进行蛋白的初步诱导：将所述阳性菌在摇床中37℃、200rpm/min液体扩大培养至菌的od600＝0.6-0.8，进行初步诱导，条件分别为37℃、6h、160rpm/min、1mmol/l的iptg，并相应地设置对照组，对照组不加iptg；取诱导完成的菌液，离心去上清，用10ul的无菌水吹散，加入40ul的5×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，12000rpm/min条件下离心5min，收集上清进行12％的sds-page电泳检测。说明：此步骤进行蛋白的初步诱导，通过蛋白跑胶，确定蛋白能否被诱导表达出来，再进行后续实验的最佳诱导表达条件的筛选。在本发明中，获得了pet-32a-spionsan-d能说明重组质粒构建成功，蛋白跑胶后在目的蛋白大小处有条带能说明表达成功。作为本发明的棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的原核表达方法的进一步改进：还包括以下步骤：将步骤5)诱导表达的所得物进行裂解(即，在最佳诱导表达条件下表达蛋白，裂解诱导蛋白后的细菌)，纯化(用钴柱蛋白纯化试剂盒对含his标签的融合蛋白进行纯化)，去甲酸(体积浓度40％的甲酸切割融合头，除去甲酸)；对除去甲酸后的棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d用浓度为10mmol/lpbs溶解，以浓度为10mmol/lpbs为阴性对照，氨苄霉素为阳性对照，检测棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的抗菌活性。本发明通过infusion克隆技术得到pet-32a-spionsan-d(步骤1)～步骤4))，将其转入感受态细胞e.colibl21(de3)plyss中，通过设置不同温度、iptg浓度和诱导时间诱导重组菌表达，得到棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d原核表达的最佳诱导表达条件；该最佳诱导表达条件为：温度：37℃，诱导时间：4h，转速：160rpm/min，iptg浓度：1mmol/l。本发明在最佳诱导表达条件下表达得到大量融合蛋白，对融合蛋白进行纯化和融合头的切割，除去甲酸后通过抑菌圈试验观察表达出的蛋白的抑菌效果。综上所述，本发明公开了棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的成熟肽编码序列基因及其原核表达的技术方法。编码棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的核酸序列如seqidno:1所示。编码棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d的原核表达按以下步骤实现：通过infusion克隆技术得到pet-32a-spionsan-d，将其转入感受态细胞e.colibl21(de3)plyss中，通过设置不同温度、iptg浓度和诱导时间诱导重组菌表达，得到棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d原核表达的最佳诱导表达条件。在最佳诱导表达条件下表达得到大量融合蛋白，对融合蛋白进行纯化和甲酸切割融合头，去除甲酸后，抑菌圈试验结果表明表达出的蛋白有抑菌效果。本发明通过对棘胸蛙皮肤抗菌肽进行原核表达的研究，采用infusion克隆技术构建重组质粒，避免了双酶切目的基因回收效率过低，进而导致重组质粒难以构建的问题；从而期待高产率且低成本地得到大量棘胸蛙皮肤抗菌肽不仅具有重要理论意义，同时为棘胸蛙皮肤抗菌肽的实际生产和临床应用提供理论依据，使之为新一代抗菌、抗癌药物打下基础，具有广阔的应用前景。附图说明下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图1为抑菌圈实验结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：将棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d成熟区基因序列前后分别加入酶切位点ecorⅰ(gaattc)和hindⅲ(aagctt)以及甲酸切割位点(gacccg)及终止密码子(taa)。seqidno:1是棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d成熟区基因序列前后加完各位点后的基因序列；上述加入酶切位点ecorⅰ(gaattc)和hindⅲ(aagctt)以及甲酸切割位点(gatccg)的基因序列为：gaattcgatccgatggaggagctctacaaagaaatcgacgattgtgtgaattatggcaattgtaaaaccttgaaactcatgtaaaagctt；以其作为pcr模板。spionsan-d基因通过生物公司合成，提供的基因模板在载体t-vectorpmdtm19(simple)上。1、目的基因片段制备设计infusion引物：上游引物：atcggatccgaattcgatccgatggaggagctctacaaa下游引物：tgcggccgcaagcttttacatgagtttcaaggttttacaattgccataa；以含目的基因的载体t-vectorpmdtm19(simple)为模板，用上游引物和下游引物、2×estaqmastermix(dye)，pcr扩增得到目的序列。pcr条件：94℃预变性5min，35次循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s；72℃终延伸10min，4℃保存。扩增体系如下：试剂使用量(ul)ddh2o9.52×estaqmastermix(dye)12.5上游引物(100um)1下游引物(100um)1模板(100um)1总量25目的序列：(15bp)atcggatccgaattcgatccgatggaggagctctacaaagaaatcgacgattgtgtgaattatggcaattgtaaaaccttgaaactcatgtaaaagcttgcggccgca(15bp)。2、载体的制备对pet-32a载体用ecorⅰ和hindⅲ进行双酶切，双酶切体系如下：试剂使用量(ul)ddh2o2110×quickcutbuffer5pet-32a质粒(50ng/ul)20ecorⅰ2hindⅲ2总量5037℃酶切1h。将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对双酶切产物进行切胶回收。即，满足双酶切后跑出的条带与未双酶切的对照组相比条带大小变小，判定为pet-32a质粒已被双酶切，可进行切胶回收。3、in-fusion基因克隆反应in-fusion基因克隆反应中加入制备好的载体(上述步骤2所得，linearizedvector)，加的量约100ng，制备好的目的基因片段(上述步骤1所得，linearizedvector)约50ng。回收后的载体和目的基因的浓度分别为14.3ng/ul，58.1ng/ul，in-fusion反应体系为：试剂使用量(ul)5×in-fusionhdenzymepremix2linearizedvector6.9pcrfragment0.8ddh2o0.3总量10反应条件：50℃反应15min，再置冰上。4、转化取1ul反应后的体系(步骤3所得)转化至100ul在冰上融化的感受态细胞dh5α中，冰中放置30min，42℃放置45s，冰中放置1-2min，加入无任何抗生素的液体培养基(lb液体培养基)至终体积1ml，37℃，200rpm在摇床中振荡培养1h。室温下，12000rpm离心1min，弃900ul的上清，混匀后取100ul菌液涂布于含氨苄霉素(氨苄霉素浓度为100mg/ml)的lb固体培养基上，37℃倒置过夜培养。5、菌落的pcr鉴定挑取步骤4所得的单菌落用2×estaqmastermix(dye)、s.tag/t7ter通用引物进行pcr鉴定，将阳性克隆送上海生工生物公司测序；在氨苄培养基上挑取阳性菌，菌落pcr后条带大小与所需条带大小(为108bp)相符，测序后得到的条带基因与目的基因(如步骤1)的目的序列所述)一致的即证明重组质粒为pet-32a-spionsan-d。6、初步诱导表达若测序结果准确，将pet-32a-spionsan-d转化入表达宿主感受态细胞e.colibl21(de3)plyss中，挑取单菌落进行扩大培养，将菌接种于含氨苄霉素和氯霉素(氨苄霉素的浓度为100mg/ml，氯霉素的浓度为30mg/ml)的1mllb液体培养基中，37℃振荡培养至od600＝0.6-0.8，实验组分为第一组和第二组，第一组为加入iptg至终浓度为1.0mm，37℃诱导6h，第二组为加入iptg至终浓度为0.1mm，16℃过夜(即，12-16h)诱导，同时分别在37℃和16℃培养未用iptg的菌作为对照组。室温下12000rpm，5min离心取菌体，弃上清，用40ul的无菌水重新悬浮菌体，加入10ul5×上样缓冲液，100℃煮沸10min，收集上清进行12％sds-page电泳检测。实验组在目的蛋白大小处(21.2kda)都有条带，对照组都无。根据该电泳检测结果可得知：棘胸蛙皮肤抗菌肽spionsan-d能成功被诱导出。7、棘胸蛙抗菌肽spionsan-d原核表达的最佳诱导表达条件的筛选将pet-32a-spionsan-d转化入表达宿主感受态细胞e.colibl21(de3)plyss中，挑取单菌落进行扩大培养，将菌接种于含氨苄霉素和氯霉素(氨苄霉素的浓度为100mg/ml，氯霉素的浓度为30mg/ml)的100mllb液体培养基中，37℃振荡培养至od600＝0.6-0.8，通过设置不同的诱导条件筛选棘胸蛙抗菌肽spionsan-d的最佳原核表达条件，分别设置不同的温度、iptg浓度和诱导时间，温度设置为16℃，28℃，37℃，iptg浓度设置为0.1mm，0.5mm，1.0mm，诱导时间设置为4h，8h，过夜。诱导完成后，室温下12000rpm，5min离心取菌体，弃上清，用40ul的无菌水重新悬浮菌体，加入10ul5×上样缓冲液，100℃煮沸10min，收集上清进行12％sds-page电泳检测。经各个条件对蛋白进行诱导后，观察蛋白跑胶后的结果，比较在目的蛋白大小处(21.2kda)条带的宽度，条带宽度越大表明在该条件下表达出的蛋白越多。最后结果显示在条件37℃，4h，iptg浓度为1mmol/l，转速为160rpm诱导下蛋白表达量最多。因此，最佳诱导表达条件为：温度：37℃，时间：4h，转速：160rpm/min，iptg浓度为1mmol/l。8、带有his标签的融合蛋白的纯化用histalontmgravitycolumnpurificationkitusermanual对带有his标签的融合蛋白进行纯化，收集经最佳诱导表达条件表达后的200mg的湿重菌(经最佳诱导表达条件诱导bl21大肠杆菌后，12000rpm离心2min，去除上清液，得到菌体沉淀)，加入4mlhistalon*tractorbuffer，温和地打散细菌使之悬浮，加入2ul的dnaseⅰ，温和地混合，在冰上静置15min，10000rpm离心20min，收集上清液即为蛋白样品。用5-10ml的equilibrationbuffer平衡重力柱，加入蛋白样，加入8ml的equilibrationbuffer，再加7ml的washbuffer洗涤重力柱，最后用5-8ml的elutionbuffer洗脱带有his标签的目的蛋白。备注：dnaseⅰ可购自takara宝生物大连生物有限公司。9、甲酸切割融合蛋白的融合头收集纯化完的融合蛋白，浸泡于40％的甲酸溶液37℃切割36h，去除溶液中的甲酸。运用氮吹仪除去蛋白溶液中的甲酸，将液体吹干剩余蛋白晶体，用10mmol/l的pbs溶解后继续用氮吹仪将液体吹干，重复洗涤3次以充分去除蛋白溶液中的甲酸。所得的蛋白中含有抗菌肽，用于下述的对抗菌肽进行活性检测。实施例2、原核表达棘胸蛙抗菌肽spionsan-d抗菌活性的检测挑取试验菌株(大肠杆菌)均匀涂布于lb固体培养基上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，分别在不同的滤纸片上滴加10ul原核表达后的抗菌肽(实施例1所得)、10ulpbs溶液(pbs浓度为10mmol/l)和10ul氨苄霉素(amp浓度为1mg/ml)，于37℃倒置过夜培养，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈。根据图1，我们得知用上述原核表达方法能得到具有抗菌活性的抗菌肽。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表<110>浙江师范大学<120>棘胸蛙皮肤抗菌肽spinosan-d及其原核表达法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>69<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atggaggagctctacaaagaaatcgacgattgtgtgaattatggcaattgtaaaaccttg60aaactcatg69<210>2<211>90<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaattcgatccgatggaggagctctacaaagaaatcgacgattgtgtgaattatggcaat60tgtaaaaccttgaaactcatgtaaaagctt90当前第1页12