本发明属于有益微生物突变筛选技术领域，具体涉及一种黄杆菌突变株及其应用。
背景技术：
岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan)又称岩藻多糖，是一种带有硫酸基团的高分子量杂多糖，存在于海洋褐藻和一些棘皮类动物中，最近几年，岩藻多糖由于其卓越的生物活性，包括抗肿瘤、抗凝血、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、免疫调节、抗血栓、抗补体、抗肝病、降血脂、抗过敏、抗胃溃疡等等，已经成为科研界的“新宠儿”，是当今海洋药物及功能性食品研发领域的主攻热点。
经研究发现该多糖的化学结构十分复杂，主要由l-岩藻糖和硫酸基团组成，还含有少量的半乳糖、甘露糖、糖醛酸、葡萄糖、鼠李糖、木糖、氨基己糖、阿拉伯糖等，其化学结构会随来源物种、收获季节、地理位置及提取方法的不同发生显著变化。同时，该多糖分子量大、粘度高，容易产生抗原性和毒副作用，这些问题都严重限制了它的应用。解决上述问题最有效的办法就是通过精准降解技术，将高分子量的多糖转变成分子量适中、结构相对稳定的组分，从而为该多糖的应用扫清障碍。更有研究表明，岩藻聚糖硫酸酯的生物活性是具有分子量依赖性的，即针对某种活性只在特定的分子量范围内呈现最高活性，从这个角度分析，也需要利用“精准降解技术”对该多糖进行降解。
目前，降解岩藻聚糖硫酸酯的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法是非特异性降解，反应条件苛刻，过程较难控制，而且产物转化率低，功能性低。物理降解法虽然操作简单可控性好，但其降解效率普遍较低，很难得到符合一定分子量范围的产品。酶解法可以在温和条件下特异性地切断岩藻聚糖链，反应过程容易控制，易于得到所需分子量范围内的低聚糖产品，且所得产物含量高，功能性强，利用酶法降解多糖也是在学术界公认的最理想的方法。
虽然酶法在fucoidan降解中表现出巨大优势，然而目前在全球范围内还没有商业化的酶制剂出售，这大大阻碍了岩藻聚糖硫酸酯的应用。造成这种现状的主要原因是现有的产酶微生物产酶活力普遍较低，无法满足大规模生产的需要。因此，现阶段筛选高活力微生物，是解决岩藻聚糖硫酸酯应用问题的重要途径。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种黄杆菌突变株及其应用，该突变株能够有效的在大规模发酵中提高岩藻聚糖硫酸酯酶的产量，从而弥补现有技术的不足。
本发明的黄杆菌突变株，为黄杆菌(flavobacteriaceaesp.)rc2-3mut株，该菌株已于2017年11月03日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14855。
本发明筛选的菌用于生产岩藻聚糖硫酸酯酶；
本发明的黄杆菌科细菌rc2-3mut的活菌用于制备菌液；所制得的菌液可以用于提取胞内酶，从而用于降解岩藻聚糖硫酸酯。
本发明所保护的菌株通过对已有的产岩藻聚糖硫酸酯酶的黄杆菌进行长期发酵筛选获得。在大规模发酵中，该菌株产岩藻聚糖硫酸酯酶的能力明显提高，其产酶能力最高可达310u/ml。
具体实施方式
申请人之前使用保藏编号为cgmccno.6932的黄杆菌(flavobacteriaceaesp.)rc2-3株发酵来制备岩藻聚糖硫酸酯酶，但在进行扩大规模发酵实验时发现，黄杆菌(flavobacteriaceaesp.)rc2-3株的发酵产酶能力明显下降，没有进行规模化生产的潜力。因此，申请人从flavobacteriaceaesp.rc2-3菌株出发进行紫外诱导突变，最终获得了本发明的目的菌株rc2-3mut株，该突变菌株最适生长温度由25℃提高到30-35℃，在大规模发酵中，其产岩藻聚糖硫酸酯酶的能力最高可达到310u/ml。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1.菌株的诱变筛选
将保藏编号为cgmccno.6932的黄杆菌rc2-3接种于液体培养基(fucoidan0.2％，蛋白胨1％，硝酸铵5mg/ml，用过膜海水配制，ph自然)中，在25℃、180rpm条件下培养12h，获得种子培养液，将种子培养液按5％接种量接种于新鲜的液体培养基，于25℃、150rpm条件下培养48h，即制得黄杆菌菌液。
离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，加入无菌生理盐水使细菌数目达106数量级，振荡成为细胞悬液进行紫外诱变。紫外诱变照射时间分别为10-45s，时间梯度间隔5s。以未经紫外线照射处理的细菌悬液涂布选择性平板，避光培养24h，作为对照组计算致死率。
其中选择性培养基平板的组成如下：fucoidan0.2％，蛋白胨0.2％，硝酸铵5mg/ml，琼脂2％，用过膜海水配制；
结果表明，随着紫外照射时间的延长，细菌的致死率逐渐增大，时间为40s时，致死率在90％。当时间达到45s时致死率接近100％，所以本发明选择40s的照射时间进行紫外诱变。
以致死率达90％的照射时间为诱变剂量处理菌悬液并涂布在选择培养基平板上，获得突变菌的纯化菌株；
将上述斜面菌种分别接种至50ml液体培养基(fucoidan0.2％，蛋白胨1％，硝酸铵5mg/ml，用过膜海水配制，ph自然)，于35℃，180rpm摇床培养12h作为种子液，再将种子液按10％接种量接种于发酵培养基(fucoidan0.5％，牛肉膏1％，用过膜海水配制，ph自然)，在5l发酵罐(装料3.5l)内进行发酵，于35℃、150rpm条件下培养72h，用次甲基蓝法测定fucoidan含量。以fucoidan含量的高低来筛选突变株，最终获得了本发明的rc2-3mut株。
其中次甲基蓝法测定fucoidan含量的方法如下：
取蒸馏水9ml，加入待测样品50μl，混匀后加入0.41mmol/l的次甲基蓝溶液1ml，混匀，在559nm测定吸光度。以fucoidan标准品(sigma)做标准曲线进行计算。
实施例2：rc2-3mut株的发酵产酶活性检测
将rc2-3mut株接种于液体培养基(fucoidan0.2％，蛋白胨1％，硝酸铵5mg/ml，用过膜海水配制，ph自然)，于35℃，180rpm摇床培养12h作为种子液，再将种子液按10％接种量接种于发酵培养基(fucoidan0.5％，牛肉膏1％，用过膜海水配制，ph自然)，在5l发酵罐(装料3.5l)内进行发酵，于35℃、150rpm条件下培养72h。每24h在无菌条件下取样1ml，在80℃灭酶15min，于10000rpm离心10min取上清液。以高效凝胶排阻色谱(色谱条件如下：aglient1100高效液相色谱仪；tsk-gelg3000pw×1(30cm×7.5mm)色谱柱；40℃柱温；0.2mnacl为流动相；0.5ml/min流速；示差检测器)检测多糖分子量的变化。结果表明培养0h、24h、48h、72h后，保留时间为13.6min的fucoidan含量分别为100％、63％、20％、15％。
酶活力检测方法为：取胞内酶与0.2％的fucoidan(ph8.0、20mm的tris-hcl溶解)等体积混合，于25℃、120rpm摇床振荡培养2h，以somogyi-nelson法测定还原糖含量。1个酶活力单位定义为25℃、ph8.0条件下，每小时产生的1纳摩尔还原糖需要的酶量。经测定，菌株rc2-3mut培养72h后的菌液产胞内酶活力达到310u/ml。证明本发明筛选的菌株在大规模发酵中，具有更好的产酶性能。
上述的实验结果表明，本发明筛选得到的产酶菌具有更好的发酵产酶能力，能有效降解高分子量的岩藻聚糖硫酸酯。