一种快速鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化的方法与流程

本发明总体上涉及生命科学领域，具体涉及一种快速鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化的方法。该方法采用逆转录pcr技术结合实时荧光定量pcr定量检测细胞内特定mrna的水平，可实现视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化的快速鉴定。
背景技术：
：目前常规的细胞分化状态的检验方法为形态学方法。其工作方法为将培养瓶置于显微镜下观察。对于视网膜色素上皮细胞，其在显微镜下的典型形态为细胞呈现致密的单层铺路石状，且能观察到细胞中的黑色素颗粒。若细胞呈长梭状且无黑色素颗粒，表明细胞状态较差，分化异常。目前常规的形态学检验方法仍然存在两个不足：(1)细胞异常分化是一个由量变引起质变的过程，初期往往只有少量的异常分化的细胞，观察细胞形态时极易忽略，发现细胞分化异常时细胞的异常分化状态往往已经相当严重；(2)眼球成纤维细胞是获取视网膜色素上皮细胞过程中最容易引入的杂细胞之一。而异常分化的细胞与成眼球纤维细胞的形态相似，仅靠在显微镜下观察细胞形态难以辨别。因此需要一种快速鉴定视网膜色素上皮细胞分化状态的方法，保证对视网膜色素上皮细胞质量的做出及时准确的判断，满足科研、生产等领域对视网膜色素上皮细胞质量稳定性的要求。技术实现要素：本发明的一个方面，提供了一种鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化的方法，包括：(a)提取rpe细胞中的总rna；(b)利用提出而来的总rna反转录合成cdna；(c)通过pcr检测rpe细胞中基因creb5的表达。其中，在检测基因creb5表达中所用的creb5上游引物序列为ccctgcccaaccctacaatg(seqidno:1)；creb5下游引物序列为ggaccttgcatccccatgat(seqidno:2)。在一个实施例中，所述步骤(a)中提取rpe细胞中的总rna的方法包括：裂解rpe细胞，分离rpe细胞的总rna溶液，沉淀、洗涤rna，风干以及溶解rna。在一个实施例中，裂解rpe细胞所用的试剂为trizol。在一个实施例中，分离rpe细胞总rna溶液所用的试剂为氯仿。在一个实施例中，所述分离rpe细胞总rna溶液所用的方法为高速离心后取上清液。在一个实施例中，所述沉淀、洗涤rna所用的试剂包括异丙醇和乙醇，所述乙醇优选为75％乙醇。在一个实施例中，沉淀、洗涤rna均采用高速冷冻离心后弃掉上清的方法。在一个实施例中，溶解rna的溶剂为depc处理过的水。在一个实施例中，所述步骤(2)所述合成cdna的方法为反转录pcr法。其中，步骤(2)中所述反转录pcr所配置的反映体系至少包括以下组分：模板(提取而来的总rna)、随机引物、4种脱氧核糖核苷酸。在本发明中，步骤(3)中所述pcr法包括qrt-pcr。当检测结果显示rq值小于0.7时，判断所测样品为正常分化的rpe细胞；当检测结果显示rq值大于2时，判断所测样品为异常分化细胞；当检测结果显示rq介于0.8-1.8时，判断所测样品混入了眼球成纤维细胞(ef)。在一个具体实施例，鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化的方法，具体步骤如下：首先，提取rpe细胞中的总rna：(1)裂解rpe细胞：将rpe细胞转移至1.5ml离心管，加入trizol，反复吹打细胞使之完全裂解；(2)分离rpe细胞的总rna溶液：加入氯仿剧烈震荡至呈乳白色，室温静置分层，放入高速离心机离心后移取上层液体至新的1.5ml离心管中；(3)沉淀与分离：在新的离心管中加入冷的异丙醇，震荡使rna析出，放入高速离心机离心后弃掉上清，留下管底的沉淀；(4)洗涤与分离：加入75％酒精震荡，放入高速离心机离心后弃掉上清；(5)风干：室温挥发掉酒精；(6)溶解：用depc水溶解rna；(7)测定：用酶标仪检测260nm下的吸光度(记为a)，计算rna浓度；然后，利用提出而来的总rna反转录合成cdna。(8)根据rna浓度计算2μgrna所需溶液体积。在冰上按照下表在pcr管中配制反应体系。模板rna总rna2μg引物随机引物1μl水depc处理过的水补充至12μl总体积12μl将反应管混合，离心，放入pcr仪中,65℃,5min,立刻放回冰上。(此步骤目的为打开rna的二级结构)(9)在冰上按照下表继续在pcr管中加入如下试剂：5×反应缓冲液4μlribolockrnaseinhibitor(20u/μl)1μl10mmdntpmix2μlrevertaidm-mμlvrt(200u/μl)1μl总体积20μl(10)混合后在pcr仪中孵育25℃5min,42℃90min,70℃5min,4℃forever。(11)荧光定量pcr样品模板工作液的配制：另取一0.2mlpcr管，加入90μldepc水，取10μl反转录后的cdna至此pcr管中混匀即可。最后，采用实时荧光定量pcr仪(qrt-pcr)检测rpe细胞基因表达(12)取出保存于-20℃的superrealpremixplus(sybrgreen)，室温解冻。(13)打开qrt-pcr仪，按下表设置pcr反应程序(14)取出各引物放在室温下解冻。在每个200μlpcr管中配制pcr反应体系。其中，引物系列如。(15)pcr反应体系配好后，将pcr管放入rt-pcr仪中运行设置好的程序。(16)pcr反应结束后导出实验数据，分析mrna(即cdna)水平，据此判断视网膜色素上皮细胞是正常分化的细胞还是异常分化的细胞。本发明的一个具体实施例中，进一步包括，步骤(1)中所用的rpe细胞，其培养过程中所用的培养基的配方中包括以下组分：500ml低限量eagle培养基、5ml的n1添加剂、5ml的谷氨酰胺、5ml的青霉素-链霉素、5ml非必需氨基酸、125mg的牛磺酸、10μg的氢化可的松、0.0065μg的三碘甲状腺原氨酸、50ml的灭活胎牛血清。本发明的一个具体实施例中，进一步包括，所述步骤(1)中所用的rpe细胞，其培养过程包括以下步骤：(1)p0代培养：从眼球部位分离出rpe细胞，将分离得到的rpe细胞接种至75cm2的培养瓶中，用上述培养基培养15天后传代至p1；(2)p1代培养：继续用b所述培养基培养15天以后传代；3.p2代培养：继续用b所述培养基培养15天，消化分离后即可用于qrt-pcr检测。在本发明的一个具体实施例中，进一步包括，所述trizol购自lifetechnologiescorporation，货号为：15596018。在本发明的一个具体实施例中，进一步包括，所采用的sybrgreen试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公式，货号为：fp205-02。在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述mrna分析包括以下几个方面：(1)分析方法采用相对定量(δδct)法(2)计算所采用的内部参照基因为管家基因——gapdh(3)计算所采用的参照细胞为眼球部位的成纤维细胞(ef)在本发明的另一方面，公开了基因creb5在鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化中的用途。本发明还公开了检测基因creb5的试剂在鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化中的用途。其中，所述检测基因creb5的试剂包括序列为ccctgcccaaccctacaatg(seqidno:1)的creb5上游引物和序列为ggaccttgcatccccatgat(seqidno:2)的creb5下游引物中的一种或多种。本发明还公开了一种试剂盒，包括序列为ccctgcccaaccctacaatg(seqidno:1)的creb5上游引物和序列为ggaccttgcatccccatgat(seqidno:2)的creb5下游引物中的一种或多种，所述试剂盒用于鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化。本发明还公开了一对寡核苷酸，其序列如ccctgcccaaccctacaatg(seqidno:1)和ggaccttgcatccccatgat(seqidno:2)所示。有益效果本发明主要基于在mrna水平上检测视网膜色素上皮细胞特定基因的表达，准确快速判断视网膜色素上皮细胞的分化状态，以保证对rpe生产过程及时、准确、有效地控制。本发明解决了现有技术的缺陷，具有以下有益效果：(1)本发明提供的一种快速鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化的方法，该方法步骤简单快速，快速获得检验结果且具有很好的准确度，为控制生产、科研细胞培养过程中的rpe质量提供了新方法。(2)本发明提供的一种快速鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化的方法，该方法在细胞异常分化的初期阶段就能检测到异常，弥补了形态学检验结果滞后的不足。(3)本发明提供的一种快速鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化的方法，该方法能有效区分细胞培养异常是由成纤维细胞的混入还是由异常分化引起的，以便为后续的处理提供参考。附图说明图1示出creb5在不同类型的细胞中的相对表达量。图2示出creb5与其它基因在不同细胞正相对表达量结果比较。图3示出采用本专利所用引物与其它引物后creb5相对表达量。图4示出采用本专利所用引物与其它引物后creb5扩增产物的熔解曲线的结果比较。具体实施方式下面将通过具体描述，对本发明作进一步的说明。除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解相同的含义。如本文所用，“creb5”、“campresponsiveelementbindingprotein5”“creb-5”、“cre-bpa”、“camp反应元件结合蛋白5”和“环磷腺苷效应元件结合蛋白”可互换，其基因id为geneid:9586。实施例通过以下实施例进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。实施例1：检测cdna中creb5基因的相对量并以此判断rpe细胞的分化状态提取rpe细胞中的总rna；利用提出而来的总rna反转录合成cdna；采用实时荧光定量pcr仪(qrt-pcr)检测cdna中creb5基因的相对量并以此判断rpe细胞的分化状态。其中，cdna中creb5基因的相对量(rq)指待测样品的cdna中creb5与参照样品(ef)的cdna中creb5量的比值。当检测结果显示rq值小于0.7时，判断所测样品为正常分化的rpe细胞；当检测结果显示rq值大于2时，判断所测样品为异常分化细胞；当检测结果显示rq介于0.8至1.8时，判断所测样品混入了眼球成纤维细胞(ef)。具体实验如下：首先，提取rpe细胞中的总rna：(1)将1.0×106rpe细胞转移至1.5ml离心管，加入1mltrizol，反复吹打细胞完全裂解；(2)加入200μl氯仿剧烈震荡至呈乳白色，室温静置2分钟；(3)放入离心机，于4℃14000g，离心15分钟；(4)取出离心管，小心移取上层液体至新的1.5ml离心管中；(5)在新的离心管中加入冷的500μl异丙醇，上下颠倒使rna析出；(6)于4℃，14000g，离心10分钟；(7)弃掉上清，用500μl的75％乙醇混匀，于4℃14000g离心3分钟。弃掉上清，室温挥发掉乙醇，用20μldepc水溶解rna；(8)用酶标仪检测260nm下的吸光度(记为a)。根据公式(rna浓度＝40×a/1000，单位：μg/μl)计算rna浓度(记为c)。其次，合成cdna：(1)根据rna浓度计算2μgrna所需溶液体积。在冰上按照下表1在pcr管中配制反应体系。表1合成cdna的配制反应体系模板rna总rna2μg(体积：2/cμl)引物随机引物1μl水depc处理过的水补充至12μl总体积12μl(2)回冰上。(此步骤目的为打开rna的二级结构)(3)在冰上按照下表2继续在pcr管中加入如下试剂：表25×反应缓冲液4μlribolockrnaseinhibitor(20u/μl)1μl10mmdntpmix2μlrevertaidm-mμlvrt(200u/μl)1μl总体积20μl(4)混合后在pcr仪中孵育25℃5分钟，42℃90分钟，70℃5分钟，4℃长期储存。(5)荧光定量pcr样品模板工作液的配制：另取一个0.2mlpcr管，加入90μldepc水，取10μl反转录后的cdna至此pcr管中混匀即可。最后，采用rt-pcr仪检测rpe细胞基因表达(1)取出保存于-20℃的superrealpremixplus(sybrgreen)，室温解冻。(2)打开rt-pcr仪，按下表3设置pcr反应程序。表3(3)取出各引物放在室温下解冻。在每个200μlpcr管中配制pcr反应体系。(4)pcr反应体系配好后，将pcr管放入rt-pcr仪中运行设置好的程序。(5)pcr反应结束后导出实验数据，分析mrna(即cdna)水平，据此判断视网膜色素上皮细胞是正常分化的细胞还是异常分化的细胞。(6)如图1所示，a、b为正常分化的rpe细胞，c、d为异常分化的rpe细胞，e为混入了眼球成纤维细胞的rpe细胞。结果表明受试的5个样品中，采用本发明的方法，正常分化细胞中creb5的基因表达量均在0.5以下，而当rpe细胞中混入了微量眼球成纤维细胞时，该方法可以检测到creb5的基因表达量显著增加，其数值高于0.5，大约为正常分化细胞的2倍。说明了该方法的灵敏度和准确性较好，可以简单快速确定rpe细胞中是否混有眼球成纤维细胞。实施例2：creb5与其它常见基因的比较提取rpe细胞中的总rna；利用提出而来的总rna反转录合成cdna；采用实时荧光定量pcr仪(qrt-pcr)检测cdna中creb5和其它基因(包括tgfbr1、smad4、snail2)的相对量并以此判断rpe细胞的分化状态。本实施例中除参照细胞ef外，还有a、b、c、d、e五个细胞样品，可分为三组。其中a、b为正常rpe细胞组，c、d为异常分化rpe细胞组，e则是混合了成纤维细胞的rpe细胞组。在结果中，比较三个组的相对量的差别即可比较4组基因的特异性。具体实施过程如下：首先，提取rpe细胞中的总rna：(1)将1.0×106rpe细胞转移至1.5ml离心管，加入1mltrizol，反复吹打细胞完全裂解；(2)加入200μl氯仿剧烈震荡至呈乳白色，室温静置2分钟；(3)放入离心机，于4℃14000g，离心15分钟；(4)取出离心管，小心移取上层液体至新的1.5ml离心管中；(5)在新的离心管中加入冷的500μl异丙醇，上下颠倒使rna析出；(6)于4℃，14000g，离心10分钟；(7)弃掉上清，用500μl的75％乙醇混匀，于4℃14000g离心3分钟。弃掉上清，室温挥发掉乙醇，用20μldepc水溶解rna；(8)用酶标仪检测260nm下的吸光度(记为a)。根据公式(rna浓度＝40×a/1000，单位：μg/μl)计算rna浓度(记为c)。其次，合成cdna：(1)根据rna浓度计算2μgrna所需溶液体积。在冰上按照下表1在pcr管中配制反应体系。表1合成cdna的配制反应体系(2)回冰上。(此步骤目的为打开rna的二级结构)(3)在冰上按照下表2继续在pcr管中加入如下试剂：表25×反应缓冲液4μlribolockrnaseinhibitor(20u/μl)1μl10mmdntpmix2μlrevertaidm-mμlvrt(200u/μl)1μl总体积20μl(4)混合后在pcr仪中孵育25℃5分钟，42℃90分钟，70℃5分钟，4℃长期储存。(5)荧光定量pcr样品模板工作液的配制：另取一个0.2mlpcr管，加入90μldepc水，取10μl反转录后的cdna至此pcr管中混匀即可。最后，采用rt-pcr仪检测rpe细胞基因表达(1)取出保存于-20℃的superrealpremixplus(sybrgreen)，室温解冻。(2)打开rt-pcr仪，按下表3设置pcr反应程序。表3(3)取出各引物放在室温下解冻。在每个200μlpcr管中配制pcr反应体系。(4)pcr反应体系配好后，将pcr管放入rt-pcr仪中运行设置好的程序。(5)pcr反应结束后导出实验数据，分析mrna(即cdna)水平，据此判断视网膜色素上皮细胞是正常分化的细胞还是异常分化的细胞。(6)如图2结果表明，在所用的4个基因的引物中，本专利所采用的creb5能较好的区分正常分化、异常分化和混入了成纤维细胞的rpe细胞；tgfbr1和smad4均不能区分正常分化与异常分化的rpe细胞；而snail2虽然能区分正常分化与异常分化的rpe细胞，但不能区分异常分化的rpe细胞和混入了成纤维细胞的rpe细胞，且其相对表达量过小，实际使用中受误差的影响较大。通过比较可以看出，与其它基因相比，本专利所采用的鉴定方案特异性更强。实施例3：引物特异性的改善提取rpe细胞中的总rna；利用提出而来的总rna反转录合成cdna；利用不同的引物采用实时荧光定量pcr仪(qrt-pcr)检测cdna中creb5的相对量并以此比较不同引物的灵敏度和特异性。本实施例中的引物除了发明中所使用的引物序列(creb5)具体序列参见seqidno:1和seqidno:2，另外两个引物(分别称作creb5-1、creb5-2)的序列如下。creb5-1上游引物：cgatgcttggatgggaagtg(seqidno:3)creb5-1下游引物：gaatcagggaagtgggacca(seqidno:4)creb5-2上游引物：tgggacacatgatggagatga(seqidno:5)creb5-2下游引物：ggtgtgcatgaaggtgggaa(seqidno:6)本实施例中除参照细胞ef外，还有a、d、e三组。其中a为正常rpe细胞组，d为异常分化rpe细胞组，e则是混合了成纤维细胞的rpe细胞组。在结果中，比较三个组的相对量的差别即可比较不同引物的灵敏度和特异性。具体实施过程如下：首先，提取rpe细胞中的总rna：(1)将1.0×106rpe细胞转移至1.5ml离心管，加入1mltrizol，反复吹打细胞完全裂解；(2)加入200μl氯仿剧烈震荡至呈乳白色，室温静置2分钟；(3)放入离心机，于4℃14000g，离心15分钟；(4)取出离心管，小心移取上层液体至新的1.5ml离心管中；(5)在新的离心管中加入冷的500μl异丙醇，上下颠倒使rna析出；(6)于4℃，14000g，离心10分钟；(7)弃掉上清，用500μl的75％乙醇混匀，于4℃14000g离心3分钟。弃掉上清，室温挥发掉乙醇，用20μldepc水溶解rna；(8)用酶标仪检测260nm下的吸光度(记为a)。根据公式(rna浓度＝40×a/1000，单位：μg/μl)计算rna浓度(记为c)。其次，合成cdna：(1)根据rna浓度计算2μgrna所需溶液体积。在冰上按照下表1在pcr管中配制反应体系。表1合成cdna的配制反应体系(2)回冰上。(此步骤目的为打开rna的二级结构)(3)在冰上按照下表2继续在pcr管中加入如下试剂：表25×反应缓冲液4μlribolockrnaseinhibitor(20u/μl)1μl10mmdntpmix2μlrevertaidm-mμlvrt(200u/μl)1μl总体积20μl(4)混合后在pcr仪中孵育25℃5分钟，42℃90分钟，70℃5分钟，4℃长期储存。(5)荧光定量pcr样品模板工作液的配制：另取一个0.2mlpcr管，加入90μldepc水，取10μl反转录后的cdna至此pcr管中混匀即可。最后，采用rt-pcr仪检测rpe细胞基因表达(1)取出保存于-20℃的superrealpremixplus(sybrgreen)，室温解冻。(2)打开rt-pcr仪，按下表3设置pcr反应程序。表3(3)取出各引物放在室温下解冻。在每个200μlpcr管中配制pcr反应体系。(4)pcr反应体系配好后，将pcr管放入rt-pcr仪中运行设置好的程序。(5)pcr反应结束后导出实验数据，分析mrna(即cdna)水平，据此判断视网膜色素上皮细胞是正常分化的细胞还是异常分化的细胞。图3结果表明，在所用的3组引物中，本专利所采用的引物(creb5)能较好的区分正常分化、异常分化和混入了成纤维细胞的rpe细胞；但是，creb5-1不能区分正常分化与异常分化的rpe细胞；而creb5-2虽然能使a、b、d三组表达量产生差异，但差异不够明显。很显然，本专利所采用的引物具有更高的灵敏度和特异性。图4中的溶解曲线显示，creb5引物产生的峰为典型的单峰。而creb5-1和creb5-2产生的峰都不是典型的单峰，从而进一步印证了本专利所采用的引物明显提高了区分人源视网膜色素上皮细胞的特异性和灵敏度。通过引用并入本文引用的每个专利文献和科学文献的全部公开内容通过引用并入本文用于所有目的。等效本发明可以在不脱离其基本特征的情况下以其他具体形式实施。因此，前述实施例被认为是说明性的，而不是对本文所述的本发明的限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述说明书表示，并且意在将落入权利要求书的等同物的含义和范围内的所有改变包括在其中。序列表<110>江苏艾尔康生物医药科技有限公司<120>一种快速鉴定视网膜色素上皮细胞正常分化和异常分化的方法<130>aj3060fpi170002<160>6<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