一种人血清中分离免疫球蛋白IgG的方法与流程

本发明属于生物活性物质的分离纯化领域，具体涉及一种人血清中分离免疫球蛋白igg的方法。

背景技术：

免疫球蛋白是宿主对抗原刺激的免疫应答，由b淋巴细胞分化的浆细胞产生的一种特殊的糖蛋白。根据结构和生物学性质，可以将哺乳动物的免疫球蛋白分为iga、igd、ige、igg和igm，其中含量最丰富的是igg，广泛用于疾病诊断和治疗。

血液是免疫球蛋白的重要来源。20世纪40年代，cohn开发了低温乙醇法分离工艺，实现了血浆蛋白的规模化分离，该方法经多次改进，已经成为了血液制品行业中使用最广泛的血浆蛋白分离方法。该方法根据不同血浆蛋白理化性质的差异，加入不同浓度的乙醇、盐、有机溶剂和酸碱等，实现分级沉淀，从而提取出不同的蛋白(jama,122(16):1150,1943)。

中国专利cn1563091a公开了一种低温有机溶剂提取免疫球蛋白的方法，纯度为65％，但是该法存在一些局限性，收率和纯度都不高，且蛋白活性也会受到影响。中国专利cn102321172a采用铁盐沉淀血清中的杂蛋白，得到纯度为65.1％的免疫球蛋白产品；中国专利cn1824679a公开了一种多级盐析法从猪血中提取免疫球蛋白igg的方法；中国专利cn102702347a结合硫酸铵盐析和等电点沉淀，从猪血中提取igg，纯度和收率分别为75％和88％。相比于有机溶剂沉淀法，盐析法较简单方便，但是免疫球蛋白的纯度还是不高，还需进行脱盐处理。

离子交换层析是一种提高免疫球蛋白igg纯度的重要方法。美国专利us3,664,994公开了利用deae葡聚糖介质从马血清中分离igg的过程；美国专利us4,911,910利用qae介质从马血中分离igg，收率超过85％，但是对料液的ph和盐浓度有较高的要求。蛋白a亲和层析可以得到高纯度igg，但介质价格昂贵，分离成本高，因此开发经济高效的igg分离新方法十分有必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种人血清中分离免疫球蛋白igg的方法，能够提高血液中分离免疫球蛋白igg的效率和纯度。

本发明解决上述技术问题所提供的技术方案为：

一种人血清中分离免疫球蛋白igg的方法，包括如下步骤：

1)人血清采用缓冲液稀释，调节ph至6.0-8.0，滤膜过滤得到人血清样品；

2)将人血清样品上样到填充有组合型仿生层析介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，得到免疫球蛋白igg溶液；

所述组合型仿生层析介质包括层析基质和组合型配基，所述层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球；所述组合型配基的序列为苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5-氨基苯并咪唑；

3)将免疫球蛋白igg溶液超滤浓缩，即得免疫球蛋白igg。

本发明采用组合型仿生层析介质进行分离，仅通过一步层析直接从人血清中分离出免疫球蛋白igg。

本发明中的组合型仿生层析介质的结构式如下：

组合型仿生层析介质的结构式中仅给出一个组合型配基基团，仅仅是示例性说明，层析基质的表面和内部孔道表面具有大量的组合型配基基团。

本发明中层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球，结构式如下：

结构式仅给出一个-oh，仅仅是示例性说明，其表面具有大量的-oh。

本发明中组合型配基的结构式如下：

本发明通过将组合型配基偶联到层析基质上得到组合型仿生层析介质，其中组合型配基同时具有苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺三肽和氨基苯并咪唑两种功能基团，结合了多肽仿生层析和疏水性电荷诱导层析两者的优势。一方面利用三肽与目标免疫球蛋白间的亲和作用，保证免疫球蛋白结合的高度特异性，另一方面利用疏水性电荷诱导配基的电荷诱导效应，通过调节溶液ph，在较为温和的酸性条件下通过静电排斥作用洗脱免疫球蛋白，从而获得高纯度和高收率的免疫球蛋白igg。

作为优选，所述步骤1)中缓冲液为磷酸缓盐冲液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为20-50mm；所述人血清与缓冲液的体积比为1:2-15。

作为优选，所述步骤1)中滤膜的膜孔径为0.15-0.45μm。

作为优选，所述步骤2)中层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。

作为优选，所述步骤2)中平衡缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，ph值为6.0-8.0。

作为优选，所述步骤2)中洗脱缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，ph值为3.5-5.0。

作为优选，所述步骤2)中洗脱缓冲液的浓度为20-50mm。

作为优选，所述步骤3)中超滤浓缩后的免疫球蛋白igg储存于保存缓冲液中。

作为优选，所述保存缓冲液为20-50mm的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加质量浓度3.0-4.0％山梨醇，ph值为4.0-6.0。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明采用组合型仿生层析介质进行分离，分离选择性高，单步纯化得到的免疫球蛋白igg纯度大于90％。

(2)本发明洗脱条件温和，避免过酸条件对蛋白活性的影响，可以很好保持igg的生物活性。

(3)本发明采用的组合型仿生层析介质清洗方便，可以用1m的naoh溶液进行清洗，易于工业化应用。

(4)本发明采用的组合型仿生层析介质性能稳定，可重复使用100次以上，使用成本较低。

附图说明

图1为实施例1中组合型配基的高效液相色谱图；

图2为实施例1中组合型配基的质谱图；

图3为实施例8中人血清分离后的各组分sec-hplc分析图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：组合型配基的制备

借助计算机分子模拟的手段，对蛋白a和抗体fc结合位点的关键残基进行分析评估，筛选和设计三肽-杂环小分子的组合型配基，其序列为苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5-氨基苯并咪唑。

组合型配基，结构式如下：

组合型配基可以采用现有技术中的化学合成方法合成，本实施例中的组合型配基委托中肽生化有限公司制备。

针对实施例1中的组合型配基进行高效液相色谱和质谱表征，分别如图1和2所示。

实施例2：组合型仿生层析介质的制备

取抽干琼脂糖凝胶3.0g，加入3.0g20％(v/v)二甲基亚砜、1.5g烯丙基溴和0.6g氢氧化钠，30℃下150rpm摇床活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质。

将活化的层析基质、6.0g50％(v/v)丙酮和0.9gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下150rpm摇床反应3h，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质。

1.5g二甲基亚砜和3.0g1m碳酸钠缓冲液混合，加入0.3g苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5-氨基苯并咪唑配基，充分溶解，再加入溴代醇化的层析基质，30℃下150rpm摇床反应12小时，用去离子水、0.1mhcl、0.1mnaoh反复抽滤冲洗，得到配基偶联的介质。

最后将介质加入到9.0g1.0m乙醇胺水溶液(ph8.0)中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到组合型仿生层析介质。

采用高效液相色谱分析反应后母液中的剩余配基含量0.228g，说明有0.072g配基偶联到介质上。

通过物料平衡计算得到介质配基密度为42μmol/g介质，人免疫球蛋白的饱和吸附容量为85mg/ml介质。

实施例3：组合型仿生层析介质的制备

取抽干琼脂糖凝胶3.0g，加入1.5g20％(v/v)二甲基亚砜、0.3g烯丙基溴和0.3g氢氧化钠，30℃下150rpm摇床活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质。

将活化的层析基质、3.0g50％(v/v)丙酮和0.3gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下150rpm摇床反应1h，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质。

1.5g二甲基亚砜和3.0g1m碳酸钠缓冲液混合，加入0.3g苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5-氨基苯并咪唑配基，充分溶解，再加入溴代醇化的层析基质，30℃下150rpm摇床反应8小时，用去离子水、0.1mhcl、0.1mnaoh反复抽滤冲洗，得到配基偶联的介质。

最后将介质加入到3.0g1.0m乙醇胺水溶液(ph8.0)中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到组合型仿生层析介质。

采用高效液相色谱分析反应后母液中的剩余配基含量0.259g，说明有0.041g配基偶联到介质上。

通过物料平衡计算得到介质配基密度为24μmol/g介质，人免疫球蛋白的饱和吸附容量为65mg/ml介质。

实施例4：组合型仿生层析介质的制备

取抽干琼脂糖凝胶3.0g，加入4.5g20％(v/v)二甲基亚砜、3.0g烯丙基溴和1.5g氢氧化钠，30℃下150rpm摇床活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质。

将活化的层析基质、9.0g50％(v/v)丙酮和0.9gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下150rpm摇床反应3h，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质。

3.0g二甲基亚砜和6.0g1m碳酸钠缓冲液混合，加入0.9g苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5-氨基苯并咪唑配基，充分溶解，再加入溴代醇化的层析基质，30℃下150rpm摇床反应12小时，用去离子水、0.1mhcl、0.1mnaoh反复抽滤冲洗，得到配基偶联的介质。

最后将介质加入到15.0g1.0m乙醇胺水溶液(ph8.0)中，25℃下150rpm摇床中反应8小时，去离子水洗涤，得到得到组合型仿生层析介质。

采用高效液相色谱分析反应后母液中的剩余配基含量0.775g，说明有0.125g配基偶联到介质上。

通过物料平衡计算得到介质配基密度为73μmol/g介质，人免疫球蛋白的饱和吸附容量为92mg/ml介质。

实施例5：组合型仿生层析介质的制备

取抽干琼脂糖凝胶3.0g，加入3.0g20％(v/v)二甲基亚砜、1.5g烯丙基溴和0.9g氢氧化钠，30℃下150rpm摇床活化36小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质。

将活化的层析基质、6.0g50％(v/v)丙酮和0.6gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下150rpm摇床反应2h，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质。

2.0g二甲基亚砜和6.0g1m碳酸钠缓冲液混合，加入0.9g苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5-氨基苯并咪唑配基，充分溶解，再加入溴代醇化的层析基质，30℃下150rpm摇床反应10小时，用去离子水、0.1mhcl、0.1mnaoh反复抽滤冲洗，得到配基偶联的介质。

最后将介质加入到9.0g1.0m乙醇胺水溶液(ph8.0)中，25℃下150rpm摇床中反应6小时，去离子水洗涤，得到组合型仿生层析介质。

采用高效液相色谱分析反应后母液中的剩余配基含量0.816g，说明有0.084g配基偶联到介质上。

通过物料平衡计算得到介质配基密度为49μmol/g介质，人免疫球蛋白的饱和吸附容量为88mg/ml介质。

实施例6：组合型仿生层析介质的制备

取抽干琼脂糖凝胶3.0g，加入1.5g20％(v/v)二甲基亚砜、0.3g烯丙基溴和1.5g氢氧化钠，30℃下150rpm摇床活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质。

将活化的层析基质、9.0g50％(v/v)丙酮和0.9gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下150rpm摇床反应1h，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质。

1.5g二甲基亚砜和9.0g1m碳酸钠缓冲液混合，加入0.3g苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5-氨基苯并咪唑配基，充分溶解，再加入溴代醇化的层析基质，30℃下150rpm摇床反应12小时，用去离子水、0.1mhcl、0.1mnaoh反复抽滤冲洗，得到配基偶联的介质。

最后将介质加入到9.0g1.0m乙醇胺水溶液(ph8.0)中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到组合型仿生层析介质。

采用高效液相色谱分析反应后母液中的剩余配基含量0.254g，说明有0.046g配基偶联到介质上。

通过物料平衡计算得到介质配基密度为27μmol/g介质，人免疫球蛋白的饱和吸附容量为70mg/ml介质。

实施例7：组合型仿生层析介质的制备

取纤维素微球3.0g，加入3.0g20％(v/v)二甲基亚砜、1.5g烯丙基溴和0.6g氢氧化钠，30℃下150rpm摇床活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质。

将活化的层析基质、6.0g50％(v/v)丙酮和0.9gn-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下150rpm摇床反应3h，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质。

1.5g二甲基亚砜和3.0g1m碳酸钠缓冲液混合，加入0.3g苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5-氨基苯并咪唑配基，充分溶解，再加入溴代醇化的层析基质，30℃下150rpm摇床反应12小时，用去离子水、0.1mhcl、0.1mnaoh反复抽滤冲洗，得到配基偶联的介质。

最后将介质加入到9.0g1.0m乙醇胺水溶液(ph8.0)中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到组合型仿生层析介质。

采用高效液相色谱分析反应后母液中的剩余配基含量0.232g，说明有0.068g配基偶联到介质上。

通过物料平衡计算得到介质配基密度为40μmol/g介质，人免疫球蛋白的饱和吸附容量为80mg/ml介质。

实施例8：免疫球蛋白igg分离

取1ml新鲜人血清，按照体积比1：15的比例加入15ml20mm磷酸缓盐冲液(ph7.0)，混合均匀，调节ph至7.0，得到稀释血清，用0.22μm滤膜过滤，得到人血清样品。

取5ml作为进样样品，层析柱(内径0.5cm)中填充1mlfyq-abi仿生层析介质，平衡缓冲液为ph7.0的20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱液为ph5.0的20mm醋酸-醋酸钠缓冲液，收集洗脱组分，得到免疫球蛋白igg溶液。

用超滤膜浓缩，并以ph5.0的20mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液添加质量浓度4％山梨醇作为保存缓冲液进行保存，免疫球蛋白igg纯度为95.6％(质量浓度)。

如图3所示，分别对上述试验中的人血清、穿透液和洗脱液进行sec-hplc分析比较，可知本发明中的分离方法可以得到高纯度的免疫球蛋白igg。

实施例9：免疫球蛋白igg分离

取1ml新鲜人血清，按照体积比1：15的比例加入15ml50mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)，混合均匀，调节ph至7.0，得到稀释血清，用0.22μm滤膜过滤，得到人血清样品。

取5ml作为进样样品，层析柱(内径0.5cm)中填充1mlfyq-abi仿生层析介质，平衡缓冲液为ph7.0的50mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱液为ph5.0的50mm醋酸-醋酸钠缓冲液，收集洗脱组分，得到免疫球蛋白igg溶液。

用超滤膜浓缩，并以ph5.0的50mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液添加质量浓度4％山梨醇作为保存缓冲液进行保存，免疫球蛋白igg纯度为94.8％(质量浓度)。

实施例10：免疫球蛋白igg分离

取1ml新鲜人血清，按照体积比1：5的比例加入15ml20mm磷酸盐缓冲液(ph8.0)，混合均匀，调节ph至8.0，得到稀释血清，用0.22μm滤膜过滤，得到人血清样品。

取2ml作为进样样品，层析柱(内径0.5cm)中填充1mlfyq-abi仿生层析介质，平衡缓冲液为ph8.0的20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱液为ph5.0的20mm醋酸-醋酸钠缓冲液，收集洗脱组分，得到免疫球蛋白igg溶液。

用超滤膜浓缩，并以ph6.0的20mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液添加质量浓度4％山梨醇作为保存缓冲液进行保存，免疫球蛋白igg纯度为92.5％(质量浓度)。

实施例11：免疫球蛋白igg分离

取1ml新鲜人血清，按照体积比1：5的比例加入15ml20mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)，混合均匀，调节ph至7.0，得到稀释血清，用0.22μm滤膜过滤，得到人血清样品。

取2ml作为进样样品，层析柱(内径0.5cm)中填充1mlfyq-abi仿生层析介质，平衡缓冲液为ph7.0的20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱液为ph4.5的20mm醋酸-醋酸钠缓冲液，收集洗脱组分，得到免疫球蛋白igg溶液。

用超滤膜浓缩，并以ph5.0的20mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液添加质量浓度4％山梨醇作为保存缓冲液进行保存，免疫球蛋白igg纯度为93.5％(质量浓度)。

实施例12：免疫球蛋白igg分离

取1ml新鲜人血清，按照体积比1：2的比例加入15ml20mm磷酸盐缓冲液(ph6.0)，混合均匀，调节ph至6.0，得到稀释血清，用0.22μm滤膜过滤，得到人血清样品。

取1ml作为进样样品，层析柱(内径0.5cm)中填充1mlfyq-abi仿生层析介质，平衡缓冲液为ph6.0的20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱液为ph4.0的20mm醋酸-醋酸钠缓冲液，收集洗脱组分，得到免疫球蛋白igg溶液。

用超滤膜浓缩，并以ph4.0的20mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液添加质量浓度4％山梨醇作为保存缓冲液进行保存，免疫球蛋白igg纯度为91.6％(质量浓度)。

实施例13：免疫球蛋白igg分离

取1ml新鲜人血清，按照体积比1：2的比例加入15ml20mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)，混合均匀，调节ph至6.0，得到稀释血清，用0.22μm滤膜过滤，得到人血清样品。

取1ml作为进样样品，层析柱(内径0.5cm)中填充1mlfyq-abi仿生层析介质，平衡缓冲液为ph6.0的20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱液为ph3.5的20mm醋酸-醋酸钠缓冲液，收集洗脱组分，得到免疫球蛋白igg溶液。

用超滤膜浓缩，并以ph5.0的20mm柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液添加质量浓度4％山梨醇作为保存缓冲液进行保存，免疫球蛋白igg的纯度为90.8％(质量浓度)。