胚芽乳酸杆菌及其降尿酸、改善过敏和降血糖用途的制作方法

本发明是关于一种胚芽乳酸杆菌、含其的组合物、培养方法及其用途；更明确地来说，是关于一种包含phes基因、recn基因与质粒的胚芽乳酸杆菌菌种，其藉由排除体脂肪、降血脂、降低肝肿大、降低肝功能指数、抗发炎、降尿酸、改善过敏及/或降血糖，以用于预防及/或治疗肥胖相关疾病的用途。
背景技术：
：肥胖随着生活型态的转变，特别是饮食习惯的改变，导致肥胖率增加，使肥胖在现代化国家成为一个严重的健康问题。世界卫生组织(worldhealthorganization，who)更将肥胖列为二十一世纪最重要的公共卫生及预防医学的重要课题。根据who对肥胖的定义，是以bmi(bodymassindex)作为标准，bmi大于30kg/m2为肥胖，bmi值在25～29.9kg/m2为过重(who，1998)。造成肥胖的原因主要是长期热量的摄取大于消耗，导致脂肪于身体中堆积，因而形成肥胖。肥胖的形成可分原发性与自发性，其中原发性肥胖为饮食与运动等环境因素所造成；自发性则为遗传或疾病所引起(洪，1992)。细胞生物学所定义的肥胖，是由于脂肪组织中前脂肪细胞分化成脂肪细胞的数目与大小增加所致(furuyashikietal.，2004)。脂肪组织可以分泌多种物质，包括激素、生长因子、酶、细胞因子、补体与基质蛋白等，其主要作用为调节代谢、生殖、免疫、血压与血管新生等(younetal.，2004)。据此，肥胖会诱发全身多种面向的疾病。肝肿大高油高脂的饮食习惯造成肥胖，连带导致肝脏细胞囤积过量脂肪颗粒，当脂肪囤积超过肝重量的5％时即为脂肪肝，而产生肝肿大等症状。造成肝肿大常见的原因有病毒性肝炎、肝硬化、中毒性与药物性肝炎、淤血、代谢异常所导致的脂肪肝、肿瘤或白血病等。肝功能指数与肝指数got与gpt测量的指标分别是天门冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferase，ast)与丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase，alt)，此为肝细胞制造的两种最多的酶。当肝脏发炎时，肝细胞会坏死，ast、alt就会进入血液中，造成肝指数got与gpt升高，因此医疗上常以此作为肝脏发炎或受损程度的评估。肝指数过高的原因可能来自不同因素，例如病毒引起的肝炎、药物性肝炎、猛爆性肝炎、肝化脓、肝癌、血压降低、急性心肌梗塞、甲状腺机能亢进，肥胖所引起的脂肪肝亦为原因之一。血脂血液中的脂肪主要分为两类，即胆固醇及三酸甘油脂，而根据其与蛋白质的比例又再细分为乳糜微粒(cm)、极低密度脂蛋白(vldl)、低密度脂蛋白(ldl)及高密度脂蛋白(hdl)。若血液中好的胆固醇过少或是坏的胆固醇过高，即称为高血脂。高血脂成因主要可以分为原发性或次发性，原发性高血脂为家族遗传，次发性则是内分泌疾病如糖尿病、甲状腺机能低下，或肝肾疾病、生活习惯、药物等原因所造成。高血脂会使胆固醇在血管中累积，而形成粥状动脉硬化，导致血液流动不佳，引发心肌梗塞、中风、周边动脉堵塞等症状。酮体酮体包含丙酮、乙酰乙酸和β-羟丁酸三种化合物。当身体饥饿、禁食或某些病理状态(如糖尿病)下，脂肪代谢增加，大量的脂肪酸被肝细胞吸收及氧化，而此同时为了维持血糖浓度的稳定，体内的糖异生也会被激活，进而生成酮体。尿酸摄取的食物中所含的嘌呤，经分解后即生成尿酸。尿酸经由肾脏排泄或肠道排遗来排出体外。当体内生成的尿酸过多或肾脏功能有障碍，尿酸无法顺利排出体外，使得尿酸在血液中的含量过高，称为高尿酸血症。进而导致血液中的尿酸在关节或组织中积存，而引起肿胀变形，即痛风。引发高尿酸血症的原因很多，分为原发性与继发性两类，其中原发性的病因举例如遗传、不当的高嘌呤饮食习惯、药物、酒精等，而脂肪分解所产生酮体则会抑制尿酸排出，因此肥胖者可能出现尿酸过高的症状，进而演进成相关疾病。发炎与过敏当生物组织受到外在病毒感染的刺激后，即会引过敏反应，释放出发炎物质，连带引起发炎反应。肿瘤坏死因子(tnf-α)主要由巨噬细胞产生，是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，同时也是属于引起急性免疫反应的细胞因子的一员，其作用是调节免疫细胞的功能，作为一种内源性致热原能够促使身体发热并引起细胞凋亡，以阻止肿瘤发生和病毒复制。tnf-α的失调被认为与许多人类疾病有关，近来亦有研究指出，饮食所诱导的肥胖会促使过敏反应中扮演重要角色的巨噬细胞累积于脂肪组织中，造成脂肪组织发炎。当支气管对于刺激产生过度反应，演变为呼吸道持续性的慢性发炎反应，即称为气喘。支气管有过敏反应时，会分泌过多的发炎物质导致黏液的分泌增加，进而阻塞气道、造成呼吸道狭窄，导致呼吸阻力增加，因而出现喘气困难、呼吸困难、鸣喘声、胸闷和咳嗽等症状。血糖血糖即血液中的葡萄糖，是由食物消化后由小肠进入血液中，具有恒定性，通常维持在900毫克/升(5mmol/l)，正常范围是4-6mmol/l。血糖会于进食一到两个小时后升高，并在早晨降到最低。血糖浓度失调，如持续性的高血糖或低血糖都会导致多种疾病，其中最显著的疾病就是糖尿病。乳酸杆菌乳酸杆菌(lactobacillusspp.)存在于一般环境中，其能将碳水化合物发酵成乳酸，因此多应用于发酵食品的制造。此菌对于人体健康具有多重益处，具有帮助消化、改善肠脏健康的功效。纵使同为乳酸杆菌属，若为不同种、或甚至是同种但不同菌株也具有不一样的特征，对人体亦会有不同的影响。举例来说，植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)已被研究出具有改善人体健康的功效，如l.plantarumph04具降低血中胆固醇能力；l.plantarum299v可减轻il-10缺乏型小鼠而的结肠炎症状；l.plantarum10hk2可提高前发炎介质，如il-1β、il-6和tnf-α，及抗发炎介白素-10(il-10)，达到抗发炎效果；l.plantarumk21具有降低血中胆固醇、三酸甘油脂含量，以及具有抗发炎的功效。然而，由于如前所提及的由肥胖导致的症状及疾病可以得知，肥胖全面性地改变生理环境，引起的是身体在多种不同面向上的病变。因此，具有单一功效的菌株无法满足由肥胖引起的多种症状的缓解需求，在预防及/或治疗的医药领域中仍有发展具复合性功效的菌株的必要，以更有效地同时针对肥胖相关的病症达到改善的效果。技术实现要素：本发明的其中一个目的在于提供一种胚芽乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)，其包含具序列seqidno:2的phes基因及具序列seqidno:3的recn基因。较佳地，所述胚芽乳酸杆菌进一步包含有具序列seqidno:1的质粒。较佳地，所述胚芽乳酸杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为cgmccno.14565。保藏日期：2017年08月25日。较佳地，所述胚芽乳酸杆菌具有耐酸、耐碱及/或细胞吸附能力。较佳地，所述胚芽乳酸杆菌具有降尿酸、改善过敏及/或降血糖的效果。本发明的另一个目的在于提供一种组合物，其包含如上所述的胚芽乳酸杆菌，藉此提升所述胚芽乳酸杆菌的应用价值。较佳地，所述组合物中的胚芽乳酸杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.14565。较佳地，所述组合物包含选自下列群组的添加剂：赋型剂、防腐剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、甜味剂或其组合。较佳地，所述组合物为药品、饲料、饮料、营养补充品、乳制品、食品或保健食品。较佳地，所述组合物的型态为粉剂、锭剂、造粒、栓剂、微胶囊、安瓶、液剂喷剂或塞剂。较佳地，所述组合物具有降尿酸、改善过敏及/或降血糖的效果。为了达到前述目的，本发明提供一种培养胚芽乳酸杆菌的方法，其包含将保藏编号为cgmccno.14565的胚芽乳酸杆菌培养于培养基；其中所述培养基包含蔗糖、酵母萃取物或其组合，且所述蔗糖或酵母萃取物的添加比例相对于培养基总重量为1wt％至10wt％。较佳地，所述方法中的胚芽乳酸杆菌是于转速为5至50rpm的条件下培养。较佳地，所述方法中的胚芽乳酸杆菌是于温度为32℃至42℃的条件下培养。本发明还有一个目的为开发所述胚芽乳酸杆菌的医药用途，以提升所述胚芽乳酸杆菌的医药上价值。本发明的其中一个目的为提供一种胚芽乳酸杆菌菌株的用途，其用于制备降尿酸、改善过敏及/或降血糖的医药组合物，其中所述胚芽乳酸杆菌的保藏编号为cgmccno.14565。较佳地，于所述用途中的降尿酸为降低血清中尿酸的含量。较佳地，于所述用途中的改善过敏为降低呼吸道阻力。较佳地，于所述用途中的降血糖为降低因营养补给所导致的血糖上升量。附图说明图1显示乳酸杆菌(l.plantarum)gkm3与其他品系的phes基因的演化树。图2显示乳酸杆菌(l.plantarum)gkm3与其他品系的recn基因的演化树。图3显示乳酸杆菌(l.plantarum)gkm3与其他品系菌种耐酸能力。图4显示乳酸杆菌(l.plantarum)gkm3与其他品系菌种耐胆盐能力。图5显示乳酸杆菌(l.plantarum)gkm3与其他品系菌种肠道吸附的能力。图6显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的初始体重、最终体重与体重变化量。图7显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠肝脏重量。图8显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠，其不同部位(肾周围、副睪、肠系膜、腹膜外与腹股沟)的脂肪组织的重量相对于大鼠体重的脂肪量。图9显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠，其不同类型脂肪组织(总体脂、内脏脂肪组织与皮下脂肪组织)相对于大鼠体重的脂肪量。图10显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠，其肝脏的总脂质、三酸甘油脂与胆固醇的含量。图11显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠，其肝脏的tnf-α的含量。图12显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠，其血清中ast与alt的含量。图13显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠，其血清中三酸甘油脂、胆固醇与高密度脂蛋白胆固醇的含量。图14显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠，其血清中酮体的含量。图15显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠，其血清中尿酸的含量。图16显示正常饮食的对照组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予乳酸杆菌gkm3组(hfd+gkm3)的大鼠，其干燥粪便中脂质的含量。图17显示正对照组、负对照组、gkm3低剂量组与gkm3高剂量组的大鼠，其于不同浓度乙酰甲胆碱(methacholine)的刺激下的呼吸道阻力。图18显示对照组与gkm3组的小鼠口服葡萄糖耐受性试验于0、30、60与120分钟的血糖值。图19显示对照组与gkm3组的小鼠口服葡萄糖耐受性试验于120分钟血糖曲线下的面积。图20显示对照组与gkm3组的小鼠口服葡萄糖耐受性试验于0、30、60与120分钟的血糖上升值。图21显示对照组与gkm3组的小鼠口服葡萄糖耐受性试验于120分钟血糖上升曲线下的面积。用于专利程序的微生物保存：本发明的菌种gkm3保藏日期：2017年08月25日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：cgmccno.14565；分类命名：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。具体实施方式本文中所述“排除体脂肪”是指使一个体透过排遗系统排出个体体内的脂肪，其中该各体体内不限制于特定部位，例如血液或脏器等，该脂肪也不限定于特定的种类，例如三酸甘油脂或胆固醇。本文中所述“降低肝肿大”是使个体的肝脏重量减少。在较佳的一个具体态样中，是指因脂肪囤积所导致上升的肝脏重量，藉由施予特定的医药组合物而下降。本文中所述“抗发炎”是指缓解发炎反应，具体来说是降低一或多种发炎反应的指标，例如降低血清中引起或加强发炎反应的细胞因子或介质的含量、减少发炎相关细胞对于激素或介质的分泌。在较佳的一个具体态样中，是指降低肝脏中肿瘤坏死因子(tnf-α)的含量。本文中所述“降尿酸”是使个体体内的尿酸减少，具体来说是指降低血液中尿酸的含量。在较佳的一个具体态样中，是指因高脂饮食所导致血液中上升的尿酸，藉由施予特定的医药组合物而下降。本文中所述“改善过敏”是指缓解过敏症状，具体来说是指降低一种或多种过敏反应的指标，例如降低血清中的抗体含量、减少过敏反应相关细胞对于激素或介质的分泌。在较佳的一个具体态样中，是指降低呼吸道阻力。本文中所述“降血脂”是指使个体血液中的脂肪减少。在较佳的一个具体态样中，是指减少血清中的三酸甘油脂、总胆固醇或高密度脂蛋白胆固醇。本文中所述“降低肝功能指数”是指使个体血清中的天门冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferase，ast)与丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase，alt)的含量降低。在较佳的一个具体态样中，是指因高脂饮食所导致血液中上升的ast与alt，藉由施予特定的医药组合物而下降。本发明从腌制有机蔬果的发酵液中，经过分离与纯化取得一菌种，命名为gkm3。gkm3经全基因定序取得gkm3的全长基因序列，并得知gkm3包含一质粒。将该gkm3的全长基因序列于资料库中比对，鉴定为胚芽乳酸杆菌。接着，以gkm3的phes与recn序列，与其他购入菌种的基因或资料库中他种菌种的基因序列比对以绘制演化树，从序列的差异度发现gkm3与他种菌种在演化关系上相差甚远，确认gkm3为一新颖的胚芽乳酸杆菌菌种。确认gkm3为新颖菌种后，将此菌株于2017年08月25日以“植物乳杆菌lactobacillusplantarumgkm3”的名称，完成保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，取得保藏编号cgmccno.14565。gkm3由于为一新颖的菌种，因此亦对于此菌种的培养条件进行研究，并于本发明中提供一种针对gkm3特别适用的培养方法。对于选用培养该菌种的培养基，可从碳源与氮源来考量。可选择的碳源举例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖醇、甘油、糖蜜或其组合。在一个较佳的态样中，碳源为蔗糖。可选择的氮源举例如大豆蛋白、酵母抽出物、牛肉萃取物、酪蛋白粉、乳清蛋白粉、鱼蛋白水解物、植物萃取蛋白或其组合。在一个较佳的态样中，氮源为酵母抽出物。碳源或氮源相对于培养基总重量的添加比例对于培养成效亦会有影响，各别为1至10wt％。在一个较佳的态样中，碳源或氮源相对于培养基总重量，各别的添加比例为3至7wt％。在一较佳实施态样中，培养基包含蔗糖、酵母萃取物或其组合，且该蔗糖或该酵母萃取物的添加比例相对于培养基总重量为1wt％至10wt％。培养条件除培养基的成分以外，尚有培养温度与转速需要设定。培养温度可设定于32℃至42℃。在一个较佳的态样中，培养温度为35℃至40℃，更佳为37℃。转速可设定于5至50rpm。在一个较佳的态样中，转速为10至35rpm，更佳为20rpm。在于特定条件下可以顺利量产gkm3后，针对其菌种特性进行研究。已知乳酸杆菌要于动物体内有效地发挥功效，需要对动物体的消化系统中肠胃道所分泌的胃酸或胆碱具有耐受性，始能于消化道中存活，到达欲发挥功效的消化道部位。再者，乳酸杆菌成功存活且到达欲作用的消化道位置后，需具备对于肠胃道细胞的吸附能力，始可与肠胃道中的有害病原菌竞争吸附。若对于细胞的吸附能力不够，即会被吸附能力强的有害病原菌排除，而无法停留于肠胃道中有效发挥功能。纵使尚未有有害病菌吸附于肠胃道细胞上以感染动物体，若乳酸杆菌具备高吸附能力，亦可排除后来的病原菌，避免肠胃道不为有害病原菌所吸附，避免肠胃道的病菌感染。据此，比较gkm3与其他菌种于酸或胆盐的环境下的耐受能力，以及对于动物体细胞的吸附能力。除上述基本的特性外，本发明亦研究gkm3于动物体内的生理作用，以开发gkm3的医药用途。藉由高脂饮食以导致肥胖的大鼠，测量其体重计算变化量，并于大鼠牺牲后取其脏器、脂肪组织与血液，以研究喂食gkm3对于因高脂饮食引起的肥胖于动物体的各种生理面向，例如：体重、脂肪、脏器、血清中肥胖相关的指标、粪便，甚至是发炎或过敏反应相关指标上的影响。经这些实验结果证实，gkm3对于肥胖所引起的多面向的病理反应具备缓解的作用，亦可有效改善过敏症状。于研究结果得知gkm3对于改善动物体健康有益下，将gkm3应用于医药用途上，开发为一种包含gkm3的组合物。在一较佳实施态样中，所述组合物进一步包含添加剂。所述添加剂可为赋型剂、防腐剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、甜味剂、或其组合。所述赋型剂可选自柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸钙或其组合。所述防腐剂可延长医药组合物的储藏期限，例如苯甲醇、对羟基苯甲酸(parabens)。稀释剂可选自水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合。填充剂可选自乳糖、牛乳糖、高分子量聚乙二醇或其组合。吸收促进剂可选自二甲基亚砜(dmso)、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其组合。甜味剂可选自安塞甜(acesulfamek)、阿斯巴甜(aspartame)、糖精(saccharin)、三氯蔗糖/蔗糖素(sucralose)、纽甜(neotame)或其组合。除上述所列举的添加剂以外，在不影响gkm3的医药效果前提下，可依需求选用适合的其他添加剂。在一较佳实施态样中，所述组合物为药品、饲料、饮料、营养补充品、乳制品、食品或保健食品。在一较佳实施态样中，所述组合物的形态为粉剂、锭剂、造粒、栓剂、微胶囊、安瓶(ampoule/ampule)、液剂喷剂或塞剂。本发明的组合物可使用于动物或是人类。在不影响gkm3的效果的前提下，可以制为任何药物型态，并根据药物型态以适用的途径施予动物或人类。下列记载的实施态样是用以进一步阐释本发明的优点，但并不欲对本发明的保护范围产生限制。实施例一：菌种的采集与分离纯化拜访宜兰、花莲、台东等各地从事农作的农户家庭，观察高龄75岁以上仍可自给自足、灵活耕种的高龄农民。推论应长期摄取含有乳酸菌食品，意即长期接触独特益生功效的菌株，而有助于高龄农民维持良好的生理机能。因此，采集各地可能含有乳酸菌的样品，将所述样品保存于密封的无菌袋，并冷藏于行动冰箱中带回实验室，以分离纯化样本中所含有的益生菌株。首先，配制含有不同营养源的培养基，以筛选出样品中不同种类的乳酸菌株，培养基的成分与种类举例如：mrs琼脂、pca琼脂、m17琼脂、rogosa琼脂、tos-mup琼脂、mrs琼脂添加3％nacl或mrs琼脂添加0.05％溴甲酚绿(bromocresolgreen)。接着，将采集的菌种在37℃下于这些不同种类的培养基培养48小时后，从每种培养基的平板挑选约5～10个菌落外观不同的单一菌落。这种单一菌落各别在37℃下于mrs培养基培养16小时后，以无菌甘油冷冻保存于-80℃的环境，待进行后续这些菌种的耐酸性、耐胆碱及肠道吸附力测试，或其他动物实验以测试生理活性。最终发现采集自宜兰礁溪乡山区，以有机栽培的蔬果腌制而得的发酵液作为的样本中，分离出的菌株具优异的耐酸、耐胆盐及肠道吸附性，特命名为gkm3。实施例二：菌种的基因分析与鉴定首先收集gkm3的dna进行定序，并藉由基因比对判别菌种。将gkm3划线活化，以接种环勾取单一菌落接种至培养基中放大。隔日收取新鲜菌体以ctab法抽取菌株gdna，以0.6％琼脂胶体电泳确认gdna品质。经浓缩后以第三世代定序技术平台pacbiorsii进行菌株全基因体分析。根据该全基因体分析结果，gkm3全基因体长度为3,076,381bp，并包含一49,415bp的质粒(seqidno：1)。于全基因体资料库进行gkm3全基因体序列的比对，得知gkm3的phes(seqidno：2)及recn(seqidno：3)基因序列。接着，于ncbi资料库比对gkm3的phes基因(seqidno：2)序列。结果显示gkm3的phes基因与胚芽乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)的基因相似度最高，得知gkm3的菌种类别为胚芽乳酸杆菌。再者，比对gkm3与其他菌株的特定基因片段，研究gkm3于演化上的独特性。从食品工业发展研究所生物资源保存与研究中心随机挑选购买3种胚芽乳酸杆菌，其编号分别为bcrc12251、bcrc80222与bcrc80578。将菌株活化放大抽取gdna后，分别以如下表1的引物对，经94℃反应3分钟后，再进行94℃反应30秒、52℃反应30秒、72℃反应1分钟30秒的35个循环，最后以72℃反应5分钟的条件，进行聚合酶链反应。表1：phes及recn于聚合酶链反应的引物对名称序列序列编号phes-f5’-atgagtttacaagatcgattaaccg-3’seqidno：4phes-r5’-ctaacctttcttatagaactgtgacaa-3’seqidno：5recn-f5’-gtgttacaagaattatcaattacgaactt-3’seqidno：6recn-r5’-ttaatcrtctttttcctcatcgg-3’seqidno：7反应完成的样品送件进行定序，取得3株菌的phes及recn基因序列。此外，除取得上述购买的3种菌株的phes及recn基因序列外，另由ncbi资料库中下载以下5种菌株的phes与recn序列，其为胚芽乳酸杆菌菌株lz95(cp012122)、b21(cp010528)、jdm1(cp001617)、wcfs1(al935263)及lactobacillusparaplantaruml-zs9(cp013130)。针对本发明的gkm3、购买的3种胚芽乳酸杆菌以及资料库下载的5种菌株的phes与recn序列，以phylogeny的megabootatraptest的neighbor-joining模式绘制演化树。phes序列的比对结果显示于图1，recn序列则显示于为图2。根据图1与图2的结果，lactobacillusparaplantaruml-zs9(cp013130)作为外群(outgroup)，被当作其他菌种相似度的比较基准，其与gkm3以及其他7种菌种在演化树中的距离相距最远。图2中，位于最上方的gkm3与由资料库取得的b21(cp010528)最为相近，说明两者于phes基因序列的比对在演化关系中最接近。图2中，gkm3同样位于最上方，与其接近的菌种是资料库取得的lz95(cp012122)与购入的bcrc12251，得知于recn基因序列的比对中，gkm3与此两种菌株相较于其他种菌株更为接近。据此，综观比较phes与recn基因序列所得的演化树，gkm3在演化树中的位置可与其他菌株区隔而自成一线，说明gkm3与现有胚芽乳酸杆菌品系存在差异，为一新颖胚芽乳酸杆菌菌株。实施例三：菌种培养研究不同培养条件对于gkm3的产量的影响。以一次一因子试验法，针对培养gkm3的发酵培养基中的碳源与氮源进行测试。首先从碳源的需求着手，比较8种碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖醇、甘油及糖蜜的条件下gkm3的菌落数多寡及对于周边白血球淋巴细胞的ifn-γ诱导的能力，以选用对gkm3的产量高、生理活性高碳源。于mrs培养基中，添加相对于培养基总重量3wt％上述8种的碳源，并设定培养温度于约37℃、转速约20rpm。实验结果中较佳的4种碳源及其活菌菌落形成数目显示如下表2，结果发现以蔗糖培养的菌落形成数目最高为4.2x109cfu/ml，相较于对照组的3.1x109cfu/ml有显著提升，说明蔗糖培养的gkm3的产量最高。将以上述四种产量较佳的碳源所培养的菌株数目调整至1x109cfu/ml，进行周边白血球淋巴细胞的ifn-γ诱导功效性的试验。结果显示如下表2，结果发现以蔗糖培养的gkm3提升ifn-r的活性最高达553pg/ml，相较于对照组的402pg/ml，增加幅度达32％，说明蔗糖培养的gkm3的生理活性最高。在同步考量高产量与生理活性的试验结果下，评估以蔗糖作为碳源最适合gkm3的发酵培养。接着，以蔗糖为固定碳源，测试不同氮源对gkm3益生菌的影响，7种氮源选择如下：大豆蛋白、酵母抽出物、牛肉萃取物、酪蛋白粉、乳清蛋白粉、鱼蛋白水解物及植物萃取蛋白。经培养后观测浓度(od600)与菌数计数比较，可发现酵母抽出物促进gkm3的生长效果最佳。据此，以蔗糖搭配酵母抽出物作为培养基成分，与商业配方mrs液态培养基进行产量比较，发现新开发出的培养基配方在gkm3的发酵测试中，活菌数的菌落形成数目达到4.6x109菌落形成单位/毫升(cfu/ml)，相较于mrs培养基增加48％。证明新配方的发酵培养基有效提高gkm3益生菌的产量，gkm3可为大量生产，增加该gkm3于商业上应用的可行性。表2：不同碳源的产量与生理活性实施例四：耐酸试验比较gkm3相对于其他菌种的耐酸能力。将gkm3、从食品工业发展研究所生物资源保存与研究中心购入的bcrc12251、bcrc80222与bcrc80578共4种菌株活化。原始mrs液态培养基的酸碱值约为ph6.5，藉由添加hcl至mrs液态培养基中，调整该培养基的酸碱度为另3种不同酸碱度：约ph3.2、ph2.4与ph2.0。将菌株接种在这些不同酸碱值的培养基，于37℃下培养3小时后，计数菌落形成数目。结果如图3所示，于原始ph培养下(约ph6.5)，gkm3与其他3种菌株的菌数皆可达到10次方。于酸碱值为ph3.2时，全部菌株的菌数略为下降，gkm3与其他3种菌株相较未出现显著差异。当酸碱值下降至ph2.4跟ph2.0时，bcrc12251、bcrc80222与bcrc80578的菌数陡降至约6次方，都显著低于菌数维持于8次方的gkm3(p<0.05)。据此，得知在酸性环境下gkm3的活菌数显著多于他种菌株，说明gkm3的耐酸能力较好，对于通过胃部时抵御胃酸的能力更佳。实施例五：耐胆盐试验比较gkm3相对于其他菌种的耐胆盐能力。将gkm3、从食品工业发展研究所生物资源保存与研究中心购入的bcrc12251、bcrc80222与bcrc80578共4种菌株活化。将这些菌种接种于含0.3％胆盐的mrs液态培养基中，于37℃下浸泡半小时后，观察并计数菌数。结果如图4所示，于原始mrs液态培养基培养下，gkm3与bcrc12251、bcrc80222与bcrc80578的单位菌数皆接近9x109。在添加有0.3％胆盐的mrs中，bcrc12251、bcrc80222的菌数都显著低于gkm3菌数(p<0.05)，bcrc80578的菌数则与gkm3统计上无显著差异。据此，得知在胆盐环境下，gkm3的活菌数显著多于他种菌株，说明gkm3的耐酸能力较好，对于通过体内消化道时抵御胆盐的能力更佳。实施例六：肠道吸附试验比较gkm3相对于其他菌种的肠道吸附能力。将gkm3、从食品工业发展研究所生物资源保存与研究中心购入的bcrc12251、bcrc80222与bcrc80578共4种菌株活化，并调整起始菌数至10的7次方，加入至培养的ht-29细胞中。该ht-29细胞是一种肠癌细胞，培养在含10％胎牛血清(hyclonetm)的dmem(sigma)培养基中，并添加1mm丙酮酸钠(sigma)、1％非必需氨基酸(neaa)与1％抗生素(青霉素100units/ml与链霉素100μg/ml)，置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养，约2至3天为周期继代。加入菌株的ht-29细胞于37℃下培养2小时后，以pbs洗去未吸附细胞的菌，再利用1％tritonx-100裂解ht-29细胞，使吸附在细胞表面的菌释出，并计算菌数。结果如图5所示，bcrc12251、bcrc80222与bcrc80578吸附在ht-29细胞上的菌数，都显著低于gkm3吸附的菌数(p<0.05)。据此，可得知gkm3在肠道吸附能力上优于其他菌种，能有效于肠道中停留较长的时间，以发挥效益。实施例七：动物实验i试验动物由乐斯科生物科技公司(biolascotaiwanco.，ltd.，taiwan)订购18只6周龄且体重介于201-225g的雄性wistar大白鼠。将动物饲养于不锈钢鼠笼，而动物房温度控制在22±2℃，湿度控制在60-80％，光照与黑暗各十二小时(07:00-19:00为光照期；19:00-07:00为黑暗期)。本实验操作经由中山医学大学实验动物照护及使用委员会(chungshanmedicaluniversityanimalcarecommittee)核准通过(iacucahpp-grovalno:1199)。试验期间，大鼠自由摄食饲料和蒸馏水。试验动物喂予正常成鼠饲料和饮用蒸馏水适应环境1周后，将其随机分为每组6只共三组，如下：1.正常饮食组(normaldiet，nd)2.高脂饮食组(high-fatdiet，hfd)饲料配方为以ain93g作为基础，加以调整油脂比例。饲料中包含固形物68％、大豆油7％和猪油25％。3.高脂饮食组给予gkm3(hfd+gkm3)除与高脂饮食组相同的饲料配方外，经由口服方式以102.8mg/kgrat/day的份量喂食gkm3达6周。于试验开始前，先纪录大鼠的起始体重(initialbodyweight)，随后每两日精称体重。牺牲前的第三天当天收集一次大鼠粪便，并于试验结束前12小时进行禁食。利用二氧化碳(co2)进行牺牲后，纪录其最终体重(finalbodyweight)，并计算体重改变量(weightchange)。从大鼠静脉进行血液采集，将血液收集于血清分离管(bdvacutainer，plymouth，uk)中，以4000rpm离心10分钟取出血清，分装于微量离心管中并储存于-80℃冰箱，作为分析使用。取出脏器组织(心脏、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏)和脂肪组织(肾周围脂肪、副睪脂肪、肠系膜脂肪、腹股沟脂肪和腹膜外脂肪)利用生理食盐水清洗及擦拭，并纪录各个脏器和脂肪组织的重量，称量后以铝箔纸包覆，再以液态氮冷冻，储存于-80℃冰箱，以供实验分析使用。所得的实验数据使用spss电脑统计软体进行分析。变异数分析则以procanova与duncan’smultiplerangetest进行分析，p<0.05为具有显著性差异。1.体重变化根据起使体重与最终体重，以下述式1计算体重改变量。式1：体重改变量(g)＝[最终体重(g)-起始体重(g)]正常饮食组(nd)、高脂饮食组(hfd)与高脂饮食组给予gkm3(hfd+gkm3)的起始体重、最终体重与体重改变量，汇整如下表3：表3：体重组别ndhfdhfd+gkm3初始体重(g)231.52±4.36a235.30±3.45a231.22±3.66a最终体重(g)505.40±12.87b542.68±14.94a478.50±7.14b体重变化量(g)273.88±13.32ab307.38±15.21a247.28±6.72b根据表3绘制如图6，各组间的起始体重无显著差异(p＞0.05)。高脂饮食组在最终体重上显著高于正常饮食的对照组(p＜0.05)，而相较于高脂饮食组，以高脂饮食诱导肥胖的大鼠并给予gkm3的组别，其最终体重显著降低(p＜0.05)。从体重改变量亦可看到相同的趋势，喂食gkm3的组别相较于没有喂食的组别，其体重变化量较小，显示gkm3可降低由高脂饮食引起的体重增加。2.脏器重量各组别的脏器：心脏、肝脏、脾脏、肺脏与肾脏的重量显示于如下表4。表4：脏器重量组别ndhfdhfd+gkm3心脏(g)1.49±0.05a1.50±0.05a1.46±0.06a肝脏(g)15.88±0.47a17.41±0.77a13.20±0.48b脾脏(g)0.94±0.07a0.89±0.04a0.82±0.04a肺脏(g)2.37±0.08a2.45±0.20a2.21±0.15a肾脏(g)3.38±0.05a3.46±0.06a3.37±0.10a根据表4，大鼠脏器重量于心脏、脾脏、肺脏与肾脏没有显著变化。针对肝脏，高脂饮食组的重量高于正常饮食组，而喂食gkm3的组别相较于高脂饮食组则明显下降(p＞0.05)，其结果绘制如图7。据此，服用gkm3能有效降低肝脏的重量，减缓因高脂饮食所引起的肝肿大。3.脂肪重量将各脂肪的重量(mg)除以最终体重(g/rat)，计算得出各部位的脂肪量，汇整为如下表5，并绘制如图8。表5：各脂肪量从该结果可看出，喂食gkm3的组别相较于高脂饮食组，各脂肪重量都显著下降。此结果说明在高脂饮食下，gkm3仍能有效降低全身各脂肪的堆积。若将取下的脂肪组织分为内脏脂肪与皮下脂肪两类，肾周围脂肪、副睪脂肪与肠系膜脂肪属于内脏脂肪，腹股沟脂肪与腹膜外脂肪则归类于皮下脂肪，而各脂肪组织的加总则作为总脂肪量。内脏脂肪与皮下脂肪量以下式2与式3计算得出，总脂肪量以下式4计算得出，并将计算结果汇整为如下表6，并绘制为图9。式2：内脏脂肪量(mg/grat)＝[肾周围脂肪量(mg)+副睪脂肪量(mg)+肠系膜脂肪量(mg)]÷最终体重(g)式3：皮下脂肪量(mg/grat)＝[腹股沟脂肪(mg)+腹膜外脂肪量(mg)]÷最终体重(g)式4：总脂肪量(mg/grat)＝[肾周围脂肪量(mg)+副睪脂肪量(mg)+肠系膜脂肪量(mg)+腹股沟脂肪(mg)+腹膜外脂肪量(mg)]÷最终体重(g)表6：分类的脂肪量组别ndhfdhfd+gkm3总脂肪量(g)123.11±4.27a137.74±6.34a96.81±5.22b内脏脂肪量(g)82.98±2.73b94.14±3.50a67.76±3.25c皮下脂肪(g)40.13±2.27a43.59±4.02a29.05±2.48b根据图9，高脂饮食诱导的肥胖大鼠在内脏脂肪组织重量显著高于正常饮食组(p＜0.05)。高脂饮食合并给予gkm3的组别相较于单纯给予高脂饮食组，在内脏脂肪和皮下脂肪组织的重量皆显著低于高脂饮食组(p＜0.05)。此结果说明不论在内脏脂肪或皮下脂肪，gkm3有效减少因高脂饮食造成的各脂肪积存。4.肝脏脂质含量针对大鼠的肝脏进行脂质分析。将剪取下的肝脏组织称重，并于加入萃取溶剂(氯仿：甲醇为2：1(v/v)的比例)后，再以均质机磨碎。将磨碎的肝脏组织过滤至有盖试管中，以萃取液定量至10ml后，加入2ml的0.05％氯化钙(w/v)，以3500×g、4℃离心3分钟，去除上层液。接着，以氯仿：甲醇：水为3：48：47(v/v/v)的比例定量至12ml，以3500×g、4℃离心3分钟，去除上层液。再来，先加入甲醇定量至10ml，再以萃取溶剂(氯仿：甲醇为2：1(v/v)的比例)定量至25ml，即可收集于样品瓶中，储存于-20℃以作为分析实验样品。该肝脏分析样品中所含的总脂质、三酸甘油酯与胆固醇以市售试剂组进行分析。大鼠肝脏总脂质、三酸甘油脂和胆固醇的含量的实验结果显示如下表7，绘制于图10。表7：肝脏总脂质、三酸甘油脂和胆固醇含量组别ndhfdhfd+gkm3总脂质(mg/dl)66.23±5.86b90.71±10.49b76.78±3.45b三酸甘油脂(mg/dl)22.76±1.24a30.37±2.40a25.29±1.35a胆固醇(mg/dl)11.02±0.63a12.46±0.64a10.55±0.41a根据该实验结果得知，在总脂质与三酸甘油酯的含量上，单纯给予高脂饮食的组别均显著高于正常饮食的对照组(p<0.05)。而在总脂质、三酸甘油脂和胆固醇的含量上，高脂饮食合并给予gkm3的组别相对于单纯给予高脂饮食组别，在统计学上都有意义的明显降低(p<0.05)。此结果说明，gkm3有效减少因高脂饮食所导致的肝脏的脂质堆积。5.肝脏发炎物质含量酶联免疫分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay)测定肝脏中的tnf-α浓度。以冰的生理食盐水(ice–coldsaline)将肝脏组织残留的多余血液洗去，将肝脏组织置于漏斗上滴干生理食盐水后称重。接着，加入适量的酸碱值为ph7.4的缓冲溶液(0.32m蔗糖、1mmedta、10mmtris-hcl)后，以均质机打碎肝脏组织为10％的均质液(homogenate)。再以13,600×g高速离心该均质液30分钟，取上清液50μl，以tnf-αelisakit进行检测，并以分光光度计于450nm测量吸光值(a)。大鼠肝脏中的tnf-α浓度的实验结果显示于图11。如该结果所示，高脂饮食组大鼠的肝脏中tnf-α的浓度显著高于正常饮食组别。相较于高脂饮食组的大鼠，经高脂饮食诱导的肥胖大鼠合并给予gkm3的组别的肝脏中tnf-α的浓度明显下降。此结果显示，服用gkm3会降低肝脏中tnf-α的浓度，gkm3具有降低体内发炎反应的功效。6.肝指数经离心分离大鼠静脉血液取得的血清，以市售分析套组(diasyscoltd.，holzheim，germany)测定天门冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferase，ast)与丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase，alt)的浓度，实验结果显示如下表8，绘制为图12。表8：血清中ast与alt的含量组别ndhfdhfd+gkm3ast(u/l)72.40±6.07283.40±40.76135.14±6.60alt(u/l)46.83±6.2379.70±2.7438.08±8.40结果显示，高脂饮食组大鼠的血清中alt和ast显著高于正常饮食的对照组(p＜0.05)，说明其肝脏的损坏程度较高。反观高脂饮食诱导的肥胖大鼠合并给予gkm3的组别，其相较于高脂饮食组，可显著降低血清中alt和ast的浓度(p＜0.05)。此结果说明，服用gkm3会降低血清中alt和ast的浓度，gkm3有效改善肝功能。7.血清脂质含量经离心分离大鼠静脉血液取得的血清，以市售分析套组(diasyscoltd.，holzheim，germany)测定血清中三酸甘油脂(triglyderide)、总胆固醇(totalcholesterol)与高密度脂蛋白胆固醇(hdl-cholesterol)的浓度，实验结果显示于下表9，并依序绘制为图13。表9：血清中三酸甘油脂、总胆固醇与高密度脂蛋白胆固醇含量结果显示，高脂饮食组大鼠的血清中三酸甘油脂显著高于正常饮食组(p＜0.05)。相对于高脂饮食组，高脂饮食诱导的肥胖大鼠合并给予gkm3的组别的三酸甘油脂含量显著降低。高脂饮食的肥胖大鼠总胆固醇含量约为148.35(mg/dl)，经服用gkm3后，总胆固醇降至约90.55(mg/dl)，显示服用gkm3亦能降低高脂饮食血清中的总胆固醇浓度。高脂饮食组大鼠的血清中高密度脂蛋白胆固醇显著低于正常饮食组(p＜0.05)。相对于高脂饮食组，高脂饮食诱导的肥胖大鼠合并给予gkm3的组别的高密度脂蛋白胆固醇含量些微提升。此结果说明，服用gkm3能提高血清中高密度脂蛋白胆固醇的浓度。8.血清酮体经离心分离大鼠静脉血液取得的血清，酮体以市售分析套组(denkaseikencoltd.，taipeicity，taiwan)进行测定，实验结果显示于下表10，并绘制为图14。表10：血清中酮体含量组别ndhfdhfd+gkm3酮体(mmol/l)5.68±0.20b7.17±0.33a5.18±0.43b结果显示，高脂饮食组大鼠的血清中酮体含量显著高于正常饮食组(p＜0.05)。经高脂饮食诱导的肥胖大鼠合并给予gkm3的组别，显著降低高脂饮食所诱导引起的血清酮体浓度上升情形(p＜0.05)，降低高脂饮食诱导的肥胖大鼠的酮体含量约27.8％。此结果显示，服用gkm3会降低高脂饮食血清中酮体浓度。9.血清尿酸经离心分离大鼠静脉血液取得的血清，尿酸以市售分析套组(diasyscoltd.，holzheim，germany)进行测定，实验结果显示于下表11，并绘制为图15。表11：血清中尿酸含量组别ndhfdhfd+gkm3尿酸(mg/dl)5.72±0.10b7.47±0.15a5.68±0.11b实验结果显示，高脂饮食组别的大鼠的血清中，尿酸含量显著高于正常饮食组别。高脂饮食合并给予gkm3的组别，与高脂饮食组别相比，显著降低血清中尿酸的浓度(p＜0.05)至正常饮食组的水准。此结果说明，施予gkm3对于降低血清中尿酸具备功效。10.粪便脂肪排出以牺牲前第三天当天收集的大鼠粪便，进行所含总脂质含量的测定。称重收集干燥的粪便并将其磨碎，加入萃取溶剂(氯仿：甲醇为2∶1(v/v)的比例)后进行振荡并以滤纸过滤。接着，于滤液中加入0.05％的氯化钙，混匀后以3500xg、4℃离心5分钟，去除上清液，再以萃取溶剂定量至25ml，储存于-20℃以备作为后续分析实验的样品。取作为样品的该粪便脂质萃取液10ul，经减压浓缩机抽干后，加入市售试剂组的反应剂1000μl混匀后，37℃水浴5分钟。接着，以分光光度计测量500nm波长的吸光值，并控制标准液吸光值换算取得粪便脂质浓度。实验结果显示于下表12，并绘制为图16。表12：粪便总脂质含量组别ndhfdhfd+gkm3粪便总脂质(mg/g粪便)23.66±3.64c35.17±3.02b50.34±4.22a结果显示高脂饮食组的粪便总脂质显著高于正常饮食组(p＜0.05)。但于高脂饮食合并给予gkm3的组别，相较于高脂饮食组，粪便中脂质的排出量显著提升(p＜0.05)。此结果说明对高脂饮食所导致的肥胖大鼠给予gkm3，具有增加以粪便方式排出脂质的效果。实施例八：动物实验iibalb/c雄鼠4至5周大共36只，饲养一周待其适应环境后开始实验。首先随机分为以下三个组别，每组12只。1.正对照组：无致敏、喂食0.9％生理食盐食水、无喂食gkm3。2.负对照组：致敏、喂食0.9％生理食盐食水、无喂食gkm3。3.gkm3组：致敏、喂食0.9％生理食盐食水以及gkm3。根据上述组别连续喂食生理食盐水、及gkm30.2ml达四周，并于第三周及第四周于皮下注射ova抗原诱导过敏，于第五周鼻腔气管内以ova抗原致敏，两天后以非侵入的方式进行呼吸道阻力测试。呼吸道阻力测试以buxco出产的whole-bodyplethysmogragh(wbp)，进行非侵入性的小鼠呼吸道阻力变化的测量，其阻力变化是依据小鼠呼吸过程中测得的数值经电脑分析后，得到一个肺功能指标penh(enhancedpause)值来表示，数值越高代表呼吸道阻力越大。首先将小鼠放进动物舱中，测量小鼠的基础penh值三分钟。接着将小鼠暴露在雾化的0.9％nacl三分钟后，测量penh值三分钟。接着将小鼠暴露在雾化的非特异性气管收缩刺激剂-乙酰甲胆碱(methacholine)(3.125mg/ml)三分钟后，测量penh值三分钟，以逐渐增高浓度的乙酰甲胆碱(methacholine)，浓度分别为6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml，重复上述步骤，以penh来表示所有得到的数值加以平均计算。实验结果显示于图17。由结果来看，正对照组因未致敏，在乙酰甲胆碱(methacholine)的刺激下呼吸道阻力最小，而其他两组呼吸道阻力显著提升，显示确实有致敏成功。相较于致敏后未喂食gkm3的小鼠(负对照组)，致敏后喂食gkm3的组别在渐进浓度的呼吸道刺激剂乙酰甲胆碱(methacholine)的刺激反应下，于各浓度乙酰甲胆碱(methacholine)的刺激反应显著较低(p＜0.05)。此结果说明gkm3具有改善因过敏原所引起的呼吸道压力的效果。实施例八：动物实验iii自实验研究院实验动物中心购入二十只雄性c57bl/6jnarl小鼠。经一周观察期将小鼠随机分组，每盒饲养5只。垫料采用美国nepco公司(warrensburg，ny，usa)实验动物专用木屑(aspenandshreddedaspenshavings)，经灭菌后使用，每周更换2次。喂食方式采用任食、任饮。饲养方式按一般(conventional)实验动物管理方法进行，环境设定为温度23±2℃、相对湿度50±10％、12小时光照/黑暗交替。本实验设计经食品工业发展研究所动物实验管理小组审核通过(动管字第106-10号)。购入的二十只小鼠分为对照组及gkm3实验组两组，每组10只。gkm3实验组以500mg/kg小鼠剂量的剂量、0.1ml/10g体重/天的体积连续管喂十四天，对照组则喂食水。于喂食期间每周量测一次体重、各两次饲料摄取量及饮水量。十四天后，进行口服葡萄糖耐受性测试。小鼠禁食16小时后，自尾端采集血液样本，以glucosureii血糖机(apexbioinc.，taiwan)搭配血糖测试片(葡萄糖氧化酶法)检测空腹(0分钟)血糖值。接着，每只小鼠管喂葡萄糖溶液2g/kg，并分别于30、60及120分钟时检测血糖浓度。口服葡萄糖耐受性测试完成后，牺牲小鼠并取其肝、肾、脾脏进行称重。实验结果以mean±sem表示，以student’st-test比较gkm3实验组与对照组的实验结果，*及**分别表示与水对照组之间p<0.05、p<0.01。小鼠体重与总体增重变化的结果显示于下表13；平均每日摄食量及饮水量显示于下表14；小鼠脏器重量显示于下表15；小鼠于口服葡萄糖耐受性试验的血糖值显示于下表16并绘制为图18与图19；口服葡萄糖耐受性试验的血糖上升值显示于下表17，并绘制为图20与图21。表13：体重与增重变化表14：摄食量及饮水量组别摄食量(gm/day/mouse)饮水量(ml/day/mouse)对照组2.9±0.14.4±0.2gkm33.0±0.13.9±0.0表15：脏器重量从上述表13-15得知，管喂十四天后gkm3组的体重及体增重(克数及百分比)、饮水量与饲料摄取量、脏器重量及其相对重量比，与对照组无统计上的显著差异(p>0.05)。表16：口服葡萄糖耐受性试验的血糖值表17：口服葡萄糖耐受性试验的血糖上升值从上述表16与17得知，在口服葡萄糖耐受性试验中，gkm3实验组的30分钟血糖值均显著地较对照组低，gkm3组的120分钟血糖曲线下面积(areaundercurve，auc120min)亦略低于水对照组(p<0.05)。针对血糖上升值(bloodglucoseincrements)，实验组的30分钟血糖上升值(i30min)以及120分钟血糖上升曲线下面积(iauc120min)都明显低于水对照组。综合以上，显示在500mg/kg剂量之下，gkm3具有改善葡萄糖敏感性的潜力。序列表<110>葡萄王生技股份有限公司<120>胚芽乳酸杆菌及其降尿酸、改善过敏和降血糖用途<130>gai17tw3738<150>tw106136136<151>2017-10-20<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>49415<212>dna<213>lactobacillusplantarumstraingkm3<400>1tgttggagttgtcgtttgaaaaagaagttgttaaaaccttaacgactggaagtaatcaat60gggtggaacgcaaagacctgtatggtgcgacgccggatcaattatgggctaattttcgtg120ataaattaaataacaataactatgctaaattgcagggacaccctttaactgataccgaat180ttaatcaggttaaacgggcgattgaggtccggacaccttacgaagcagctaagttactag240ccgccgaaaatggcattggcaaagttgaagttgaacgtgatgatgctaagctgggcacgg300tgacgctcgagttgttttggaaagcggacgttgctggcggta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