一种高效提取土壤微生物DNA的方法与流程

本发明涉及一种土壤微生物基因组dna的提取方法，具体涉及一种高效提取土壤微生物dna的方法。
背景技术：
：从土壤中提取微生物dna是进行分子生物学方面研究的第一步。高质量的基因组dna是进行如检测现有方法不可培养的细菌，跟踪某些目标菌株或重组基因在自然环境中的行为，土壤中微生物的遗传多样性及其随环境的变化等研究的基础(王家昕,2010)。迄今为止，人们提出了诸多提取dna的方法，常用的方法有冻融法、冻融煮沸法、玻璃珠均质法、液氮研磨法、超声波破碎法等(蔡刘体,2011)。提取中常出现的样品中存在腐植酸类物质可能抑制pcr反应中的taqdna聚合酶的活性、干扰限制性内切酶的活性、降低转化效率和dna的杂交特异性等，须尽量除去(王家昕,2010)。尤其山区的土壤样品中dna含大量的腐殖质，脂类物质及糖类物质，如果提取的dna质量不高，如含有腐殖酸或多酚类化合物，则将影响后续微生物多样性分析实验的效果。因此，亟待开发一种能够适用于各类土壤样品的微生物基因组dna的通用方法以适应研究要求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高效提取土壤微生物dna的方法，该方法通用、高效、安全和简便。实现本发明目的的技术方案如下：一种高效提取干燥植物dna的方法，包括如下步骤：称取土壤样品加入lysingmatrixetube中。加入适量的spb，加入适量的mtbuffer。盖紧lysingmatrixetube的盖子，将离心管置于涡旋混合仪上，对管内物质进行震荡破碎均质化，设定一定的时间，离心。将上清液用大枪头吸出转入微离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，离心，取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，离心，取上清。加入适量的pps，颠倒混匀数次以上，室温静置一定时间，离心，用大口枪头将上清液转移至离心管；吸取适量的bindingmatrix加入上一步中的离心管；将离心管上下颠倒后静置，等待二氧化硅基质沉淀，移除一定体积的上清液，避免吸出沉淀物；将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取适量混合液移入spinfilter中，离心，倒掉收集管中的液体，重复上一步操作直至离心管中的液体吸尽；加入适量的sews-m溶液，用小枪头小心混匀后，离心，弃去收集管中的液体；重复上一步后，将收集管更换为catchtube；在室温下，将spinfilter风干一段时间；往spinfilter中加入适量的des溶液，用小枪头使之与bindingmatrix混匀，65℃水浴一段时间，离心，收集离心液，再加入适量的des溶液重复这一步操作，即可获得土壤微生物基因组dna。本发明所述土壤材料包括荒漠土壤、农田土壤、半荒漠土壤、山区土壤。优选地，本发明所述土壤材料包括沙漠土壤、荒漠土壤、农田土壤、山区土壤。本发明在有机溶液抽提过程中，需要充分颠倒混合。本发明所述离心转速为8000-10000rpm，温度为4-15℃，离心时间为1-10min。具体地，所述高效提取土壤微生物dna的方法，包括如下步骤：(1)称取0.3-0.4g样品加入lysingmatrixetube中。加入978μl的spb，加入122μl的mtbuffer；(2)盖紧lysingmatrixetube的盖子，将离心管置于涡旋混合仪上，对管内物质进行震荡破碎均质化，时间设定为40-50s。在8000r/min转速下离心15min。(3)将上清液用大枪头吸出转入2ml的微离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，15℃，10000rpm，离心10min；(4)转移上清至干净的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，15℃，10000rpm，离心10min，取上清；(5)加入250μl的pps，颠倒混匀10次以上，室温静置10min；(6)在8000r/min转离心5min，用大口枪头将上清液转移至2ml离心管；(7)吸取800μl的摇匀bindingmatrix加入上一步中的离心管；(8)将离心管上下颠倒2min后静置3min，等待二氧化硅基质沉淀；(9)移除500μl上清液，避免吸出沉淀物；(10)将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取约600μl混合液移入spinfilter中，8000r/min转下离心1min；(11)倒掉收集管中的液体，重复上一步操作直至2ml离心管中的液体吸尽；(12)加入已制备好的sews-m溶液500μl，用小枪头小心混匀后，8000r/min转下离心1min，弃去收集管中的液体；(13)重复上一步后，将收集管更换为1.5ml的catchtube；(14)在室温下，将spinfilter风干5-10min；(15)往spinfilter中加入80μl的des溶液，用小枪头使之与bindingmatrix混匀，65℃水浴15min。8000r/min转下离心2min，可得到约50μl的dna溶液，再加入80μl的des溶液重复这一步操作，即可获得约100μl的土壤微生物dna溶液。本发明所述lysingmatrixetube、spb、mtbuffer、pps、bindingmatrix、spinfilter、sews-m、catchtube、des均来自于mpbio公司提供的dna提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil，目录号:116560200)。根据该试剂盒说明书的记载，spb、pps分别为sodiumphosphatebuffer，ppssolution。与现有技术相对，本发明具有以下优点：(1)利用本发明方法从土壤样品中获得的微生物dna溶液中杂质减少，且dna纯度符合下游应用的要求。(2)经分光光度试验证明最终获得的dna能够达到一般分子生物学研究的要求。(3)本发明提取方法具有通用、高效和简便的特点。更具体地，本发明提供以下各项：1、一种提取土壤微生物dna的方法，其特征在于，包括如下步骤：在对土壤样品进行裂解处理并离心后，向所得的上清中加入酚-氯仿-异戊醇混合物，混匀并且离心取上清，之后向加入所述酚-氯仿-异戊醇混合物后获得的上清中加入氯仿-异戊醇混合物，混匀并且离心取上清。2.根据1所述的方法，其中所述方法利用来自mpbio公司的目录号为116560200的fastdnaspinkitforsoil进行。3.根据1所述的方法，其中所述酚-氯仿-异戊醇混合物的混合比例为25:24:1。4.根据1所述的方法，其中所述氯仿-异戊醇混合物的混合比例为24:1。5.根据1所述的方法，其中所述土壤包括荒漠土壤、农田土壤、半荒漠土壤、山区土壤。6.根据1所述的方法，其中所述混匀需要充分颠倒混合。7.根据1所述的方法，其中进行后两步离心的条件为：离心转速为8000-10000rpm，温度为4-15℃，离心时间为1-10min。8.根据1所述的方法，其包括如下步骤：称取土壤样品加入lysingmatrixetube中，加入适量的spb和适量的mtbuffer，将离心管置于涡旋混合仪上，对管内物质进行震荡破碎均质化，之后离心；将上清液转入微离心管中，加入等体积的25:24:1的酚-氯仿-异戊醇混合物，颠倒混匀，离心，取上清，加入等体积的24:1的氯仿-异戊醇混合物，颠倒混匀，离心，取上清；加入适量的pps，颠倒混匀，室温静置后离心，将上清转移至离心管；将适量的bindingmatrix加入上一步中的离心管中；将离心管上下颠倒后静置，等待二氧化硅基质沉淀，移除一定体积的上清液，避免吸出沉淀物；将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取适量混合液移入spinfilter中，离心，倒掉收集管中的液体，重复上一步操作直至离心管中的液体吸尽；加入适量的sews-m溶液，混匀后离心，弃去收集管中的液体；重复上一步后，将收集管更换为catchtube；在室温下，将spinfilter风干一段时间；往spinfilter中加入适量的des溶液，使之与bindingmatrix混匀，65℃水浴一段时间后离心，收集离心液，再加入适量的des溶液重复这一步操作，即可获得土壤微生物基因组dna。9、根据1所述的方法，其包括如下步骤：(1)称取0.3-0.4g样品加入lysingmatrixetube中，加入978μl的spb，加入122μl的mtbuffer；(2)盖紧lysingmatrixetube的盖子，将离心管置于涡旋混合仪上，对管内物质进行震荡破碎均质化，时间设定为40-50s，在8000r/min转速下离心15min。(3)将上清液用大枪头吸出转入2ml的微离心管中，加入等体积的25:24:1的酚-氯仿-异戊醇混合物，颠倒混匀，15℃，10000rpm，离心10min；(4)转移上清至干净的离心管中，加入等体积的24:1的氯仿-异戊醇混合物，颠倒混匀，15℃，10000rpm，离心10min，取上清；(5)加入250μl的pps，颠倒混匀10次以上，室温静置10min；(6)在8000r/min转离心5min，用大口枪头将上清液转移至2ml离心管；(7)吸取800μl的摇匀bindingmatrix加入上一步中的离心管；(8)将离心管上下颠倒2min后静置3min，等待二氧化硅基质沉淀；(9)移除500μl上清液，避免吸出沉淀物；(10)将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取约600μl混合液移入spinfilter中，8000r/min转下离心1min；(11)倒掉收集管中的液体，重复上一步操作直至2ml离心管中的液体吸尽；(12)加入已制备好的sews-m溶液500μl，用小枪头小心混匀后，8000r/min转下离心1min，弃去收集管中的液体；(13)重复上一步后，将收集管更换为1.5ml的catchtube；(14)在室温下，将spinfilter风干5-10min；(15)往spinfilter中加入80μl的des溶液，用小枪头使之与bindingmatrix混匀，65℃水浴15min，之后8000r/min转下离心2min，可得到约50μl的dna溶液，再加入80μl的des溶液重复这一步操作，即可获得约100μl的土壤微生物dna溶液。附图说明图1为本发明实施例4中提取的山区土壤微生物总dna的电泳结果，图1中从左到右依次为：dnamaker(2kplus)；1：山区土壤。图2为本发明实施例1-4中提取的4种土壤微生物总dna的电泳结果，图1中从左到右依次为：dnamaker(2kplus)；1：山区土壤(本发明的方法)；2：山区土壤(试剂盒法)；3：农田土壤(本发明的方法)；4：农田土壤(试剂盒法)；5：半荒漠土壤(本发明的方法)；6：半荒漠土壤(试剂盒法)；7：荒漠土壤(本发明的方法)；8：荒漠土壤(试剂盒法)。具体实施方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式做进一步详细描述，但并不局限于本发明，仅作示例说明。下列实施例中未注明具体实验的条件方法，通常按照常规条件，或者制造厂商所建议的条件。本发明采用的酚、氯仿和异戊醇购于北京宏业图成科技有限公司。本发明所述lysingmatrixetube、spb、mtbuffer、pps、bindingmatrix、spinfilter、sews-m、catchtube、des均来自于mpbio公司提供的dna提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil，目录号:116560200)。实施例1本实施提供的荒漠土壤的微生物dna的提取过程如下：(1)称取0.3-0.4g样品加入lysingmatrixetube中。加入978μl的spb，加入122μl的mtbuffer；(2)盖紧lysingmatrixetube的盖子，将离心管置于涡旋混合仪上，对管内物质进行震荡破碎均质化，时间设定为40-50s。在8000r/min转速下离心15min。(3)将上清液用大枪头吸出转入2ml的微离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，15℃，10000rpm，离心10min；(4)转移上清至干净的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，15℃，10000rpm，离心10min；(5)加入250μl的pps，颠倒混匀10次以上，室温静置10min；(6)在8000r/min转离心5min，用大口枪头将上清液转移至2ml离心管；(7)吸取800μl的摇匀bindingmatrix加入上一步中的离心管；(8)将离心管上下颠倒2min后静置3min，等待二氧化硅基质沉淀；(9)移除500μl上清液，避免吸出沉淀物；(10)将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取约600μl混合液移入spinfilter中，8000r/min转下离心1min；(11)倒掉收集管中的液体，重复上一步操作直至2ml离心管中的液体吸尽；(12)加入已制备好的sews-m溶液500μl，用小枪头小心混匀后，8000r/min转下离心1min，弃去收集管中的液体；(13)重复上一步后，将收集管更换为1.5ml的catchtube；(14)在室温下，将spinfilter风干5-10min；(15)往spinfilter中加入80μl的des溶液，用小枪头使之与bindingmatrix混匀，65℃水浴15min。8000r/min转下离心2min，可得到约50μl的dna溶液，再加入80μl的des溶液重复这一步操作，即可获得约100μl的土壤微生物dna溶液。实施例2与实施例1的区别仅在于将原料替换为半荒漠土壤，制得样品微生物基因组dna。实施例3与实施例1的区别仅在于将原料替换为农田土壤，制得样品微生物基因组dna。实施例4与实施例1的区别仅在于将原料替换为山区土壤，制得样品微生物基因组dna。上述实施例1-4提取的微生物基因组dna的产率实验例1本发明方法提取山区土壤类型的微生物dna质量采用紫外分光光度计(merinton,sma4000)分别测量dna溶液在230nm、260nm、280nm的光吸收峰度值。通过计算od260/od280和od230/od260比值分别获得dna溶液中腐殖质、多糖、酚类以及rna的污染度，从而估算dna浓度。公式为：dna样品浓度(ug/ul)＝od260×稀释倍数×50分析提取dna的产率，琼脂糖凝胶电泳时每个样品上样3uldna溶液。1％琼脂糖(invitrogen,california,美国)，1×tae(北京天根)，goldview(北京赛百盛基因技术有限公司)染色，100v，30min电泳，检测dna。利用upv紫外成像系统(ec3system,美国)扫描成像。采用实施例4方法提取山区土壤微生物基因组dna。从下表1和图1可以看到，本发明方法能够从上述样品中成功提取出dna，紫外分光光度计检测结果表明提取获得的dna纯度符合要求。表1本发明方法提取山区土壤dna的质量土壤类型浓度(ug/ul)od260/od230od260/od280山区土壤(样方1)61.42±2.140.16±0.031.61±0.03山区土壤(样方2)35.48±0.450.14±0.031.55±0.01实验例2采用本发明的方法提取山区土壤、农田土壤、半荒漠土壤以及荒漠土壤的微生物dna，山区土壤、农田土壤、半荒漠土壤以及荒漠土壤分别与实施例1-4相同。具体提取过程如下：(1)称取0.3-0.4g样品加入lysingmatrixetube中。加入978μl的spb，加入122μl的mtbuffer；(2)盖紧lysingmatrixetube的盖子，将离心管置于涡旋混合仪上，对管内物质进行震荡破碎均质化，时间设定为40-50s。在8000r/min转速下离心15min。(3)将上清液用大枪头吸出转入2ml的微离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，15℃，10000rpm，离心10min；(4)转移上清至干净的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀，15℃，10000rpm，离心10min；(5)加入250μl的pps，颠倒混匀10次以上，室温静置10min；(6)在8000r/min转离心5min，用大口枪头将上清液转移至2ml离心管；(7)吸取800μl的摇匀bindingmatrix加入上一步中的离心管；(8)将离心管上下颠倒2min后静置3min，等待二氧化硅基质沉淀；(9)移除500μl上清液，避免吸出沉淀物；(10)将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取约600μl混合液移入spinfilter中，8000r/min转下离心1min；(11)倒掉收集管中的液体，重复上一步操作直至2ml离心管中的液体吸尽；(12)加入已制备好的sews-m溶液500μl，用小枪头小心混匀后，8000r/min转下离心1min，弃去收集管中的液体；(13)重复上一步后，将收集管更换为1.5ml的catchtube；(14)在室温下，将spinfilter风干5-10min；(15)往spinfilter中加入80μl的des溶液，用小枪头使之与bindingmatrix混匀，65℃水浴15min。8000r/min转下离心2min，可得到约50μl的dna溶液，再加入80μl的des溶液重复这一步操作，即可获得约100μl的土壤微生物dna溶液。取3uldna溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，100v，30min。并用紫外分光光度计测定其浓度。结果见表2和图2。实验例3采用mpbiofastdnaspinkitforsoil(目录号:116560200)根据生产商提供的方法提取山区土壤、农田土壤、半荒漠土壤以及荒漠土壤的微生物dna，山区土壤、农田土壤、半荒漠土壤以及荒漠土壤分别与实施例1-4相同。具体提取过程如下：(1)称取0.3-0.4g样品加入lysingmatrixetube中。加入978μl的spb，加入122μl的mtbuffer；(2)盖紧lysingmatrixetube的盖子，将离心管置于涡旋混合仪上，对管内物质进行震荡破碎均质化，时间设定为40-50s。在8000r/min转速下离心15min。(3)加入250μl的pps，颠倒混匀10次以上，室温静置10min；(4)在8000r/min转离心5min，用大口枪头将上清液转移至2ml离心管；(5)吸取800μl的摇匀bindingmatrix加入上一步中的离心管；(6)将离心管上下颠倒2min后静置3min，等待二氧化硅基质沉淀；(7)移除500μl上清液，避免吸出沉淀物；(8)将剩余的上清液与沉淀物重新混匀，吸取约600μl混合液移入spinfilter中，8000r/min转下离心1min；(9)倒掉收集管中的液体，重复上一步操作直至2ml离心管中的液体吸尽；(10)加入已制备好的sews-m溶液500μl，用小枪头小心混匀后，8000r/min转下离心1min，弃去收集管中的液体；(11)重复上一步后，将收集管更换为1.5ml的catchtube；(12)在室温下，将spinfilter风干5-10min；(13)往spinfilter中加入80μl的des溶液，用小枪头使之与bindingmatrix混匀，65℃水浴15min。8000r/min转下离心2min，可得到约50μl的dna溶液，再加入80μl的des溶液重复这一步操作，即可获得约100μl的土壤微生物dna溶液。取3uldna溶液使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，100v，30min。并用紫外分光光度计测定其浓度。结果见表2和图2。从表2和图2可以看到，本方法以及试剂盒mpbiofastdnaspinkitforsoil(目录号:116560200)均可以从样品中成功提取出dna，紫外分光光度计检测结果：使用相同样品情况下，本发明的方法提出的dna溶液在od230处的吸光度低于试剂盒法，表明本发明在一定程度上可以去除腐殖质，脂类物质等有机物质的干扰。表2新方法与试剂盒提取4种土壤类型微生物dna的质量比较参考文献1.王家昕,谭晖,李长影,孔雯,李晓华.几种土壤微生物总dna提取方法的比较[j].湖北农业科学,2010,49(11):2651-2653.2.蔡刘体,胡重怡,罗正友.sds-ctab法提取烟草病圃土壤微生物总dna[j].江西农业学报,2011,23(02):119-121.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12