以碳点为光活性模拟酶的酸性磷酸酶测定方法与流程

本发明涉及纳米生物分析检测领域，尤其涉及碳量子点作为新型的光活性纳米材料模拟酶及其在酸性磷酸酶活性检测中的应用。

背景技术：

天然酶具有底物特异性好、催化活性高等显著优点，但其提取成本较高，易变性失活，价格昂贵，这些因素极大地限制了其应用。因此，近年来，纳米材料模拟酶的开发及其在生物传感方面的应用研究引起了越来越多的关注。与天然酶相比，基于纳米结构的模拟酶具有诸多优势：低成本、高催化活性和耐受更苛刻的环境，这表明纳米材料作为模拟酶具有很好的传感应用前景[Gao L Z.；Zhuang J.；Nie L.；Zhang J B.；Zhang Y.；Gu N.；Wang T H.；Feng J.；Yang D L.；Perrett S.；Yan X Y.Nat.Nanotechnol.,2007,2,577-583]。但是目前大部分基于纳米材料的过氧化物模拟酶均需要借助大量具有破坏性的过氧化氢(H2O2)才能发挥其活性，这使其在生物分析领域的应用受到较大限制。因此，发展能够不依赖于H2O2而具有较高催化活性的纳米材料模拟酶具有重要的意义。

本发明利用水热法合成了碳量子点(CDs)，该纳米材料具有较好的光稳定性、低毒性、生物相容性等优点。发现CDs在可见光(λ≥400nm)照射下有较强的模拟酶活性，可以催化过氧化物酶的典型色原底物的催化显色。该光活性纳米材料模拟酶价廉易得，工作时不依赖于过氧化氢，而且其活性可以通过光照的控制方便的开启/关闭。在Ce³⁺存在下，CDs发生聚集而模拟酶活性得到抑制；而酸性磷酸酶(ACP)可以水解磷酸酯产生出磷酸根离子与Ce³⁺形成CePO4沉淀，从而使得CDs的光诱导模拟酶活性得到恢复。基于此，本发明建立了一种新型的检测ACP活性的方法，检测限为0.02mol/L。ACP是广泛存在于各种生物组织中的一种酶，其水平异常往往与多种疾病，如前列腺癌、戈谢病、骨病、肾功能障碍、和静脉疾病等有很大关联[Bull,H.；Murray,P.G.；Thomas,D.；Fraser,A.M.；Nelson,P.N.Mol.Pathol.2002,55,65-72.]。该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简便、检测快速、成本低等优点。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种基于CDs的光活性纳米材料模拟酶及其在酸性磷酸酶活性检测方面的应用。通过酸性磷酸酶的反应将抑制CDs光活性模拟酶性质的Ce³⁺反应形成沉淀，从而恢复了CDs的光活性模拟酶性质，基于此，建立了一种新型的检测酸性磷酸酶的方法。

本发明的目的可通过如下技术措施来实现：

a、碳量子点的制备：在100mL烧杯中，加入一定量的含碳元素的原材料和25mL的按照一定比例混合的2.0mol/L硫酸与2.0mol/L硝酸的混合溶液，在不断搅拌的情况下形成溶液；取20mL的混合物加入到反应釜中，在一定温度下加热反应一段时间，自然冷却到室温后，缓慢加入80mL的去离子水，然后用1.0mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH至中性；得到的溶液用透析袋透析3天，得到水溶性的碳量子点；

b、酸性磷酸酶活性的测定：取10μL不同浓度的酸性磷酸酶与10μL 1.0mmol/L酸性磷酸酶的底物与30μL的pH＝5.0的醋酸缓冲溶液混合，于96孔板中40℃下震荡孵育2h；随后加入30μL CDs，20μL 5mmol/L 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，使用0.2mol/L pH＝3.0的醋酸缓冲溶液将反应液稀释到200μL；混合均匀后置于可见光下(λ≥400nm)照射15min后，用酶标仪检测体系652nm处的吸光度。

本发明的目的还可通过如下技术措施来实现：

所述的含碳元素的原材料选自活性炭、抗坏血酸或柠檬酸三钠，质量为0.1-0.5g；所述的按照一定比例混合的2.0mol/L硫酸与2.0mol/L硝酸的混合溶液，硫酸与硝酸的体积比为1:1-4:1；所述的合成碳点的反应温度和反应时间为60-120度，反应时间为3h-6h；所述的酸性磷酸酶的底物为焦磷酸钠、o-磷酸基-L-酪氨酸。

附图说明：

图1是发明制备的碳量子点的(A)透射电镜、(B)红外光谱图以及(C)紫外可见吸收光谱与荧光光谱图。

图2是不同物质的混合物在不同条件下的紫外-可见吸收光谱图：(a)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺与碳量子点的混合物经可见光光照；(b)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺经可见光光照；(c)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、碳量子点的混合物未经光照。

图3是不同的活性中间体清除剂对碳量子点的光活性模拟酶性能的影响。

图4是不同物质的混合物在光照条件下的吸光度：(a)碳量子点与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的混合物；(b)碳量子点、Ce³⁺与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的混合物；(c)碳量子点、Ce³⁺、PO4^3-与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的混合物。

图5是检测酸性磷酸酶的线性关系图(A)以及选择性(B)。

实施实例1：

a、在100mL烧杯中，加入25mL 2.0mol/L硫酸、5mL 2.0mol/L硝酸和0.1g抗坏血酸，在不断搅拌的情况下形成均匀溶液；取20mL的混合物加入到反应釜中，在120℃下加热3h，自然冷却到室温后，缓慢加入80mL的去离子水，然后用1.0mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH至中性；得到的溶液用透析袋透析3天，得到水溶性的碳量子点；

b、酸性磷酸酶活性的测定：取10μL不同浓度的酸性磷酸酶与10μL 1.0mmol/L焦磷酸钠与30μL的pH＝5.0的醋酸缓冲溶液混合，于96孔板中40℃下震荡孵育2h；随后加入30μL CDs，20μL 5mmol/L 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，使用0.2mol/L pH＝3.0的醋酸缓冲溶液将反应液稀释到200μL；混合均匀后置于可见光下(λ≥400nm)照射15min后，用酶标仪检测体系652nm处的吸光度。

实施实例2：

a、在100mL烧杯中，加入12.5mL 2.0mol/L硫酸、12.5mL 2.0mol/L硝酸和0.2g柠檬酸三钠的混合溶液，在不断搅拌的情况下形成溶液；取20mL的混合物加入到反应釜中，80℃下加热反应5h，自然冷却到室温后，缓慢加入80mL的去离子水，然后用1.0mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH至中性；得到的溶液用透析袋透析3天，得到水溶性的碳量子点；

a、酸性磷酸酶活性的测定：取10μL不同浓度的酸性磷酸酶与10μL 1.0mmol/L o-磷酸基-L-酪氨酸与30μL的pH＝5.0的醋酸缓冲溶液混合，于96孔板中40℃下震荡孵育2h；随后加入30μL CDs，20μL 5mmol/L 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，使用0.2mol/L pH＝3.0的醋酸缓冲溶液将反应液稀释到200μL；混合均匀后置于可见光下(λ≥400nm)照射15min后，用酶标仪检测体系652nm处的吸光度。