本发明涉及一种酶活提高的l-天冬氨酸α-脱羧酶变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
l-天冬氨酸α-脱羧酶(l-aspartateα-decarboxylase，e.c.4.1.1.1)能够将l-天冬氨酸在α位脱羧形成β-丙氨酸和气体二氧化碳，β-丙氨酸在医药和保健品上都要很重要的应用，在医药上β-丙氨酸可用合于成作泛酸钙、肌肽、怕米磷酸钠和巴柳氮等医用药品，他们在神经修复、缓解肿瘤性骨痛和治疗肠道性等疾病时有较好的效果，在食品添加剂方面，β-丙氨酸主要用于提高人体机能，实现肌肉的发育方面等，是运动员常使用的一种保健品。l-天冬氨酸α-脱羧酶主要在细菌中存在，在植物和部分动物中也有发现，但由于微生物来源的l-天冬氨酸α-脱羧酶具有蛋白小，易于表达等优点，被广泛研究和用于生产β-丙氨酸。
异源表达l-天冬氨酸α-脱羧酶的问题是个别来源的l-天冬氨酸α-脱羧酶不能自我成熟需要相关蛋白的协助，这增加的酶应用的难度；并且l-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活相对比较低，这些都限制了l-天冬氨酸α-脱羧酶生产β丙氨酸在工业中的应用。因此，选取一种可以自我成熟和高酶活的l-天冬氨酸α-脱羧酶是实现大规模工业化应用的关键，在可以自我成熟的枯草芽孢杆菌来源的l-天冬氨酸α-脱羧酶的基础上，进行定点突变提高l-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活和热稳定，对于扩大l-天冬氨酸α-脱羧酶产β丙氨酸工业化应用前景具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种酶活提高l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸如序列seqidno.2所示的氨基酸的基础上，将56位氨基酸由谷氨酸突变成丝氨酸。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。
本发明的第三个目的是提供所述基因的重组表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。
本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的制备方法，所述方法是在seqidno.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第56位的谷氨酸的密码子突变成了编码丝氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pet28a。
在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：
(1)以seqidno.4所示核苷酸序列为模板，以fprimer(序列如seqidno.5所示)，rprimer(序列如seqidno.6所示)为引物，进行pcr即得到seqidno.3所示的重组基因。
(2)将步骤(1)得到的重组基因序列，连接到pet28a表达载体中，得到重组质粒pet28a-e56s，重组质粒化转化e.coli，获得重组大肠杆菌工程菌株，命名为e.coli/pet28a-e56s。
本发明的第六个目的是提供所述l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体在医药化工领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于制备合成泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠、β-丙氨酸金属配合物或巴柳氮。
本发明在天然l-天冬氨酸α-脱羧酶的基础上，通过定点突变生物技术改造l-天冬氨酸α-脱羧酶分子结构，突变体酶的纯酶液比酶活较突变前提高55％。突变体酶e56s的热稳定得到一定的提升，在65℃下保持12h依旧残留81％的活性，并且通过全细胞转化可以得到225g/l的β丙氨酸，转化率可以达到94％。本发明表明56位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得可用于制备治疗肿瘤性骨痛和肠道性疾病的药物。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
大肠杆菌发酵培养基：胰蛋白胨12g/l，酵母提取物8g/l，k3hpo44g/l，一水合柠檬酸2.1g/l，柠檬酸铁铵0.3g/l，甘油10g/l，硫酸铵2.5g/l，mgso40.24g/l，nacl3g/l。调节ph6.8-7.0。
酶活定义：每分钟内能催化l-天冬氨酸转化为1μmolβ丙氨酸所需要的酶量为一个酶活单位。
l-天冬氨酸α-脱羧酶活测定方法：以l-天冬氨酸为底物，通过hplc测定在催化反应中生成的β丙氨酸量来测定酶活。反应混合物(1ml)组成为：920μl0.1mph7.0pb缓冲液；50μl100g/l的l-asp溶液(用naoh调节ph为7.0)；30μl纯酶液。反应混合物在37℃，ph7.0条件下，反应20min后，加入100μl0.1mnaoh溶液终止反应。随后去一定量的反应液进行hplc检测，用于测定酶活。
hplc方法：高效液相色谱仪为agilent1260series，色谱柱为zorbaxsb-c18柱(4.6×150mm5-micron,agilent)，hplc条件为：流动相a：0.1m乙酸钠，0.023％三乙胺，0.5％四氢呋喃。流动相b：0.15m乙酸钠，40％甲醇，40％乙腈。柱温40℃，流速1ml/min，opa柱前衍生。
实施例1：含l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的重组载体的构建
(1)g107d突变体的获得：以seqidno.4所示核苷酸序列为模板，fprimer(序列如seqidno.5所示)、rprimer(序列如seqidno.6所示)为引物，进行pcr即得到seqidno.3所示的重组基因。
(2)将重组基因与pet28a分别用ncoi、xhoi双酶切，纯化后用t4dna连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化jm109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/l)lb平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pet28a-e56s。测序工作由上海生工完成。
实施例2：产l-天冬氨酸α-脱羧酶大肠杆菌工程菌构建
将实施例1得到的重组质粒pet28a-e56s化学法转化入e.coli感受态细胞，具体方法如下：
(1)转化实验所需溶液如下(g/l)：
lb：酵母提取物5，蛋白胨10，nacl10。
50％甘油，0.1mcacl2，115℃湿热灭菌。
(1)接种大肠杆菌jm109或者大肠杆菌bl21(de3)于50ml新鲜lb培养液中37℃，220r/min过夜培养。
(2)取过夜培养物1ml接种到100ml新鲜lb培养基中37℃，220r/min振荡培养。
(3)培养1h后开始用分光光度计检测培养液的od600值，每隔20min左右检测一次，直到od600值达到0.6时为止(约需要2h)。
(4)将培养液等份35ml分装于50ml的离心管中，并放置在冰上预冷约10min。
(5)4℃，1000g离心5min，完全弃去上清。
(6)向50ml的离心管中加入2ml预冷的0.1m氯化钙溶液，缓慢吹打均匀冰上静置15min，重复操作两次。
(7)随后加入3.2ml0.1m氯化钙溶液和1.6ml50％甘油后分装于1.5ml的离心管中，每支离心管分装120μl。
大肠杆菌感受态热击转化方法为，在120μl感受态中加入5μl质粒，混匀后冰上放置半小时，然后42℃准确热击90s，冰上冷置5分钟后加入800μllb培养基，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌e.coli/pet28a-e56s。
实施例3：重组菌e.coli/pet28a-e56sl-天冬氨酸α-脱羧酶高效表达及酶活测定
将实施例2构建的重组菌e.coli/pet28a-e56s与表达未突变的酶的对照菌株e.coli/pet28a-bspand分别接种于l0ml含卡那霉素的lb培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于大肠杆菌发酵培养基中诱导表达，37℃培养14h，取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，然后采用ni柱纯化得到纯酶液，用于酶活力的测定。
结果表明重组菌e.coli/pet28a-e56s表达的l-天冬氨酸α-脱羧酶比酶活为8.06u/mg，比对照菌株e.coli/pet28a-bsadcl-天冬酰胺酶5.2u/mg酶活提高55％。
突变体酶e56s的热稳定得到一定的提升，在65℃下保持12h依旧残留81％的活性，而未突变的酶在在65℃下保持12h，只有52％活性。
通过发酵诱导得到的e.coli/pet28a-e56s菌体进行全细胞转化生产β丙氨酸，在1l的发酵罐中，把菌体悬浮于水中，菌体的od600为100，控制反应的ph为7.0，转速为600rpm，不断的分批添加固体底物天冬氨酸，在8h可以转化生产215gβ丙氨酸，转化率为94％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种酶活提高的l-天冬氨酸α-脱羧酶变体及其构建方法
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