本发明涉及弓形虫tgme49_223140基因的获取、表达纯化及elisa方法的建立。
背景技术：
：：弓形虫病是由刚地弓形虫(toxoplasmagondii)引起的一种人兽共患寄生虫病，成世界性分布；对免疫功能不全及免疫抑制的人及动物危害严重。弓形虫引起宿主致病的关键性分子目前尚不清楚。弓形虫病威胁着人类的健康，以及畜牧业的发展。技术实现要素：本发明的目的：建立敏感有效的猪弓形虫elisa检测方法。本发明提供的技术方案如下：1核苷酸序列(1)从toxodb(http://toxodb.org/toxo/)数据库获得核酸序列。(2)将该目的片段经pcr、胶回收，连接到peasysimpleblunt载体上，于-80℃保存。tgme49_223140核苷酸序列：atggagctcatctacgactcgacgcctgcggctctcgccaccgtcctcttggctcgctatgttcagccgtgtctcctccagcgacagccgccgctctctctgtccctctgctttctcggcaatgaggcgaaggcgtacctgaaagcccaagaggcggagcttcccgtgctcctggctgccaaagaaggcgcgggagcagagccggcgtttcctccccttcgcgaacctgcgacgattctgaggcgcctggccacggaggcggccgtcacacccgcgtctgggaagagctcgtctgccggagctctcttgctcggtggcgaatctgacgttgaacaggcacaagtatcgcagtggctgtccttctgctgcgagaacaacttcgcgattcgcggtgcttcgctcttccagcatctccacagtcacctggctacgcgcactttcttctgtggagaccgtctcaccatcgcagatttcgccgtcttcgtttcctgctatgcctggatggcctcttcttctcagaaagaacgtgtcctctactgcaatttaacccgatggatggactacattcaacaccttccgggcgtcatgaacgctgtcgagcagcttccgcttttgagccttcttcctccgcctcagcctgttgcagcgccgccgaccgactcagctgctgcttctacgcaggccttggcgaagcagcaggctgcttctggaagcaagcagggaaagaagaaatctggagaactgcacgtgaacggcgactgcaggccaaacggtgatgttcctaagagtcagaagaaagaagagaagggggacaaaggtgcaggtggagatcacaagaaagtcagtggacgagcaaaacagagcacacccggttcgtcgaaaggtggagcgcctggtgcagactcctcgcgccccgtagaggacgtgacacgtctctgcatggttgtgggtcaggtgaagaaagtctggagacaccctgaagcagacaagctgttctgcgaagaagtcgatattggtgagccacaggtgcgcatgatcgcctcaggccttgttccttacatgaaggcggaggagctagaaggtcagaaagtgattgttttggctaacatgaaaccgaagaatctcagaggattcccctctcatgggatgctcgtttgcgccacaagcaaggatcactcgaaatgtgaattgatgcggcctcccccggacacaccgattggggaaaggctcacctttgaaggccttcagggtgaacctgatccggtcatgaacaccaaagaagggaagtacccttttgctgctgttcaaccgcatttctatactgatgacaatcgcgtcggaatgtacaagactcacaggttcatgacaaaacaaggaccagtcttctgtgactctatcgtcggaggcaccatctcttaapcr特异性扩增引物：tgme49_223140-his:上游:ttcatatgcagcgacagccgccgctct(ndeⅰ)下游:aaactcgagttaagagatggtgcctccgacgata(xhoⅰ)tgme49_223140-gst:上游:tttggatccatggagctcatctacgactcg(bamhⅰ)下游:aaaactcgagttaagagatggtgcctccgac(xhoⅰ)2.表达载体的构建：(1)用trizol法提取虫体总rna(2)虫体rna进行反转录table1反转录体系组成体积(50μl)10×buffer510mmdntp5rnase2oligo(dt)1+1totalrna2amv3ddh2o3totalvolume50反应步骤条件：a.先将oligo(dt)和总rna进行热激，使用pcr仪控温，70℃热激10min。b.再加入10×buffer、dntp、rnase、amv、h2o，同样使用pcr仪控温，42℃控温40min。c.-20℃保存。(3)pcr扩增目的片段table2pcr反应体系(5)目的基因的胶回收步骤：a.配置8％的琼脂糖凝胶100ml，倒入插好3孔梳子的塑料槽中，琼脂糖凝胶凝固后再取出使用。b.样品处理：将100ul的pcr产物中加入24μl的5×dnaloadingbuffer，混匀。c.上样：将100μl的pcr扩增产物全部加入到大孔胶槽中，旁边孔加入5μl的2000marker。d.将恒压仪调至100v，电泳30min，取出后用照胶仪观察，对应marker，观察目的条带是否在预期大小处。e.切胶：将目的条带处的琼脂糖凝胶切下，尽量切到最小。f.称量：先称量1.5ml离心管的重量，再将切下的胶放入离心管中，再称量一下胶的重量。g.按照胶回收试剂盒说明书，加入3倍体积的溶胶液，即100mg琼脂糖凝胶加入300μl的溶胶液，置于50℃水浴锅中，水浴10min，每隔3min上下颠倒离心管，使琼脂糖凝胶充分溶解。h.溶解后用移液器吸出，加入到胶回收柱中，静置1min。置于离心机中离心1min，6000×g。i.离心后，再加入500μl的溶胶液，静置1min，静置后离心1min，1200×g。j.离心后，再加入750μl的洗涤液，静置1min，置于离心机中离心1min，1200×g。k.继续离心1次。l.取50μl已预热至60℃的灭菌超纯水，加入到胶回收柱中，静置1min，将胶回收柱放在1.5ml灭菌离心管中，置于离心机中离心1min，1200×g。m.离心后弃掉回收柱，将回收后的50μlpcr产物使用nanodrop测浓度，并做记录。n.置于-20℃中保存备用。(6)目的片段连接表达载体并进行转化使用同工酶将目的片段及表达载体进行双酶切胶回收，使用t4连接酶将目的片段与表达载体进行连接；并转化至表达菌ecoli.bl21和ecoli.bl21(de3)中。(7)目的蛋白质的大量表达及纯化使用原核表达系统进行蛋白质表达，使用终浓度为0.1mmiptg进行诱导表达，利用亲和层析的方法纯化获得重组目的蛋白质。(8)对54份猪阴性血清和54份猪阳性血清进行检测本发明的积极效果：可大量便捷敏感的检测感染弓形虫的猪血清。附图说明图1：223140-pet基因扩增(a)及表达质粒的ndeⅰ/xhoⅰ双酶切鉴定结果(b)。图2：223140-pgex基因扩增(a)及表达质粒的bamhⅰ/xhoⅰ双酶切鉴定结果(b)。图3：重组蛋白质223140-his纯化的sds-page(左)及western-blot分析(右)。图4：重组蛋白质223140-gst纯化的sds-page(左)及western-blot分析(右)。图1、2中的1表示pcr扩增条带，2表示全质粒，3表示双酶切条带，m为d2000dnaladder及d5000dnaladder。图3、4中的1表示sds-page验证蛋白质条带，2表示western-blot验证蛋白质条带，m为180proteinladder。具体实施方式实施例1：猪弓形虫elisa检测方法的建立一、弓形虫me49虫株总rna的提取a.先将虫体沉淀从-80℃中取出，加入1ml已灭菌的pbs进行洗涤，离心10min，2500rpm。b.离心洗涤后倒掉上清的pbs，向沉淀中加入1ml的trizol，用移液器反复吹打，确保虫体能够全部破碎裂解。c.向1mltrizol中加入200μl氯仿，使用振荡器震荡15s，在冰上静置3min。d.静置后，置于4℃离心机中，离心15min，12000×g，吸取上清400μl置于新的灭菌ep管中。e.加入同体积(400μl)的异丙醇，颠倒混匀1min，于冰上静置10min。f.静置后，置于4℃离心机中离心10min，12000g/min，弃掉上清，留沉淀。g.向沉淀中加入1ml75％的酒精，震荡混匀。k.混匀后，置于4℃离心机中，离心5min，7500g/min，弃掉上清，重复步骤f。h.将残留酒精挥发掉，加入20μl的depc水，将沉淀溶解，获得虫体rna。二、重组质粒的双酶切验证双酶切反应体系组成体积(μl)质粒20酶ⅰ5酶ⅱ510×fastdigestgreenbuffer10ddh2o60总体积100双酶切反应条件：a.使用pcr仪控温，37℃酶切15min。b.酶切反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，电压设为100v，电泳30min。c.核酸电泳结束后，将目的条带进行胶回收，使用胶回收试剂盒进行回收，胶回收后使用nanodrop测目的片段以及载体的浓度(双酶切验证结果，如图1、2(b)所示)。三、重组表达质粒转化到表达感受态从-80℃冰箱中取出transt1感受态细胞置于冰上融化，完全融化后，取2μl测序正确的重组质粒加入到50μltranst1感受态细胞液面以下，上下颠倒混匀，冰浴30min，冰浴后放入42℃恒温水浴锅中热激60s，热激后再冰浴2min，冰浴后加入1ml无抗性lb，置于37℃恒温摇床中感作1h，感作完成后将其离心3min，5000r/min，在超净工作台中，弃掉800μl上清，剩下的200μl用移液器将沉淀悬起，用涂布棒涂布于含有相应抗性的固体lb培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养10h(pcr验证结果如图1、2(a)所示)。四、重组蛋白质的大量表达与纯化a.将甘油菌从-20℃冰箱中拿出，于超净工作台中，使用接种环蘸取菌液，划线于含有卡那抗性的固体lb培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养10h。b.挑取培养基上直径约1mm的阳性菌落，于25ml含有卡那抗性的液体lb培养基中，置于37℃恒温摇床中，200r/min，感作12h。c.取5ml的菌液接种到装有500ml含有卡那抗性的液体lb锥形瓶中，置于37℃恒温摇床中感作，200r/min，使其od600达到0.6～0.8之间。d.向锥形瓶中加入500μl的iptg溶液，使其终浓度达到0.1mm。置于22℃低温摇床中，诱导表达18h。e.将菌液分别倒入50ml灭菌离心管中，放入4℃离心机中离心，收集沉淀，4000r/min，离心10min。f.将沉淀用40mlpbs缓冲液悬起，加入1ml40mg/ml溶菌酶及一片蛋白酶抑制剂，使用压力细胞破碎仪将菌体裂解，释放出蛋白质。g.将破碎后的菌液放入4℃离心机中离心，10000r/min，离心15min。h.将菌液上清与处理后的小球结合感作2h，置于4℃中。i.结合感作后，过层析柱，使用洗脱液将蛋白质洗脱下来。j.获得纯化重组蛋白质。k.进行sds-page及western-blot验证(结果如图3、4所示)。五、猪血清的elisa方法检测a.包被：tgme49_223140基因表达纯化的重组蛋白质作为抗原，使用包被液将纯化的重组蛋白质稀释到10μg/ml，加入到96孔酶标板中，100μl/孔，置于37℃恒温箱中，包被1h。b.洗涤：用洗板机进行洗涤，洗涤3次。c.封闭：使用3％的bsa封闭液进行封闭，100μl/孔，置于37℃恒温箱中，封闭1h。d.洗涤：同步骤(3)。e.一抗结合：使用采自猪场的血清作为一抗，按照1：400的比例进行稀释，加入到96孔酶标板中，50μl/孔。f.洗涤：同步骤(3)。g.二抗结合：按照1:500的比例对二抗进行稀释，50μl/孔。h.洗涤：同步骤(3)。i.显色：使用tmb避光显色，200μl/孔，室温显色15min。j.终止：使用2m盐酸终止显色，50μl/孔。k.使用酶标仪测od值，波长为450nm处。l.使用商品化猪弓形虫elisa试剂盒对猪血清进行检测，操作方法按照试剂盒说明书进行操作；以及与mat检测方法进行对比(结果如下表所示)。猪血清elisa检出数(率)序列表<110>沈阳农业大学<120>一种适用于弓形虫的elisa的方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1419<212>dna<213>弓形虫(toxoplasmagondii)<400>1atggagctcatctacgactcgacgcctgcggctctcgccaccgtcctcttggctcgctat60gttcagccgtgtctcctccagcgacagccgccgctctctctgtccctctgctttctcggc120aatgaggcgaaggcgtacctgaaagcccaagaggcggagcttcccgtgctcctggctgcc180aaagaaggcgcgggagcagagccggcgtttcctccccttcgcgaacctgcgacgattctg240aggcgcctggccacggaggcggccgtcacacccgcgtctgggaagagctcgtctgccgga300gctctcttgctcggtggcgaatctgacgttgaacaggcacaagtatcgcagtggctgtcc360ttctgctgcgagaacaacttcgcgattcgcggtgcttcgctcttccagcatctccacagt420cacctggctacgcgcactttcttctgtggagaccgtctcaccatcgcagatttcgccgtc480ttcgtttcctgctatgcctggatggcctcttcttctcagaaagaacgtgtcctctactgc540aatttaacccgatggatggactacattcaacaccttccgggcgtcatgaacgctgtcgag600cagcttccgcttttgagccttcttcctccgcctcagcctgttgcagcgccgccgaccgac660tcagctgctgcttctacgcaggccttggcgaagcagcaggctgcttctggaagcaagcag720ggaaagaagaaatctggagaactgcacgtgaacggcgactgcaggccaaacggtgatgtt780cctaagagtcagaagaaagaagagaagggggacaaaggtgcaggtggagatcacaagaaa840gtcagtggacgagcaaaacagagcacacccggttcgtcgaaaggtggagcgcctggtgca900gactcctcgcgccccgtagaggacgtgacacgtctctgcatggttgtgggtcaggtgaag960aaagtctggagacaccctgaagcagacaagctgttctgcgaagaagtcgatattggtgag1020ccacaggtgcgcatgatcgcctcaggccttgttccttacatgaaggcggaggagctagaa1080ggtcagaaagtgattgttttggctaacatgaaaccgaagaatctcagaggattcccctct1140catgggatgctcgtttgcgccacaagcaaggatcactcgaaatgtgaattgatgcggcct1200cccccggacacaccgattggggaaaggctcacctttgaaggccttcagggtgaacctgat1260ccggtcatgaacaccaaagaagggaagtacccttttgctgctgttcaaccgcatttctat1320actgatgacaatcgcgtcggaatgtacaagactcacaggttcatgacaaaacaaggacca1380gtcttctgtgactctatcgtcggaggcaccatctcttaa1419当前第1页12当前第1页12