缢蛏I型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏I型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法与流程

本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种缢蛏i型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法和应用。

背景技术：

抗菌肽/蛋白是一类广泛存在于整个生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体先天免疫的关键因子。steiner最早在天蚕中发现后，到目前为止，在各种生物中总共发现了1000多种抗菌肽。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为四大类：（1）不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；（2）具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；（3）富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；（4）由前体大分子酶解产生的抗菌肽，如肢口纲中鲎的血蓝蛋白。

不同类型的抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有毒副作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。国外目前已有4种抗菌肽药物进入三期临床，2种进入二期临床测试。此外，把抗菌肽基因导入植物体，使之整合到染色体基因组上，产生抗病的植物体已取得可喜进展。因此，抗菌肽的研究不仅在理论上具有重要意义，而且在实践上具有巨大的潜力。

溶菌酶作为一种具有广谱性的抗菌活性的功能多肽/蛋白，在临床研究及大规模的市场应用上受到了越来越广泛的关注。在医学上，溶菌酶可以作为多种疾病的标志物，通过测定尿液、分泌物、血清或组织中溶菌酶的浓度和活性变化，作为诊断的指标之一。根据溶菌酶能溶菌，但对组织无刺激、无毒性的特性，己广泛应用于食品、医药、化工、生物工程等领域。缢蛏（sinonovaculaconstricta）作为我国四大养殖贝类之一，在水产养殖中占据了重要的经济地位。然而，随着沿海城市经济的发展，海洋污染日益加剧，导致养殖缢蛏病害问题时有发生，尤其是细菌性疾病引发的疾病严重制约了缢蛏的生存和生长。目前在缢蛏养殖中大多使用抗生素进行防治，但抗生素的大量使用导致了“超级细菌”的出现以及抗生素的残留引起的食品安全问题日益突出，人们迫切需要开发新型抗菌剂进行防治。溶菌酶作为一种天然杀菌蛋白，不会导致细菌耐药性问题、而且对人体无毒害作用。因此，构建缢蛏溶菌酶基因表达工程菌，进而产业化制备绿色疾病制剂应用于水产养殖迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种缢蛏i型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法和应用，其表达的重组蛋白对革兰氏阴性菌灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌具有较强的抑菌活性。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种缢蛏i型溶菌酶-2基因，该基因具有seqidno.1所示的基因序列。该序列全长1558bp，包括426bp的开放阅读框，编码141个氨基酸，5’非编码区长375bp，3’非编码区长757bp，具有多聚腺苷酸信号，序列末端含有典型的polya尾。

上述缢蛏i型溶菌酶-2基因的克隆方法，根据与i型溶菌酶-2基因同源的表达序列标签est序列设计race的巢式引物，采用race技术扩增基因全长，具体步骤如下：

（1）通过对副溶血弧菌感染的缢蛏肝胰腺组织高通量转录组测序，发现了1条编码i型溶菌酶基因的est序列，以此est序列片段进行基因全长克隆；

（2）race引物设计：根据编码缢蛏i型溶菌酶-2基因的部分片段的est克隆设计3’race的巢式引物：3’上游特异性扩增引物1：cagtttcctcccggacctgttga，3’上游特异性扩增引物2：gccagacgtacgctagggaacac，扩增3’接头引物adaptor3：ggccacgcgtcgactagtactt；

具体步骤如下：

a．总rna提取：取缢蛏的肝胰腺组织制备得到rna提取液；

b．3’-race扩增：将上述rna提取液用3’-fullracecoresetwithprimescript™rtase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行pcr扩增，取稀释后pcr产物作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行pcr扩增，得到3’端目的条带；

c．将扩增产物3’端目的条带使用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pmd19-t连接，转化至大肠杆菌escherichiacolidh5α后，在含有氨苄浓度为50μg/ml的lb平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行pcr验证并送至上海华大基因生物工程有限公司测序，所得结果经dnaman软件分析拼接得到缢蛏i型溶菌酶-2基因全长序列，其基因序列如seqidno.1所示。

3、上述缢蛏i型溶菌酶-2基因编码蛋白，该编码蛋白具有seqidno.2所示的氨基酸序列。该蛋白分子量为17.33965kda，等电点为7.90，其成熟肽具有seqidno.3所示的氨基酸序列。

4、一种利用上述缢蛏i型溶菌酶-2基因编码蛋白构建重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌的方法，步骤如下：

（1）设计pcr引物，用分别含有bamhi位点和xhoi位点的引物扩增缢蛏i型溶菌酶-2编码蛋白的成熟肽序列；

（2）将克隆得到的目的基因插入pet28（a）载体，获得重组质粒pet28（a）-i型溶菌酶-2；

（3）对重组质粒pet28（a）-i型溶菌酶-2进行诱导表达，再进行纯化即获得重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌。

具体步骤如下：

（1）i型溶菌酶-2基因全长克隆及重组蛋白的构建与表达

a．pcr扩增：取缢蛏的肝胰腺组织制备得到rna提取液；将rna提取液用cdna合成试剂盒逆转录合成cdna，然后以合成的cdna为模板，用分别含有bamhi位点和xhoi位点的引物扩增缢蛏i型溶菌酶-2编码蛋白的成熟肽序列，其中含bamhi位点i型溶菌酶-2上游扩增引物：ggatcccagtttcctcccggacctgttga；含xhoi位点i型溶菌酶-2下游扩增引物：ctcgagttaaacaagatgcccacatccgg；

b．pcr阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收pcr产物，然后回收产物与载体pmd19-t连接，转化至大肠杆菌escherichiacolidh5α后，在含有氨苄浓度为50μg/ml的lb平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行pcr验证和测序鉴定，得到正确的pcr阳性克隆质粒；

c．重组质粒：将pcr阳性克隆质粒用bamhi和xhoi限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，与经同样酶切的pet28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化escherichiacolidh5α，pcr筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pet28（a）-i型溶菌酶-2重组质粒；

d．重组蛋白的表达：将阳性重组质粒pet28（a）-i型溶菌酶-2转化到感受态表达宿主bl21（de3），再接种到卡那霉素浓度为50μg/ml的lb培养液中，37℃、200r/min振荡培养至菌液od600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1mmol/l，37℃诱导表达7h，收集菌液，经10000g，4℃，离心5min，弃上清液，获得细菌沉淀物；

（2）重组蛋白的纯化

a、菌体裂解：将100ml细菌沉淀物用10mllysisbuffer重悬菌体沉淀，加入1mg/ml的溶菌酶，冰上孵育30min，超声破碎菌体，10000g，4℃，离心20min，收集上清液；

b、蛋白纯化：吸取1mlni-ntasefinose^tmresin上柱，用无菌水洗两次，再用lysisbuffer平衡一次；将上清液与之前上柱的ni-ntasefinose^tmresin混合，4℃混匀2h，收集流出液，用washbuffer洗脱，每次10ml，洗脱2次，然后加入1.25mlelutionbuffer，洗脱4次，分别收集流出液；取每次收集的elutionbuffer洗脱的流出液进行sds-page电泳鉴定，获得重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌。

上述步骤（2）中，

所述的lysisbuffer配方为50mmnah2po4，300mmnacl，5mm咪唑，ph=8.0；

所述的washbuffer配方为50mmnah2po4，300mmnacl，40mm咪唑，ph=8.0；

所述的elutionbuffer配方为50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑，ph=8.0。

5、上述重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌的应用，其表达的i型溶菌酶-2蛋白在制备哈维氏弧菌，副溶血弧菌和灿烂弧菌抑制剂方面的作用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明利用基因工程技术，通过3’端cdna快速扩增（3’-race）的方法，首次从缢蛏中克隆得到了i型溶菌酶-2基因cdna序列，同时对缢蛏i型溶菌酶-2蛋白质进行重组质粒的构建和表达，获得的重组i型溶菌酶-2蛋白具有抑制哈维氏弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌生长的作用，而对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌则没有抑菌活性，本发明优点在于：

a、利用基因工程技术获得的重组蛋白与化学合成法相比具有成本低的优点；

b、该重组蛋白具有革兰氏阴性菌特异性的抑制活性。通过本研究的方法将工程菌产生的i型溶菌酶-2蛋白投放于缢蛏养殖环境中，在缢蛏自身产生i型溶菌酶-2的基础上增加了i型溶菌酶-2对阴性致病菌抑制能力，可以为缢蛏感染弧菌提供一种解决手段。

附图说明

图1为缢蛏i型溶菌酶-2体外重组蛋白诱导后的sds-page分析，m泳道为蛋白质分子量标准，1为未诱导全菌液，2为诱导全菌液。

图2为缢蛏i型溶菌酶-2体外重组蛋白纯化后的sds-page分析，m泳道为蛋白质分子量标准，1为纯化重组蛋白。

图3为缢蛏i型溶菌酶-2体外重组蛋白对灿烂弧菌的抑制作用效果图，图中1、2、3为重组蛋白质量浓度100μg/牛津杯、50μg/牛津杯、20μg/牛津杯，4为阴性对照组1（无菌2216e培养基），5为阴性对照组2（pbs）。

图4为缢蛏i型溶菌酶-2体外重组蛋白对哈维氏弧菌的抑制作用效果图，图中1、2、3为重组蛋白质量浓度100μg/牛津杯、50μg/牛津杯、20μg/牛津杯，4为阴性对照组1（2216e培养基），5为阴性对照组2（pbs）。

图5为缢蛏i型溶菌酶-2体外重组蛋白对副溶血弧菌的抑制作用效果图，图中1、2、3为重组蛋白质量浓度100μg/牛津杯、50μg/牛津杯、20μg/牛津杯，4为阴性对照组1（2216e培养基），5为阴性对照组2（pbs）。

图6为缢蛏i型溶菌酶-2体外重组蛋白对藤黄微球菌的抑制作用效果图，图中1、2、3为重组蛋白质量浓度100μg/牛津杯、50μg/牛津杯、20μg/牛津杯，4为阴性对照组1（藤黄微球菌培养基），5为阴性对照组2（pbs）。

图7为缢蛏i型溶菌酶-2体外重组蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制作用效果图，图中1、2、3为重组蛋白质量浓度100μg/牛津杯、50μg/牛津杯、20μg/牛津杯，4为阴性对照组1（金黄色葡萄球菌培养基），5为阴性对照组2（pbs）。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

i型溶菌酶-2基因克隆与序列分析

（1）通过前期对副溶血弧菌诱导缢蛏cdna文库的est（表达序列标签）分析，发现了1条编码i型溶菌酶-2基因的est序列，对此est克隆进行测序分析，表明该克隆编码缢蛏i型溶菌酶-2的部分片段；

（2）race引物设计：根据编码缢蛏i型溶菌酶-2基因的部分片段的est克隆设计3’race的巢式引物：3’上游特异性扩增引物1：cagtttcctcccggacctgttga，3’上游特异性扩增引物2：gccagacgtacgctagggaacac，扩增3’接头引物adaptor3：ggccacgcgtcgactagtactt；

（3）采用3’race扩增获取缢蛏i型溶菌酶-2基因全长序列，具体步骤如下：

a．总rna提取：取缢蛏的肝胰腺组织（0.2g-1g）于1.5mlrnafree离心管中，加入trizol试剂（购于takara公司）1.0ml，用匀浆器进行充分匀浆。4℃，12000g，离心5min，取上清，再加入0.2ml氯仿，震荡混匀，室温静置5min，4℃，12000g，离心15min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心5min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，4℃，12000rpm，离心5min，弃上清后在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml重悬沉淀，4℃，12000rpm，离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μl无rna酶水，得到rna提取液；

b．3’-race扩增：将上述rna提取液用3’-fullracecoresetwithprimescript™rtase试剂盒（takara公司）逆转录合成扩增3’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行pcr扩增，取稀释100倍的pcr产物1μl作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行pcr扩增，得到3’端目的条带；其中race扩增反应体系及反应条件：模板1.0μl，10×pcr缓冲液（含mg²⁺）2.5μl，浓度2.5mm的dntp2.0μl，浓度10μm的特异性引物1.0μl，浓度10μm的接头引物1.0μl，浓度5u/μl的dna聚合酶0.2μl，超纯水：17.3μl；扩增条件：94℃5min、94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

c．将扩增产物3’端目的条带使用凝胶回收试剂盒（百泰克）回收，回收产物与载体pmd19-t（takara公司）连接，转化至大肠杆菌escherichiacolidh5α（takara公司）后，在含有氨苄浓度为50μg/ml的lb平板培养基（lb平板培养基配方：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、琼脂粉15g/l）中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行pcr验证并送至上海华大基因工程有限公司测序，所得结果经dnaman软件分析拼接得到缢蛏i型溶菌酶-2基因全长序列。

最终得到的缢蛏i型溶菌酶-2基因cdna序列如seqidno.1所示，该序列全长1558bp，包括426bp的开放阅读框，编码141个氨基酸，5’非编码区长375bp，3’非编码区长757bp，具有多聚腺苷酸信号，序列末端含有典型的polya尾。缢蛏i型溶菌酶-2蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示，该蛋白分子量为17.33965kda，等电点为7.90，其中编码序列的1-16为信号肽序列，其成熟肽氨基酸序列如seqidno.3所示。

具体实施例二

i型溶菌酶-2基因工程菌的构建与表达

a．总rna提取：取缢蛏的肝胰腺组织（0.2g-1g）于1.5mlrnafree离心管中，加入trizol试剂（购于takara公司）1.0ml，用匀浆器进行充分匀浆。4℃，12000g，离心5min，取上清，再加入0.2ml氯仿，震荡混匀，室温静置5min，4℃，12000g，离心15min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心5min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，4℃，12000rpm，离心5min，弃上清后在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml重悬沉淀，4℃，12000rpm，离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μl无rna酶水，得到rna提取液；

b、cdna合成：将上述rna提取液用cdna合成试剂盒（takara）转录cdna，具体合成方法依cdna试剂盒说明书操作，然后用带酶切位点的引物对合成的cdna进行pcr扩增，即如下所示：

含bamhi位点i型溶菌酶-2上游扩增引物：ggatcccagtttcctcccggacctgttga；

含xhoi位点i型溶菌酶-2下游扩增引物：ctcgagttaaacaagatgcccacatccgg；

c、pcr扩增：cdna1.0μl，10×pcr缓冲液（含mg²⁺）2.5μl，浓度10mm的dntp2.0μl，浓度10μm的上游引物1.0μl，浓度的下游引物1.0μl，浓度5u/μl的dna聚合酶0.2μl，超纯水：17.3μl；扩增条件：94℃5min、94℃30s、55℃45s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；

d、pcr阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒（bioteke）回收pcr产物，然后回收产物与载体pmd19-t（takara公司）连接，转化至大肠杆菌escherichiacolidh5α（takara公司）后，在含有氨苄浓度为50ug/ml的lb（胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、琼脂粉15g/l）平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行pcr验证和测序鉴定，得到正确的阳性克隆质粒；

e、重组质粒：将pcr阳性克隆质粒用bmhi和xhoi（newenglandbiolabs，neb）限制性内切酶双酶切，与经同样酶切的pet28（a）原核表达载体连接，转化escherichiacolidh5α，pcr筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pet28（a）-i型溶菌酶-2，将阳性重组质粒pet28（a）-i型溶菌酶-2转化到感受态表达宿主bl21（de3）（novagen公司），再接种到卡那霉素浓度为50μg/ml的lb培养液（胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、琼脂粉15g/l）中，37℃、200r/min振荡培养至菌液od600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷（iptg）使其终浓度为1mmol/l，37℃诱导表达3-7h，收集菌液，经10000g，4℃，离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物。sds-page检测重组基因工程菌诱导蛋白的表达形式，如图1所示。

具体实施例三

重组蛋白的纯化

a、菌体裂解：将100ml细菌沉淀物用10mllysisbuffer（咪唑浓度5mm）重悬菌体沉淀，加入1mg/ml的溶菌酶，冰上孵育30min，超声破碎菌体（超5s，停10s，共6次，功率30w，2min），10000g，4℃，离心20min，收集上清。

b、蛋白纯化：吸取1mlni-ntasefinose^tmresin上柱，用无菌水洗两次，再用lysisbuffer（咪唑浓度5mm）平衡一次；将上清液与之前上柱的ni-ntasefinose^tmresin混合，4℃混匀2h，收集流出液，用washbuffer（咪唑浓度40mm），每次10ml，洗脱2次，分别收集流出液，加入1.25mlelutionbuffer（咪唑浓度250mm），洗脱4次，分别收集流出液。取每次收集的elutionbuffer洗脱的流出液进行sds-page电泳鉴定（结果如图2所示），回收目的条带（图2箭头所示即为目的蛋白），获得重组缢蛏i型溶菌酶-2蛋白。上述步骤中，

所述的lysisbuffer（咪唑浓度5mm）配方：50mmnah2po4，300mmnacl，5mm咪唑，ph=8.0；

所述的washbuffer（咪唑浓度40mm）配方：50mmnah2po4，300mmnacl，40mm咪唑，ph=8.0；

所述的elutionbuffer（咪唑浓度250mm）配方：50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑，ph=8.0。

具体实施例四

（1）将3种受试阴性菌副溶血弧菌（vibrioparahaemolyticus），哈维氏弧菌（vibrioharveyi），灿烂弧菌（vibriosplendidus）接种于2216e液体培养基（胰蛋白胨5g/l，酵母提取物1g/l，ph=7.6）于28℃，150r/min培养至od600=0.5，取10ul菌液涂平板（琼脂12g/ml）；

（2）将受试阳性菌藤黄微球菌（micrococcusluteus）和金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）接种于营养琼脂液体培养基（胰蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，nacl5g/l，ph=7.3±0.1）于35℃，150r/min培养，将菌液与营养琼脂固体培养基（琼脂15g/l）混合倒平板，菌液浓度1×10⁷cfu/ml；

（3）采用改良琼脂平板扩散法（牛津杯）测定重组i型溶菌酶-2蛋白抑菌活性，每种受试菌设置阴性对照组1（无菌培养基）、阴性对照组2（pbs）和重组蛋白实验组，在上述所述平板中放置无菌牛津杯（直径0.8cm），依次向每个牛津杯中加入不同质量浓度20μg/牛津杯、50μg/牛津杯、100μg/牛津杯具体实施例三构建所得的重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌以及相等体积阴性对照组1（无菌培养基）、阴性对照组2（pbs），藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌实验组于35℃培养24h，其他受试菌实验组于28℃培养24h，结果显示，具体实施例三构建所得的重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌对3株受试水产病原菌灿烂弧菌、哈维氏弧菌（图3、图4）和副溶血弧菌（图5）具有较为明显的抑制作用，而对阳性菌藤黄微球菌（图6）和金黄色葡萄球菌（图7）没有抑菌作用。其中，重组蛋白质量浓度为100μg/牛津杯对灿烂弧菌的抑菌直径为2.39±0.23cm，重组蛋白质量浓度为50μg/牛津杯对灿烂弧菌的抑菌直径为1.92±0.17cm，重组蛋白质量浓度为20μg/牛津杯对灿烂弧菌的抑菌直径为0.92±0.04cm；重组蛋白质量浓度为100μg/牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为1.93±0.15cm，重组蛋白质量浓度为50μg/牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为1.43±0.14cm；重组蛋白质量浓度为20μg/牛津杯对哈维氏弧菌的抑菌直径为0.98±0.02cm；重组蛋白质量浓度为100μg/牛津杯对副溶血弧菌的抑菌直径为1.92±0.22cm，重组蛋白质量浓度为50μg/牛津杯对副溶血弧菌的抑菌直径为1.40±0.19cm，重组蛋白质量浓度为20μg/牛津杯对副溶血弧菌的抑菌圈不显著。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>宁波大学

<120>缢蛏i型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1558

<212>dna

<213>缢蛏i型溶菌酶-2基因全长

<400>1

acttctcgctagttatgtaaacagcttacacttatttacgaagaacctcatttaaccact60

tacacacttacatcattggtcctttcttatagtttgaccttgataatgagtaataataga120

atacaaatactttgcaagataggtttgtatctgtaaataaacggaagtacctactagtac180

ggacggaaatccgccattttttgggaatataatggttttatagtagaaacaattgttatt240

tctaggaataactggatacattgcattacatatcctacaacaacacaccgccaacgtttt300

gaaataagctacgcccatctttgagacaaccgaagacagaagatagtttacactagtgtt360

tgattccgctccaggatgttgtttattgccgtgtttctggcagtggtggccatagctggc420

ggtcagtttcctcccggacctgttgaagacgactgtatgagttgtatctgcacgatggaa480

tccggatgtaatccattagactgtcgaatggatgtagggtccctttcctgtggatatttc540

cagatcaagctgccatactatcaagactgcggtcaaccacgctcagatctgggctggaag600

ggttgttcgaatgacttgacgtgtgcagcaacttgtgttcaaaattacatgagacgttat660

gttgggcggtcaggctgcagtccaacatgccagacgtacgctagggaacacaacggtgga720

cccattggatgccgccggagctcgacgctgaaatactgggaggctctgaagaaaatcccc780

ggatgtgggcatcttgtttaaggacataacgtcgtcttgcgctagttgtaatcaaatcca840

gtgctaactgttttatttactttcttgatatgcaatactttgttatgattgacagtctta900

aatattaaggtgacctgaacgtctgttgatctgtgtttgctgtctaatgtaatacgaaac960

agacgtcacctaacgtaacataaaatcattacgtcgccatccgttagcggatccattact1020

aatgtaagcagttttaagaattgttattaatttttgtttgaatatccgaccaccagtaca1080

ataaacatggcttgaacatttaacttttatgccactcgaaatgcacttttactgttggga1140

tactgcgcaatatgctatactgtttatttgtaatcttattataaatagtctcgcgaacat1200

atgttttttatcggcttaccaaattaaatagataccctttctaatattcctcaagtagat1260

atcatatgataatttagcgtggctatttcctttcttttttctttgtttttgtttgaatta1320

ctgtcgatgcaaactgaaaaatactattattaccgtcagtctatttgtgttacaatcaat1380

ctatttgtgaatattagaatttaatataccgaaggtgaaagatggactaacaaattcttt1440

tacatatatcagtggggaattagaacgattcttgtttttattgtgtttgtatgaaagacg1500

atgctgaatctataacttaaataaacgactttattcgtcgaaactgaaaaaaaaaaaa1558

<210>2

<211>141

<212>prt

<213>缢蛏i型溶菌酶-2基因编码蛋白

<400>2

metleupheilealavalpheleualavalvalalailealagly

151015

glyglnpheproproglyprovalgluaspaspcysmetsercys

202530

ilecysthrmetgluserglycysasnproleuaspcysargmet

354045

aspvalglyserleusercysglytyrpheglnilelysleupro

505560

tyrtyrglnaspcysglyglnproargseraspleuglytrplys

657075

glycysserasnaspleuthrcysalaalathrcysvalglnasn

808590

tyrmetargargtyrvalglyargserglycysserprothrcys

95100105

glnthrtyralaarggluhisasnglyglyproileglycysarg

110115120

argserserthrleulystyrtrpglualaleulyslysilepro

125130135

glycysglyhisleuval

140

<210>3

<211>125

<212>prt

<213>缢蛏i型溶菌酶-2基因编码蛋白的成熟肽

<400>3

glnpheproproglyprovalgluaspaspcysmetsercysile

151015

cysthrmetgluserglycysasnproleuaspcysargmetasp

202530

valglyserleusercysglytyrpheglnilelysleuprotyr

354045

tyrglnaspcysglyglnproargseraspleuglytrplysgly

505560

cysserasnaspleuthrcysalaalathrcysvalglnasntyr

657075

metargargtyrvalglyargserglycysserprothrcysgln

808590

thrtyralaarggluhisasnglyglyproileglycysargarg

95100105

serserthrleulystyrtrpglualaleulyslysileprogly

110115120

cysglyhisleuval

125

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>3’上游特异性扩增引物1

<400>4

cagtttcctcccggacctgttga23

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>3’上游特异性扩增引物2

<400>5

gccagacgtacgctagggaacac23

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>扩增3’接头引物

<400>6

ggccacgcgtcgactagtactt22

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>含bamhi位点i型溶菌酶-2上游扩增引物

<400>7

ggatcccagtttcctcccggacctgttga29

<210>8

<211>29

<212>dna

<213>含有noti位点i型溶菌酶-2下游扩增引物

<400>8

ctcgagttaaacaagatgcccacatccgg29