一种扩增特异性CAR-T细胞的培养方法与流程

本发明涉及生物医学领域中，一种扩增特异性car-t细胞的培养方法。

背景技术：

嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)是基于t细胞受体的人工修饰融合蛋白，其由细胞外抗原识别结构域和细胞内信号传导结构域组成。嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)是将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与cd3-ζ链或fcεriγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的t细胞，使其表达嵌合抗原受体(car)。嵌合抗原受体(car)由t细胞受体的胞外抗原结合区(scfv)、铰链区、中间的跨膜区及胞内信号区4个部分组成。目前，已有多种肿瘤抗原可用于胞外区识别，包括cd19、cd20、表皮生长因子受体(egfr)和人类表皮生长因子受体2(her-2)等。铰链区有cd8hinge、cd28hinge和较长的igg1fc或igg4fc等。中间的跨膜区有cd4、cd8和cd28等，将car结构锚定于t细胞膜上。细胞内结构域通常包含cd3ζ，cd28，4-1bb或ox40，用于增加t细胞活化。遗传修饰以表达car的t细胞可以直接识别car靶向的抗原，然后触发表达car特异性抗原的肿瘤细胞的t细胞活化，增殖，细胞因子分泌和细胞毒性。目前，car修饰的t细胞在治疗血液癌症，包括淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病(all)方面取得了显著的成功。据报道，cd19靶向car-t细胞在所有患者中具有70％至90％的完全缓解率。可见，car-t细胞在肿瘤免疫治疗中的应用前景广阔，市场价值巨大。

car-t细胞治疗中，主要通过抗原-抗体识别模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别，然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并发挥细胞杀伤功能。因此，这种car特异性杀死肿瘤细胞机制，需要在car-t制备过程中，用car基因转导患者t细胞后，所获得的car-t特异性细胞越多越好，即在总t细胞中，转导了car基因的car-t细胞的比例(阳性率)越高越好，以达到更好的肿瘤细胞识别作用，激活靶细胞杀伤机制。

目前，car-t细胞制备过程中，将car基因转导入t细胞的方法主要有：电穿孔法、化学介导法(如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法)、病毒介导法等。其中电穿孔法是利用高脉冲电压破坏细胞膜电位，使核酸通过膜上形成的小孔导入细胞。该方法适用性广，可转导dna或rna，然而缺点是所需核酸及细胞用量大，且细胞致死率极高，不是理想的car基因导入t细胞方法。化学介导法中，磷酸钙法是利用磷酸钙dna复合物吸附细胞膜被细胞内吞，其操作简便但重复性差，并且不太适用于病人t细胞这种原代细胞的转染；脂质体法是利用带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，脂质体上剩余的电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合或通过细胞内吞作用使核酸进入细胞，该方法使用简单，但有一定细胞毒性，并可在体内诱发强烈的抗炎反应，因此在很大程度上也限制了其应用。病毒介导的转染技术，可将外源基因整合到细胞基因组中，转染效率高，外源基因整合较稳定，是目前最常用的car-t细胞转导方式。car细胞制备中，通常用逆转录病毒或慢病毒，其中慢病毒感染法，既可以感染分裂期细胞又可以感染非分裂期细胞，在car-t临床试验制备中最为常用。上述car-t转染方法，目的均是将car基因转入t细胞，以期望获得高比例或高阳性率的car-t细胞，然而实际操作中，仍存在许多挑战和障碍，难以获得较高阳性率及特异性的car-t细胞。一方面，电穿孔法与化学介导法因细胞用量大或致死率高、有一定毒性等，不适于临床car-t细胞的制备；另一方面，逆转录病毒或慢病毒包装步骤繁琐，耗时长，工作量大，往往需要经验丰富的专业技术人员才能有效完成，并且重组病毒很难得到较高的滴度，这成为了car-t细胞制备中关键的制约因素；其次，因不同批次病毒包装时，转染所用工具细胞状态差异，不同技术人员操作差异等，包装的慢病毒滴度通常很不稳定、导致批次间差异较大，这些均成为了car-t细胞制备和应用研究的主要限速环节。

因此，如能找到一种高效简便的方法，能有效提高car-t细胞的特异性及阳性率，则可以大大提高临床car-t细胞制备的效率，为car-t细胞的治疗效果提高保障。

技术实现要素：

本发明的所要解决的技术问题是如何提高car-t细胞的特异性及阳性率。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了扩增免疫细胞的方法，所述方法包括：

1)向免疫细胞的培养体系中添加所述免疫细胞所识别的抗原，得到共培养体系；

2)培养所述共培养体系，实现所述免疫细胞的扩增。

上述方法中，所述免疫细胞可为表达嵌合抗原受体的免疫细胞。

所述免疫细胞具体可为表达嵌合抗原受体的t细胞。

上述方法中，所述抗原可为肿瘤抗原。

进一步，所述抗原可为b细胞成熟抗原(bcma)。

所述免疫细胞可为抗bcma的car-t细胞。

上述方法中，所述共培养体系中所述免疫细胞与所述抗原的配比可为10⁶个：1～100ng。进一步，所述共培养体系中所述免疫细胞与所述抗原的配比可为10⁶个：5～50ng。

上述方法中，向免疫细胞的培养体系中添加所述免疫细胞所识别的抗原的次数和/或时间可根据具体情况调整，只要能实现提高所述免疫细胞的阳性率和/或特异性，均属于本发明的保护范围。

所述扩增免疫细胞的方法在制备药物中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述药物可用于治疗肿瘤，如多发性骨髓瘤。

本发明针对现有car-t细胞制备中，所得car-t细胞阳性率低而影响其有效性和特异性，提供了一种提高car-t细胞阳性率的扩增免疫细胞的方法，利用本发明的扩增免疫细胞的方法得到的car-t细胞的阳性率可提高4-6倍，并且该方法操作简便、高效、特异性强，实用性强。

附图说明

图1为扩增特异性car-t细胞的培养方法流程图。

图2为抗bcmacar-t细胞阳性率的检测结果，a-f的横坐标为cd3阳性细胞数，纵坐标表示car阳性细胞数,q1+q2是car的总阳性率，q2+q3是cd3的总阳性率，q4是双阴性率，q2是双阳性率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的293t和293ft细胞为南京科佰生物科技有限公司产品。

实施例1、扩增car-t细胞的方法

本实施例以识别b细胞成熟抗原(bcellmaturationantigen，bcma，cd269)的抗bcmacar-t细胞为例具体阐述了提高car-t细胞扩增效率的方法，流程图见图1，具体步骤如下：

1、质粒的准备

采用无内毒素质粒大提试剂盒提取慢病毒包膜质粒pmd2.g、pspax2以及含car基因的慢病毒表达质粒(pwpxld-car-bcma-egfp质粒)和对照质粒pwpxld-egfp待用。其中，pmd2.g、pspax2、pwpxld-egfp质粒均为addgene产品(http://www.addgene.org)；含car基因的慢病毒表达质粒(pwpxld-car-bcma-egfp)由以下方式构建而成：

将pwpxld-egfp的pmei和spei识别序列间的dna片段替换为序列表中seqidno.1所示的dna片段，得到重组载体pwpxld-car-bcma-egfp，pwpxld-car-bcma-egfp能表达anti-bcmascfv、cd8hinge、4-1bb、cd3ζ形成的融合蛋白，该融合蛋白质的序列为序列表中seqidno.2。

2、慢病毒的制备

通过293t或293ft细胞包装慢病毒，具体操作如下：

①向dmem高糖培养基中添加fbs(fbs在培养基中的质量百分比为10％)后培养293t细胞于10cm培养皿，待293t细胞汇合度达70-90％时，利用lipo2000(或pei)将pwpxld-car-bcma-egfp质粒、pmd2.g和pspax2三个质粒转化293t细胞，每个10cm皿转化12ug的pwpxld-car-bcma-egfp质粒，7.8ug的pspax2，4.2ug的pmd2.g，48μl的lipo2000(或72μl的pei)；

②步骤①完成后，将转化后的体系正常培养，分别在培养24h、48h和72h收集三个时间段的培养上清液；将三个时间段的培养上清液分别经400g离心5分钟，弃沉淀，然后将离心得到的三种上清液分别通过0.45μm过滤器过滤，过滤后将滤液混合到一起，得到慢病毒液；将慢病毒液置于超级离心管中分别在超高速离心机上25000rpm、4℃离心2h使病毒沉淀，弃上清液，然后向每个超速离心管中加入100μl4℃预冷的pbs或rpmi-1640无血清培养基重悬，即得到转染了pwpxld-car-bcma-egfp质粒的慢病毒悬浮液，放置-80℃待用。

按照上述方法，将pwpxld-car-bcma-egfp质粒替换为对照质粒pwpxld-egfp，其他步骤均不变，得到转染了pwpxld-egfp的慢病毒悬液，放置-80℃待用。

3、t细胞的准备

通过ficoll密度梯度法分离出健康人或多发性骨髓瘤患者血液中的单个核细胞(pbmc)。

pbmc分离后，第一天先用添加了10％fbs的rpmi-1640培养基培养pbmc12h，然后改用添加了10％fbs、50ng/ml的okt3抗体(r&dsystem，mab100)、50ng/ml的cd28抗体(miltenyi，130-093-375)和10ng/mlil-2(sigma，spr3085)的rpmi-1640培养基激活t细胞并继续培养48h。

第三天，将刺激后的t细胞重悬并400g离心5min，去上清，用含10ug/mlpolybrene的rpmi1640培养基重悬并铺板至六孔板中，每孔2ml，含2×10⁶个细胞，然后在不同孔中加入步骤2得到的一种慢病毒，根据慢病毒滴度，moi设为20，然后将细胞置于37℃5％co2培养箱中培养24h，重悬细胞，400g5min离心去上清液后换上新鲜的含10％fbs、50ng/mlil-2和50ng/mlil-7的rpmi-1640培养基，37℃5％co2培养箱中培养至第7天，初步获得抗bcmacar-t细胞，期间每隔一天对t细胞半量换培养液并计数，此期间可荧光观察及流式检测egfp及car的表达率。

4、抗原刺激扩增抗bcmacar-t细胞

初步获得抗bcmacar-t细胞后，接步骤3用含10％fbs、50ng/mlil-2和50ng/mlil-7的rpmi-1640培养基继续培养细胞，期间每隔一天，分别向培养体系中添加在培养体系中的浓度为10ng/ml的bcma抗原(acrobiosystems，bca-h522y)，保持细胞培养密度为1×10⁶个/ml，每2～3天进行细胞计数及半量换液，培养第14天，收获car-t细胞并用流式细胞仪检测car-t细胞阳性率，所用试剂为apc标记的cd3抗体(ebioscience，17-0036-72)，生物素化的羊抗鼠fab抗体(jacksonimmunoresearch，115-066-072)，羊igg抗体(abcam，37373)，生物素化的羊igg抗体(abcam，37376)，小鼠igg抗体(碧云天，a7028)，pe标记的链霉亲和素(bd，554061)。添加抗原实验设两个重复实验，分别记为第一组和第二组。

利用不添加bcma抗原培养步骤3初步获得的抗bcmacar-t细胞，培养至第14天作为不添加抗原对照实验。

结果如图2所示，图2中a为不添加抗原对照实验中第5天抗bcmacar-t细胞的阳性率(即表达抗bcma的car-t细胞占总car-t细胞的百分比)，b为不添加抗原对照实验中第14天抗bcmacar-t细胞的阳性率，c、e为添加抗原实验中第5天抗bcmacar-t细胞的阳性率，d、f为添加抗原实验中第14天抗bcmacar-t细胞的阳性率。结果显示，不添加抗原对照实验中，抗bcmacar-t细胞在第5天的阳性率为4.49％，在第14天的阳性率为10.5％；添加抗原实验中，第一组，抗bcmacar-t细胞在第5天的阳性率为4.49％(图2中c)，在第14天的阳性率为46.8％(图2中d)；第二组，抗bcmacar-t细胞在抗原刺激前(第5天)的阳性率为12.2％(图2中e)，抗原刺激后(第14天)的阳性率为68.2％(图2中f)，是未经抗原刺激的4-6倍。表明，利用本发明的扩增car-t细胞的方法可以提高car-t细胞的阳性率，说明car-t细胞的有效性和特异性得到了极大提高。扩增后的car-t细胞，可用于体内外功能检测、杀瘤效果评估级临床应用。

<110>深圳华大生命科学研究院

<120>一种扩增特异性car-t细胞的培养方法

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