本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种重组黄花蒿1类变应原蛋白及其编码基因和表达纯化方法。
背景技术：
近年来过敏性花粉症的发病率呈逐年上升，欧洲的发病率由20世纪初的1％上升到了20％，并预计在未来20年内可达到35％。我国花粉症患者已逾1000万人，城市居民发病率为0.9％左右，流行区可达5％，随着城区树木花草品种越来越多，花粉过敏症患者有增加的趋势。
花粉是高等植物的雄性生殖细胞，在风或虫的作用下，在空气中传播，有些人在呼吸过程中吸人花粉后，便会产生过敏反应。花粉的飘散具有明显的季节性。春天的风媒花粉多来源于树木；晚春和初夏的风媒花粉多来源于牧草；夏末和秋初的风媒花粉多来源于杂草。目前已知可以引起人类过敏的花粉主要有蒿属花粉(artemisia)、豚草属花粉(ambrosia)、蓖麻属花粉(ricinus)、葎草属花粉(hummlus)、藜属花粉(chenlpldum)、苋属花粉(amaranthus)、木麻黄属花粉(casuarina)、桦木属花粉(betula)、松属花粉(pinus)、云杉属花粉(picea)、柳杉属花粉(cryptomeria)、悬铃木属花粉(platanus)等。这些植物的花粉因其病原性强，致敏率高，数量大，散播范围广；且植物自身分布的范围广，数量亦丰富，对花粉污染的影响大，因而这些植物成为较重要的花粉污染源植物。由于花粉污染源植物的分布受气候、土壤、生物和地形等因素的影响，因而不同地区，其主要的花粉污染源植物亦不相同。在我国，因多数地区(如北京、新疆、山西、山东、武汉、沈阳、广州、宁夏等地)的主要花粉均为蒿属植物花粉，因此我国的花粉污染源植物以蒿属植物最为严重。
目前，临床上主要采用黄花蒿粗提液治疗蒿属花粉过敏引起的过敏性鼻炎与过敏性哮喘等过敏性疾病的脱敏治疗，例如浙江我武生物2016年6月份批准的黄花蒿粉滴剂即为黄花蒿提取液。由于天然变应原提取液的组成非常复杂，界定其组分非常困难，含大量杂质、色素以及非活性成分，诊断特异性及疗效不理想，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。
而另一方面，黄花蒿变应原蛋白本身属于植物蛋白，在现有常用的原核或真核表达系统中表达都有一定困难，也并见相关文献公开。
技术实现要素：
为了克服以上缺点，发明人将重组黄花蒿1类变应原(以下简称rarta1)基因在哺乳动物细胞cho表达系统中进行了优化，并在分子设计时加入了提高rarta1表达的作用原件，发明人惊喜地发现，经过基因优化后rarta1与现有技术相比具有更高的表达量，且与天然蛋白相比具有相似的生物学活性。
本发明的一个目的是提供一种编码rarta1蛋白的dna序列，其碱基序列如seqidno:1所示。该序列针对哺乳动物细胞cho表达系统进行了密码子优化，其更利于rarta1在哺乳动物细胞cho中表达。
本发明的另一个目的是提供一种rarta1蛋白，其氨基酸序列如seqidno:3所示。
本发明的另一个目的是提供一种含有上述编码优化后rarta1基因的载体，优选的，所述的载体为pcdna3.1，pcdna3.3-topo，poptivectm-topo，pcho1.0。
本发明的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的哺乳动物细胞cho细胞株，优选的，所述哺乳动物细胞cho细胞株为cho-k1，cho-dhfr，dg44，cho-s。
上述所述载体优选为pcho1.0或poptivectm-topo，更优选为pcho1.0。
上述所述哺乳动物细胞cho细胞株优选为dg44或cho-s细胞株，更优选为cho-s细胞株。
本发明的另一个目的是提供一种rarta1蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：
a.构建含有上述编码rarta1基因的载体；
b.将步骤a的载体线性化后转入哺乳动物细胞cho细胞株中，并在合适的条件下培养；
c.回收纯化蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种rarta1蛋白纯化方法，所述纯化方法如下：
a.将rarta1分批补料培养液低温高速离心收集上清，20mm磷酸盐缓冲液超滤，0.45μm滤膜过滤。
b.阳离子交换层析，用平衡缓冲液平衡层析柱，接着运用全自动智能蛋白纯化系统(aktaavant150，购自gehealthcare公司)中q阀对平衡缓冲液和洗脱缓冲液进行自动配置，将步骤a中预处理的分批补料培养液通过分离填料，然后运用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，平衡缓冲液和洗脱缓冲液ph＝5.5。
本发明的另一个目的是提供一种rarta1蛋白在制备治疗黄花蒿花粉过敏症药物中的应用，所述rarta1蛋白的氨基酸序列如seqidno:3所示。
本发明在哺乳动物细胞中表达的rarta1不仅具有较高的产量，而且与narta1相比具有非常相似的生物学活性。并且，制备和纯化工艺简单，经一步纯化即可获得重组变应原。与粗提液相比具有以下优势：(1)重组变应原具有更高的纯度，与粗提液相比不含非变应原成分、酶类、酶抑制剂和毒性蛋白等；(2)重组蛋白具有较好的特异性，粗提液中成分复杂，患者可能只与其中部分成分反应，特异性差，而重组变应原成分单一，特异性好；(3)重组变应原活性可替代天然提取液，与天然提取液相比减少ige结合的抗原表位，有效降低ige介导的过敏反应，同时保留变应原t细胞识别所必须的结构域，具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果。
附图说明
图1表示优化前后重组rarta1基因序列对比图。
其中优化前序列对应的为天然rarta1基因核苷酸序列；优化后序列对应的为本发明的重组rarta1的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。
图2-a，图2-b为优化前后rarta1基因在哺乳动物细胞cho表达系统中的cai指数。
其中，图2-a表示天然rarta1基因核苷酸序列在哺乳动物细胞cho表达系统中cai指数经程序计算为0.75；图2-b表示优化后的本发明的rarta1密码子在哺乳动物细胞cho表达系统中cai指数经程序计算为0.95。
图3-a，3-b为密码子优化前后rarta1基因在哺乳动物细胞cho表达宿主中最优密码子频率分布区域图。
其中图3-a表示rarta1天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞cho系统中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：rarta1天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为9％；图3-b表示优化后的本发明的rarta1密码子在哺乳动物细胞cho系统中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的rarta1密码子序列低利用率密码子出现为0。
图4-a，4-b为密码子优化前后rarta1基因在哺乳动物细胞cho表达系统中平均gc碱基含量分布区域图。
其中，图4-a表示rarta1天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞cho表达系统中平均gc碱基含量为：52.64％；图4-b表示优化后的本发明的rarta1密码子在哺乳动物细胞cho表达系统中平均gc碱基含量为：58.97％。
图5为rarta1基因pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图。
其中，泳道1为500bpdnaladder；泳道2为两端含有avrii和bstz17i酶切位点的rarta1基因pcr产物。
图6为rarta1表达质粒pcho1.0-rarta1构建过程图。
图7-a，7-b为rarta1基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养表达鉴定图。
其中，图7-a为rarta1基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养液上清sds-page凝胶电泳图。其中泳道1为哺乳动物空细胞补料分批流加培养10天后上清培养液，泳道2为rarta1基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养第3天上清培养液，泳道3为10-250kd范围的预染蛋白上样marker，泳道4-10分别为rarta1基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养第4-10天上清培养液。
图7-b为rarta1基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养液液上清蛋白免疫印迹图。其中泳道1为天然arta1蛋白样品，泳道2为rarta1基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养第3天上清培养液，泳道3为10-250kd范围的预染蛋白上样marker；泳道4-10分别为rarta1基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养第4-10天上清培养液。
图8-a，8-b为ph＝5.5时，rarta1补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图和凝胶电泳图。
其中，图8-a为ph＝5.5时，rarta1补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图；
图8-b为ph＝5.5时，rarta1补料分批流加培养上清阳离子层析纯化凝胶电泳图。泳道4为11-100kd非预染蛋白marker，其他各泳道为各洗脱收集分管。
图9-a，9-b为ph＝6.0时，rarta1补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图和凝胶电泳图。
其中，图9-a为ph＝6.0时，rarta1补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图；
图9-b为ph＝6.0时，rarta1补料分批流加培养上清阳离子层析纯化凝胶电泳图。泳道6为11-100kd非预染蛋白marker，其他各泳道为各洗脱收集分管。
图10-a，10-b为ph＝6.5时，rarta1补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图和凝胶电泳图。
其中，图10-a为ph＝6.5时，rarta1补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图；
图10-b为ph＝6.5时，rarta1补料分批流加培养上清阳离子层析纯化凝胶电泳图。泳道7为11-100kd非预染蛋白marker，其他各泳道为各洗脱收集分管。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1rarta1密码子优化
发明人根据embl-ebi已公开的artemisiaannuapartialmajorpollenallergenartv1-likeprotein的dna序列(embl-ebi登录号：ahf71022.1)，如seqidno：2所示，对该基因进行密码子优化后得到本发明的rarta1基因，核苷酸序列如seqidno：1所示，氨基酸序列如seqidno：3所示。下面是对rarta1密码子优化前后各参数对比如下：
1.密码子适应指数(cai)
由图2-a可知，密码子没有优化前，rarta1原始基因在哺乳动物细胞cho表达系统中密码子适应指数(cai)为0.75。由图2-b可知，通过密码子优化，rarta1基因在哺乳动物细胞cho表达系统中cai指数为0.95。通常cai＝1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，cai指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高rarta1基因在哺乳动物细胞cho表达系统中的表达水平。
2.最优密码子使用频率(fop)
由图3-a可知，基于哺乳动物细胞cho表达载体，密码子没有优化前，rarta1基因序列的低利用率密码子(利用率低于40％的密码子)出现百分比为9％。这条未进行优化的基因采用串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，rarta1基因在哺乳动物细胞cho系统中出现低利用率密码子的频率为0。
3.gc碱基含量(gccurve)
gc含量理想分布区域为30％-70％，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的rarta1基因的gc碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示rarta1基因gc碱基平均含量为52.64％，由图4-b中显示出优化后去除在30％-70％区域外出现的gc含量峰值，最终得到优化后rarta1的gc碱基平均含量为58.97％。
实施例2：含有rarta1基因的表达质粒构建
将密码子优化后的rarta1在5’端引入avrii酶切位点序列，在3’端引入bstz17i酶切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到puc57质粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，记为puc57-rarta1质粒。
以puc57-rarta1质粒为模板，进行pcr扩增，所用引物序列如下：
上游引物(seqidno：4)：
m13f:tgtaaaacgacggccagt
下游引物(seqidno：5)：
m13r:caggaaacagctatgac
反应总体积50μl，其中浓度为10μmol/l引物各加2.5μl，浓度为10mmol/l的dntp加1μl，所用dna聚合酶为q5(#m0491l，购自newenglandbiolabs公司)，2u/μl，加0.5μl。反应条件为98℃5秒、55℃45秒、72℃30秒，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(450bp)一致(结果如图5所示)。
用avrii(#r0174s，购自newenglandbiolabs公司)和bstz17i(#r0594s，购自newenglandbiolabs公司)双酶切后，1％琼脂糖电泳，得到的基因产物用dna凝胶回收试剂盒(dp214，购自北京天根生化科技有限公司)纯化。用t4连接酶(m0202s，购自newenglandbiolabs公司)连接到pcho1.0质粒(购自life公司)中，转化到top10感受态细胞(cb104，购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有卡那霉素(0408，购自amresco公司)的lb固体培养基中37℃培养过夜。
第二天挑取阳性克隆菌pcr鉴定，并将阳性结果进行测序比对，与预期序列完全一致，即得到rarta1密码子优化后的表达质粒，记为pcho-rarta1(质粒构建如图6所示)。
实施例3：含有rarta1基因稳定表达哺乳动物细胞株制备
puromycin为氨基糖甙类抗生素，通过干扰核糖体功能阻断哺乳动物细胞的蛋白质合成，来自链霉菌的pac基因具有解除puromycin毒性的作用。pcho1.0载体含有pac基因，因此可利用puromycin作为pcho1.0为表达载体的筛选抗生素。mtx为叶酸拮抗剂，在细胞内经过转换后可抑制dhfr的活性，抑制核酸合成，引起细胞毒性。pcho1.0含有dhfr基因，可利用mtx作为筛选试剂。利用转染后的细胞含有puromycin和mtx抗性基因，不断增加筛选试剂的浓度来增加阳性细胞中目的基因拷贝数从而提高表达量。
将测序正确的pcho-rarta1质粒用nrui限制内切酶(#r0192s，购自newenglandbiolabs公司)线性化，电转染到cho-s宿主细胞中后，分别加入低浓度的puromycin(a1113802，购自life公司)和mtx(m8407，购自sigma-aldrich公司)置于二氧化碳培养箱中37℃，8％co2进行加压筛选。10天后计算细胞活率，当细胞活率大于30％以上转移到摇床中，37℃，8％co2，130rpm悬浮培养，并不断提高puromycin和mtx浓度加压筛选提高目的基因拷贝数从而提高表达量。
实施例4：含有rarta1基因稳定表达哺乳动物株补料分批流加培养
将含有高表达rarta1稳定表达哺乳动物株接种于dynamis培养基(a2617501，购自life公司)中，37℃，8％co2，130rpm摇床中培养。
第3天，取样并计算细胞密度，当细胞密度达到5×106/ml后，加入葡萄糖至终浓度4g/l和10％cdefficientfeedtmc(a2503104，购自life公司)至培养基中。
每天计算细胞密度，第5，7天加入葡萄糖至终浓度为4g/l和10％cdefficientfeedtmc至培养基中。
第10天收集上清培养液或者检测细胞的活率和密度，当细胞的活率低于70％时或者收集上清培养液。随着葡萄糖和cdefficientfeedtmc分批补料流加，不同时间rarta1上清培养液sds-page和免疫印迹图见图7-a和图7-b，结果显示，rarta1在哺乳动物细胞中有较高的表达量，可达到100mg/l。
实施例5：rarta1蛋白的纯化工艺初步优化
通过对本专利构建的rarta1序列分析，主要对rarta1培养液采用阳离子交换纯化方法，并通过对阳离子缓冲液和ph筛选，通过sds-page纯度鉴定，几乎一步纯化rarta1纯度就达到90％以上，基本上满足对rarta1蛋白体外生物活性评价。层析填料选择为hitrapsphp(17-1152-01，购自gehealthcare公司)，具体步骤如下：
1.培养液的除杂预处理
按实施例4得到rarta1宿主细胞株补料分批培养液，12000rpm，15min低温离心收集上清，20mm磷酸盐缓冲液超滤0.45μm滤膜过滤即得处理后培养液上清，可进行层析纯化。
2.阳离子交换层析方法优化
首先配置缓冲液母液，其中缓冲液q1：0.2mna2hpo4，缓冲液q2：0.2mnah2po4，缓冲液q3：ddh2o，缓冲液q4：4mnacl，并分别过0.45μm滤膜过滤。再用全自动智能蛋白纯化系统(aktaavant150，购自gehealthcare公司)中q阀对平衡缓冲液和洗脱缓冲液进行自动配置ph＝5.5，6.0，6.5，将上一步预处理的ph＝5.5，6.0，6.5补料分批培养液分三批次流经hitrapsphp阳离子交换层析柱，分三批次纯化上述对应的ph值培养液，按照25％，50％，100％等度洗脱，样品峰主要集中在25％洗脱峰。
图8-a为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为ph＝5.5时，rarta1离子交换纯化色谱图，图8-b为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为ph＝5.5时，rarta1离子交换层析后sds-page分析图；图9-a为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为ph＝6.0时，rarta1离子交换纯化色谱图，图9-b为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为ph＝6.0时，rarta1离子交换层析后sds-page分析图；图10-a为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为ph＝6.5时，rarta1离子交换纯化色谱图，图10-b为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为ph＝6.5时，rarta1离子交换层析后sds-page分析图，结果显示，平衡缓冲液和洗脱缓冲液为ph＝5.5，rarta1纯度和回收率较其他ph都有明显的提高。
实施例6rarta1蛋白活性的分析
将纯化得到的rarta1蛋白用bca蛋白浓度测定试剂盒(catno:23225，购自pierce公司)测定蛋白浓度，分别与与天然arta1(以下简称narta1)比较，和兔多抗和花粉过敏病人血清反应；表1所示rarta1和narta1与兔多抗反应od450吸收值，表2表示rarta1和narta1与24个花粉过敏病人血清反应od450吸收值，结果表明rarta1与narta1相比，无论和兔多抗反应，还是和花粉病人血清反应，od450吸收值基本一致，说明在哺乳动物细胞中表达的rarta1与narta1相比具有非常相近的生物学活性，可用于花粉脱敏治疗。
表1：rarta1与narta1与兔多抗反应od450吸收值
表2：rarta1与narta1与花粉病人血清反应od450吸收值
序列表
<110>江苏众红生物工程创药研究院有限公司常州京森生物医药研究所有限公司
<120>一种重组黄花蒿1类变应原蛋白及其应用
<130>一种重组黄花蒿1类变应原蛋白及其应用
<160>5
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<210>1
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