本发明涉及用于鉴定桃花单瓣/重瓣性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用，属于生物技术领域。
背景技术：
选择是育种中最重要的环节之一，它是指在一个群体中选择符合要求的基因型，来进行后续的培育。但在传统育种中，由于很难获知后代的基因型，因此选择的依据通常是表现型而非基因型，这种选择方法对质量性状而言一般是有效的，但对数量性状来说，因为其表现型与基因型之间缺乏明确的对应关系，因而效率不高。此外，对于以果实性状为目标的果树来说，这些性状都有其特定的表现时期，通常需要度过3-5年甚至更长时间的童期，因而选择的时间较晚。这对于那些植株高大、占地多、生长季长的作物，特别是果树之类的园艺作物，显然是非常不利的。
近20年来迅速发展起来的基于dna的分子标记技术，即“分子标记辅助选择”(marker-assistedselection，缩写为mas)给育种提供了崭新的途径。它通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种，从而达到提高育种效率的目的。yamamoto(2001)利用aflp(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，扩增片段长度多态性)、rapd(randomamplifiedpolymorphicdna，随机扩增多态性dna)、ssr(simplesequencerepeats，简单重复序列)和rflp(restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)标记，将果皮颜色定位第6连锁群，与之连锁距离最近(3.7cm)的ssr标记为udp96-015。由于进行分子标记辅助选择有两个重要的前提，首先是必须得到与目标性状紧密连锁的标记，即建立目标基因与分子标记的连锁关系。其次是检测的自动化，由于分子标记辅助选择要求对育种群体进行大规模检测，因而要求检测的方法要简单、快速、成本低、比较准确，以实现检测过程(包括dna的提取、分子标记的检测、数据分析等)的自动化。但是，可以发现在过去很长一段时间内采用的分子标记，如rflp(restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)、rapd(randomamplifiedpolymorphicdna，随机扩增多态性dna)、aflp和ssr等通常需要酶切或pcr后用电泳检测分型结果，很难实现这一点。
snps标记(singlenucleotidepolymorphisms，单核苷酸多态性)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。它在基因组上分布广泛，数量众多，因此很容易检测到相对于rflp、rapd、aflp、ssr标记更连锁的标记，且在检测时具有高通量、简单、快速、高灵敏度的优点，是进行分子标记辅助育种中最具潜力的标记。rajapakse(1995)最早利用rflp标记定位了花型(单瓣/重瓣)性状，但由于没有锚定标记，无法进行染色体定位，且连锁距离较远。sosinski(1999)利用开发的ssr标记，对newjerseypillar×kv77119群体进行花型(单瓣/重瓣)性状的定位，获得紧密连锁标记pchgms1，对应第2染色体的21.3mb处。在随后的时间中，对花型(单瓣/重瓣)性状的定位鲜有报道。
由于之前的花型(单瓣/重瓣)标记为ssr标记，该标记在基因组数量少，因此存在与目标性状基因定位距离较远的问题，在杂交后代的早期鉴定中准确率较低。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供用于鉴定桃花单瓣/重瓣性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用，该标记位点在鉴定桃花型(单瓣/重瓣)性状时具有较高的准确率。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
用于鉴定桃花单瓣/重瓣性状的单核苷酸多态性标记位点，所述的单核苷酸多态性标记位点是桃基因组第2染色体的第25,058,942位核苷酸，该核苷酸为g或t。
用于鉴定桃花单瓣/重瓣性状的pcr扩增引物对，所述引物对中的上游引物是根据桃基因组第2染色体的第25,058,942位核苷酸及其上游序列进行设计，所述引物对中的下游引物是根据桃基因组第2染色体的第25,058,942位核苷酸的下游序列进行设计。
所述的上游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示。
用于鉴定桃花单瓣/重瓣性状的单碱基延伸引物，为如seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列。
用于鉴定桃花单瓣/重瓣性状的试剂盒，包括pcr扩增引物对和单碱基延伸引物。
一种单核苷酸多态性标记位点在鉴定或辅助鉴定桃花单瓣/重瓣性状中的应用。
一种单核苷酸多态性标记位点在桃花单瓣/重瓣性状分子标记辅助选择育种方面的应用。
一种试剂盒在辅助选择育种方面的应用。
一种利用单核苷酸多态性标记位点鉴定桃花单瓣/重瓣性状的方法，包括以下步骤：
(1)pcr扩增：以待测桃的基因组dna为模板，用pcr扩增引物对进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
(2)sap反应：配制sap反应体系，加入至步骤(1)pcr扩增反应后的反应体系中，除去pcr扩增反应中未反应的dntp；
(3)单碱基延伸反应：配制单碱基延伸反应体系，加入至步骤(2)sap反应后的反应体系中；
(4)基因分型：将完成单碱基延伸反应的产物进行树脂脱盐处理，点在芯片上，由芯片扫描仪扫描，检测分析，根据不同产物的分子量大小进行基因分型，预测桃花单瓣/重瓣性状。
本发明通过对大量桃种质样品的测序比对，鉴定出4063377个snps，利用这些snps对129份种质的花型(单瓣/重瓣)性状进行全基因组关联分析，鉴定出与桃花型有显著关联的snp位于第2染色体的第25,058,942bp处。
本发明针对桃基因组第2版的第2染色体的第25,058,942位核苷酸多态性的特性，设计了特定的pcr引物扩增对和单碱基延伸引物，将完成单碱基延伸反应的的产物进行树脂脱盐处理，点在芯片上，由芯片扫描仪扫描，进行maldi-tof质谱检测，typer4.0软件分析实验数据，根据不同产物的分子量大小获得其基因分型结果。
本发明对337份待测自然群体材料进行snp准确率的验证，结果表明，本发明对显性表型(单瓣)中具有较高的准确率，可达99.69％左右；对隐性表型(重瓣)中准确率也可以达到75％左右。这说明，本发明的单核苷酸标记位点能够用于鉴定或辅助鉴定桃花型(单瓣/重瓣)性状，在鉴定桃花型(单瓣/重瓣)性状时具有较高的准确率。
本发明的检测方法具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用，具有良好的社会和经济效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1snps标记位点的获得
本发明以从中国农业科学院郑州果树研究所桃种质资源圃随机获得的129份桃种质为样品，采用常规ctab法提取样品dna，并通过illuminahiseq2000测序仪对129份桃种质进行重测序，得到121gb数据，平均覆盖桃基因组89.28％，平均测序深度为4.21×左右。根据测序得到的50-150bp的reads，与桃参考基因组第2版(http://www.rosaceae.org/node/355)进行比对，鉴定出4063377个snps，利用这些snps对129份种质的花型(单瓣/重瓣)性状进行全基因组关联分析，鉴定出与桃花型(单瓣/重瓣)有显著关联的snp位于第2染色体的第25,058,942bp处。
实施例2利用snp标记鉴定桃花型(单瓣/重瓣)性状的方法
1、dna提取
采用常规ctab法提取待测桃样品组织的dna，去除rna，dna样品总体积不低于15μl。用紫外光光度计测定dna样品在260nm、280nm处的od值，计算dna含量和od260/280的比值。dna样品纯度od260/280值应在1.8-2.0之间，浓度稀释至10ng/μl。
2、设计引物
根据桃基因组第2版的第2染色体的第25,058,942位处左右各150bp序列(具体的核苷酸序列见表1)，设计引物。
表1snp旁侧序列信息
其中，k表示g或t。
引物由生物技术公司合成后，稀释pcr扩增上下游引物至浓度均为0.5μm。稀释单碱基延伸引物至延伸引物1、2、3浓度分别为8μm、10μm、15μm，备用。引物序列见表2。
表2引物序列
3、pcr反应体系及massarray分析
按照sequenom-iplex标准操作流程进行pcr、sap、单碱基延伸反应，主要步骤如下：
(1)pcr扩增反应
首先，配制pcr扩增体系，具体见表3。
表3sequenommassarray系统基因分型扩增pcr反应体系
其中，primermix为浓度0.5μm的上游引物和下游引物各加入0.5μl。
将上述试剂转移到pcr管或板中，
pcr扩增程序如下：94℃15min；94℃20s，56℃30s，72℃1min，共45个循环；72℃3min；4℃保存。
配置1％琼脂糖凝胶，对pcr反应后的产物进行电泳，如果条带明亮且单一，则进行后续试验。
(2)sap反应
利用该反应除去未用尽的dntp，首先配制反应体系，见表4：
表4sap酶促反应体系
将配好的上述溶液2μl加入到完成pcr反应的pcr管或板中。按如下程序进行sap反应。
sap反应程序：37℃40min；85℃5min；4℃保存。
(3)单碱基延伸反应
首先配制单碱基延伸反应体系，见表5：
表5单碱基延伸反应体系
其中，iplexextendprimermix为单碱基延伸引物1、2、3的混合引物，引物1、2、3的浓度分别为8μm、10μm、15μm，单碱基延伸引物1、2、3的加入量相同，共0.94μl。
然后将配好的溶液2μl加入到sap反应后的pcr管或板中，进行延伸反应，程序如下：94℃30s；94℃5s，(52℃5s，80℃5s，5个循环)，共40个循环；72℃3min；4℃保存。
将完成延伸反应的的产物进行树脂脱盐处理，点在芯片上，由芯片扫描仪扫描，进行maldi-tof质谱检测，typer4.0软件分析实验数据，根据不同产物的分子量大小获得其基因分型结果。当完成延伸反应的产物分子量为8288.5左右时，chr2：25,058,942bp处为纯合位点，分型为g/g，对应种质的花瓣表型为重瓣。分子量为8328.3左右时，chr2：25,058,942bp处为纯合位点，分型为t/t；分子量为8308.4左右时，chr2：25,058,942bp处为杂合位点，分型为g/t；t/t和g/t这两种分型对应的种质花瓣表型均为单瓣。
实施例3337份桃自然群体利用花型(单瓣/重瓣)关联snp标记进行表型性状的盲测验证1、实验材料的选择
以郑州果树研究所资源圃中保存的337份普通桃种质自然群体为实验材料，其中重瓣16份，单瓣321份。
2、利用桃花型关联snp标记的鉴定方法
以本发明桃基因组第2染色体的第25,058,942位作为核苷酸多态性标记位点，对337份种质进行盲测鉴定，具体的鉴定方法参照实施例2的方法。
3、自然群体中分型结果对表型的预测能力(表6)
从鉴定结果可以看出，在321个单瓣中，只有1个分型为g/g，与预期结果不符，其他均为g/t或者t/t分型，与预期结果一致，因此单瓣的表型准确率为99.69％；在16个重瓣花种质中，有12个分型为g/g，与预期结果一致，但有4个分型为t/t，与预期结果不一致，因此单瓣的表型准确率为75％。
表6花型(单瓣/重瓣)关联或连锁snp在337份自然群体种质上分型结果
综上所述，本发明的snp位点能够帮助实现利用桃幼苗dna早期预测桃成龄后花型的单瓣或者重瓣性状的目的，该方法是利用重测序得到的400万以上snps，并结合全基因组关联分析得到最关联的位点从而实现的，由于原始snps数量庞大，从而保证了得到的关联标记关联性高，有效提高了利用snps预测的准确性。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国农业科学院郑州果树研究所
<120>用于鉴定桃花单瓣/重瓣性状的单核苷酸多态性标记位点、引物对、试剂盒及应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>301
<212>dna
<213>桃(amygdaluspersical.)
<220>
<223>k=g或t
<400>1
gaatatgctcgtaaagagtgccattgttgatgaactcgcaaactaaggtttctcctccca60
gatctgcacaataacctaagagcctcacaatatgtctgtgtttaatctgagaaagaatag120
tcacttcgttaacaaagattttagagacaaktctactaggtacgtctaacttgaacttct180
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taccaatgattctaccgtcatagaaataatctgtcgcccaagaaatttctcgtgcagaaa300
a301
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列()
<400>2
acgttggatggcgtggtgtccataaagaag30
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<211>30
<212>dna
<213>人工序列()
<400>3
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<211>26
<212>dna
<213>人工序列()
<400>4
ttcgttaacaaagattttagagacaa26
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<211>27
<212>dna
<213>人工序列()
<400>5
ttcgttaacaaagattttagagacaag27
<210>6
<211>27
<212>dna
<213>人工序列()
<400>6
ttcgttaacaaagattttagagacaat27