靶向ErbB受体家族且自表达PD-1抗体的CAR-T细胞及其用途的制作方法

本发明属于基因工程学和免疫学，涉及靶向erbb受体家族且自表达pd-1抗体的car-t细胞及其用途pd1抗体pd1抗体。

背景技术：

癌症现在已成为人类健康的头号杀手，快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。目前常用的治疗手段效果十分有限，仍需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。

嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法作为肿瘤免疫治疗的重要分支之一，在恶性血液肿瘤中已经取得了非常好的疗效，对复发难治性b细胞白血病的完全缓解率超过90％。嵌合抗原受体是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen,taa)的抗体单链可变区(single-chainfragmentvariable，scfv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，itam)”在体外进行基因重组。再通过病毒或其它载体系统将其导入t细胞中，这样经过基因改造的t细胞称之为car-t细胞。car-t细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非mhc限制性的模式表现强效的抗癌作用。

但是，将这种疗法复制到实体瘤时却遇到了很多障碍。一是实体瘤缺乏肿瘤特异性抗原，无法找到完美的治疗靶点。二是实体瘤具有更强的肿瘤免疫抑制微环境。此外，肿瘤本身具有很强的异质性。这些因素导致肿瘤免疫治疗后容易复发。因此，制备多靶点、功能更强的cart细胞，是提高肿瘤治疗效果的关键。例如，采用cart19治疗b细胞急性淋巴细胞白血病，约有30％的病人治疗后会产生cd19抗原阴性复发，研究表明同时以cd19和il3受体α链cd123作为靶点，构建的cart19/123双靶点的cart细胞，具有更好的体内治疗效果，可降低复发率(jclininvest.2016oct3；126(10))。然而，这些car的抗原识别区大多是人工构建的单链抗体，具有较强的免疫原性，体内治疗容易被识别并清除，导致治疗效果不佳。因此，采用天然的肽段构建出多靶点的抗原识别区，具有免疫原性弱，靶向范围更广的优点。

erbb受体家族包含四个成员，分别是表皮生长因子受体erbb1(egfr/her2)、erbb2(her2)、erbb3(her3)和erbb4(her4)。在正常成年人体内，这四种受体的表达量都处于较低水平。然而，许多恶性肿瘤的发生都与erbb1和/或erbb2的过表达有关，包括头颈癌、乳腺癌、肺癌、胃肠道癌、前列腺癌和胰腺癌等。因此，临床研究的许多抗肿瘤药物是靶向erbb不同受体胞外区的单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂，如her2人源化抗体赫赛汀(herceptin)已被fda批准用于乳腺癌的临床治疗。

然而，erbb受体通常是以紧密结合的二聚体的形式发挥作用的。her2是最佳的二聚化伙伴，尤其是与egfr或her3二聚化时能增强酪氨酸激酶信号活化。her3具有配体结合能力但缺乏酪氨酸激酶活性，与her2形成的异源二聚体是最强有力的信号复合体，在乳腺癌中最具有代表性的异源二聚体是her2/her3。单独靶向某一受体的抗肿瘤药物，由于不能靶向其他的erbb受体二聚体，容易引起肿瘤的复发。

t1e是一种嵌合的多肽，它由人转录生长因子α(tgfα)n端的七个氨基酸和表皮生长因子(egf)c端的48个氨基酸组成，它和基于erbb1的同源二聚体和异源二聚体都有很高的亲和力，此外，t1e还能有效结合erbb2/3异源二聚体。有研究表明，以t1e作为scfv的car转染t细胞，可有效治疗人头颈癌的小鼠肿瘤异种移植模型。但是，t1e不能结合单独的erbb2或者erbb3，在靶向erbb受体家族的范围上还存在缺陷。

herstatin是her2被选择性地剪切而产生的her2截短的版本,其序列包括her2第ⅰ及ⅱ胞外区结构域的340个氨基酸和第八内含子编码的79个氨基酸,是一种可溶的her2自身抑制因子。herstatin能与单独的egfr或her2高亲和力结合，其中起主要作用的是第八内含子编码的79个氨基酸(命名为herin)。

pd1(programmeddeath1)：重编程细胞死亡受体1，是调节性t细胞cd28家族的成员，属于免疫球蛋白超家族受体。pd-1和它的配体pd-l1/pd-l2在t细胞的共抑制和衰竭中起重要作用，他们相互作用抑制了共刺激分子调节的t细胞的繁殖和细胞因子的分泌，下调了抗凋亡分子bcl-xl的表达，削弱了肿瘤特异性t细胞的功能，导致一些肿瘤患者不能完全消除肿瘤。因此，抑制免疫检查点pd-1/pd-l1通路是目前治疗淋巴瘤的一个新的方向和靶标。pd-1抗体阻断治疗对晚期或难治性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌、结直肠癌、霍奇金淋巴瘤、卵巢癌等都有一定程度的治疗效果，但是其较高的生产成本及应答率不高限制了它在临床中的运用。

技术实现要素：

本文提供自表达免疫检查点抑制性pd1抗体并靶向erbb受体家族的嵌合抗原受体的t细胞；优选地，所述t细胞：

(1)含有靶向erbb受体的嵌合抗原受体的编码序列和pd1抗体的编码序列；和/或

(2)表达靶向erbb受体的嵌合抗原受体和pd1抗体。

在一个或多个实施方案中，所述t细胞的基因组中整合有靶向erbb受体的嵌合抗原受体的表达框和pd1抗体的表达框。

在一个或多个实施方案中，所述pd1抗体含有抗pd1单链抗体和igg4fc。

在一个或多个实施方案中，所述igg4fc的氨基酸序列如seqidno:1第267-495位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如seqidno:2第799-1485位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述抗pd1单链抗体(scfv)中抗体轻链可变区(vl区)氨基酸序列如seqidno:1第21-131位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如seqidno:2第64-393位碱基序列所示；所述抗pd1单链抗体中的重链可变区(vh区)氨基酸序列如seqidno:1第147-266位氨基酸序列所示；优选地，其编码序列如seqidno:2第439-798位碱基序列所示；优选地，所述抗pd1单链抗体的氨基酸序列如seqidno:1第21-266位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如seqidno:2第61-798位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述pd1抗体从n端到c端，依次含有轻链信号肽、抗pd1单链抗体和igg4fc；优选地，所述轻链信号肽的氨基酸序列如seqidno:1第1-20位氨基酸残基所示；优选地，所示轻链信号肽的编码序列如seqidno:2第1-60位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述pd1抗体的氨基酸序列如seqidno:1第21-495位氨基酸序列所示，或者如seqidno:1所示；优选地，所述pd1抗体的编码序列如seqidno:2第61-1485位氨基酸残基所示，优选如seqidno:2所示。

在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体包含任选的信号肽、t1e、eaaak接头、herin、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域；优选地，所述铰链区为长50个氨基酸残基以上的铰链区。

在一个或多个实施方案中，所述信号肽为分泌型信号肽和膜结合型信号肽，优选为cd8信号肽；更优选地，所述cd8信号肽的氨基酸序列如seqidno:5第1-22位氨基酸残基所示。

在一个或多个实施方案中，所述t1e的氨基酸序列如seqidno:5第23-77位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如seqidno:6第67-231位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述eaaak接头的氨基酸序列如seqidno:5第78-92位氨基酸残基所述；优选地，其编码序列如seqidno:6第232-276位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述herin的氨基酸序列如seqidno:5第93-171位氨基酸残基所述；优选地，其编码序列如seqidno:6第277-513位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述铰链区为cd8铰链区或igg4ch2ch3铰链区；优选地，所述铰链区为igg4ch2ch3铰链区，其氨基酸序列如seqidno:5第172-399位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如seqidno:6第514-1197位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为cd28跨膜区、cd8跨膜区、cd3ζ跨膜区、cd134跨膜区、cd137跨膜区、icos跨膜区和dap10跨膜区中的一种；优选为cd28跨膜区，优选其氨基酸序列如seqidno:5第400-427位氨基酸残基所示，优选其编码序列如seqidno:6第1198-1281位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括cd28、cd134/ox40、cd137/4-1bb、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性t细胞共刺激因子(icos)和dnax激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述共刺激信号分子胞内结构域是cd28胞内结构域，其氨基酸序列如seqidno:5第428-468位氨基酸残基所示，优选其编码序列如seqidno:6第1282-1404位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域为cd3ζ胞内信号域或fcεriγ胞内信号域；优选为cd3ζ胞内信号域，优选地所述cd3ζ胞内信号域的氨基酸序列如seqidno:5第469-580位氨基酸残基所示，优选其编码序列如seqidno:6第1405-1740位碱基序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno:5第23-580位氨基酸残基所示，或如seqidno:5所示；优选地，所示嵌合抗原受体的核苷酸序列如seqidno:6所示第67-1740碱基序列所示，或如seqidno:6所示。

本发明还提供一种组合物，所述组合物含有：

(1)含本文所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和

(2)含cd40激活性抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。

在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体及其编码序列以及所述cd40激活性抗体及其编码序列如本文任一实施方案所述。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有：

(1)含本文所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和

(2)含pd1抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。

在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体及其编码序列以及所述pd1抗体及其编码序列如本文任一实施方案所述。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的t细胞或所述t细胞及其表达的pd1抗体。

本发明还提供本文所述的t细胞或其药物组合物或所述t细胞及其表达的pd1抗体在制备治疗治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述癌症选自：肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、头颈癌、胆管癌、胆囊癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌、霍奇金淋巴瘤、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。

附图说明

图1：重组质粒ps328-antipd1-wt、ps328-antipd1、pnb328-ehcar-ek-28tiz的基因结构模式图。

图2a-2b：不同质量配比的pnb328-ehcar-ek-28tiz和ps328-antipd1质粒构建的嵌合抗原受体修饰t细胞的阳性率及抗体表达量。

图3a-3b：ehcar-ek-28tizt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞并测定阳性率及抗体表达量。

图4：ehcar-ek-28tiz和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的增殖速度对比。

图5a-5d：ehcar-ek-28tiz和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的t细胞的细胞表型测定分析，5a表示衰老表型pd1，5b和5c分别表示活化表型cd69和cd107α，5d表示记忆表型。

图6：ehcar-ek-28tiz和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的杀伤对比，包括人肝癌细胞hcclm3、人肝癌细胞hep3b和人非小细胞肺癌h23。

图7：ehcar-ek-28tiz和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞在egfr抗原刺激下il-2，il-4，il-6，il-10，tnf-α和ifn-γ细胞因子分泌的变化。

图8：ehcar-ek-28tizt细胞、ehcar-ek-28tiz-antipd1-wtt细胞、ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞、mock-t细胞和pbs空白对照，分别治疗小鼠后，不同天数的肿瘤细胞荧光值变化。

具体实施方式

下面对本发明涉及的部分术语进行解释。

在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子和基因编码序列。

术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如car，单链抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mrna5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mrna3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于dna、cdna和重组核酸序列。

术语“fc”即抗体的可结晶段(fragmentcrystallizable,fc)，是指位于抗体分子"y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区ch2和ch3结构域的肽段,是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。

术语“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激信号传递给t细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子cd80，cd86与t细胞表面的cd28分子结合。b细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如lps，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的th细胞表面的cd40l。

术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有g和/或s的接头，以及例如furin2a肽。

术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5m，例如小于大约10^-6m、10^-7m、10^-8m、10^-9m或10^-10m或更小的亲和力(kd)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。

术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”或者“患者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

术语“嵌合抗原受体”(car)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如t细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。car通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或fab片段。

术语“单链抗体”(scfv)是指由抗体轻链可变区(vl区)氨基酸序列和重链可变区(vh区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scfv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型；优选地为膜锚定型。

为了提高ehcar-ek-28tizt细胞的免疫治疗效果，本发明在已有的car-t细胞上表达pd1抗体，在过继性免疫细胞治疗的同时，抑制免疫检查点pd-1/pd-l1通路，能原位激活残留的肿瘤特异性t细胞的功能，增加内源性细胞毒性t细胞的抗肿瘤杀伤效应，促进car-t细胞在体内的增殖，从而提高特异性杀伤肿瘤的疗效。

有研究表明pd1抗体的igg4fc片段容易被单核/巨噬细胞识别而被吞噬，本发明对pd-1抗体igg4fc片段进行碱基突变改造以满足t细胞自身表达的pd-1抗体既可以很好的发挥功能又不引起adcc反应。

因此，本发明提供一种pd1抗体，其含有抗pd1单链抗体和igg4fc。在某些实施方案中，所述igg4fc的氨基酸序列如seqidno:1第267-495位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如seqidno:2第799-1485位碱基序列所示。

在某些实施方案中，所述抗pd1单链抗体(scfv)中抗体轻链可变区(vl区)氨基酸序列如seqidno:1第21-131位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如seqidno:2第64-393位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗pd1单链抗体中的重链可变区(vh区)氨基酸序列如seqidno:1第147-266位氨基酸序列所示；优选地，其编码序列如seqidno:2第439-798位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗pd1单链抗体的氨基酸序列如seqidno:1第21-266位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如seqidno:2第61-798位碱基序列所示。

在某些实施方案中，所述pd1抗体还含有轻链信号肽。在某些实施方案中，所述pd1抗体从n端到c端，依次含有轻链信号肽、抗pd1单链抗体和igg4fc。在某些实施方案中，所述轻链信号肽的氨基酸序列如seqidno:1第1-20位氨基酸残基所示；优选地，所示轻链信号肽的编码序列如seqidno:2第1-60位碱基序列所示。

在某些实施方案中，所述pd1抗体的氨基酸序列如seqidno:1第21-495位氨基酸序列所示，或者如seqidno:1所示；优选地，所述pd1抗体的编码序列如seqidno:2第61-1485位氨基酸残基所示，优选如seqidno:2所示。

本发明还包括所述pd1抗体的编码序列或其互补序列，所述编码序列至少包括本文所述的igg4fc的编码序列或其互补序列。在某些实施方案中，所述pd1抗体的编码序列含有seqidno:2第61-1485位碱基序列所示的序列，优选含有seqidno:2所示的序列。

本发明还包括一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明所述的pd1抗体的编码序列或其互补序列。优选地，所述核酸构建物是表达载体或用于将所述编码序列或其互补序列整合入宿主细胞的整合载体。

本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本文所述的核酸构建物。

本发明还提供所述pd1抗体、其编码序列或互补序列、核酸构建物以及宿主细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤中的用途，所述肿瘤尤其是与pd1相关的肿瘤，包括但不限于本文所述的各种恶性肿瘤。

本发明还提供自表达免疫检查点抑制性pd1抗体并靶向erbb受体家族的嵌合抗原受体的t细胞。所述嵌合抗原受体(car)中，将天然的t1e和herin融合表达作为car的抗原识别区，二者可以互补识别erbb受体家族，扩大靶向范围。

本发明的car通常含有任选的信号肽序列、t1e与herin的融合蛋白、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。

信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的n-末端的氨基酸序列(有时不一定在n端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。信号肽可以是分泌型信号肽或膜结合型信号肽。在本发明的某些实施方案中，信号肽为cd8信号肽、cd28信号肽或cd4信号肽；更优选地为cd8信号肽。cd8信号肽的氨基酸序列可如seqidno:5第1-22位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如seqidno:6第1-66位碱基所示。

本文将天然的t1e和herin融合表达作为car的抗原识别区。所述t1e是一种嵌合的多肽，它由人转录生长因子α(tgfα)n端的七个氨基酸和表皮生长因子(egf)c端的48个氨基酸组成。优选地，t1e的氨基酸序列如seqidno:5第23-77位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如seqidno:6第67-231位碱基序列所示。

本发明中，herin指herstatin第八内含子编码的79个氨基酸。优选地，其氨基酸序列如seqidno:5第93-171位氨基酸残基所示。本发明将编码herin氨基酸的密码子进行优化。因此，本发明优选的herin的核苷酸序列如seqidno：6第277-513位碱基序列所示。

通常，t1e和herin可通过刚性接头序列连接。刚性接头序列的一个示例性的例子是以eaaak为一个单元的2个或多个重复序列，本文也称为eaaak接头。示例性的刚性接头序列如seqidno:5第78-92位氨基酸残基所示；示例性的编码序列如seqidno:6第232-276位碱基序列所示。

本文中，铰链区指免疫球蛋白重链ch1和ch2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自cd8的胞外铰链区、igg1fcch2ch3铰链区、igd铰链区、cd28的胞外铰链区、igg4fcch2ch3铰链区和cd4的胞外铰链区的任意一种或多种。铰链区优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸以上的铰链区。在某些实施方案中，本文使用cd8α铰链区或igg4fcch2ch3铰链区。示例性的igg4fcch2ch3铰链区的氨基酸序列如seqidno:5第172-399位氨基酸残基所示，示例性的igg4fcch2ch3铰链区的编码序列如seqidno:6第514-1197位所示。

跨膜区可以是cd28跨膜区、cd8跨膜区、cd3ζ跨膜区、cd134跨膜区、cd137跨膜区、icos跨膜区和dap10跨膜区中的一种；优选为cd28跨膜区，优选其氨基酸序列如seqidno:5第400-427位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如seqidno:6第1198-1281位碱基所示。

胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域可选自cd28、cd134/ox40、cd137/4-1bb、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)、诱导性t细胞共刺激因子(icos)和dnax激活蛋白10(dap10)的胞内结构域。在某些实施方案中，所述共刺激信号分子的胞内结构域为cd28的胞内结构域，优选其氨基酸序列如seqidno:5第428-468位氨基酸残基所示，示例性的编码序列如seqidno:6第1282-1404位碱基所示。

胞内信号域优选为免疫受体酪氨酸活化基序，可以是cd3ζ胞内信号域或fcεriγ胞内信号域；优选为cd3ζ胞内信号域，优选地所述cd3ζ胞内信号域的氨基酸序列如seqidno:5第469-580所述；在某些实施方案中，其编码序列如seqidno:6第1405-1740位碱基所示。

在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体从n端到c端依次含有：任选的cd信号肽、t1e、eaaak接头、herin、igg4fcch2ch3铰链区、cd28跨膜区、cd28的胞内结构域和cd3ζ胞内信号域；优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno:5第23-580位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体还含有信号肽，优选地，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno:5所示。

应理解，本发明也包括本文所述的嵌合抗体受体及其编码序列。

形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、t1e、herin、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含g和s的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(a)、亮氨酸(l)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)、苯丙氨酸(f)、精氨酸(r)、谷氨酰胺(q)等。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的n-末端、c-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的car的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是flag，ha，ha1，c-myc，poly-his，poly-arg，strep-tagii，au1，ee，t7，4a6，ε，b，ge以及ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

本文还包括编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列。本文的多核苷酸序列可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。

本文所述的多核苷酸序列通常可以用pcr扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如seqidno:6所示。

本文还包括核酸构建物，其含有本文所述的编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列或编码所述pd1抗体的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。在某些实施方案中，所述核酸构建物是表达框。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。具体而言，可将本文car的编码序列或pd1抗体的编码序列克隆入许多类型的载体，例如这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’ltr，5’ltr，本文所述car的编码序列或pd1抗体的编码序列，以及任选的可选择的标记。

合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、eb病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

在某些实施方案中，可使用cn201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请seqidno:5所示的含mcmv增强子、hcmv增强子和ef1α启动子的ccef启动子；seqidno:7所示的含cd3e增强子、mcmv增强子、hcmv增强子和ef1α启动子的tcef启动子；seqidno:8所示的含mcmv增强子、hcmv增强子和含内含子的ef1α启动子的ccefi启动子；seqidno:3所示的含cd3e增强子和含内含子的ef1α启动子的tefi启动子；以及seqidno:3所示的含cd3e增强子、mcmv增强子、hcmv增强子和含内含子的ef1α启动子的tcefi启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。

可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。

在某些实施方案中，将本文所述嵌合抗原受体的编码序列和pd1抗体的编码序列分别克隆到用于将目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中的载体(也称为整合载体)中，尤其是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleepingbeauty、frogprince、tn5或ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’ltr)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’ltr)。转座酶可以是来自piggybac、sleepingbeauty、frogprince、tn5或ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’ltr和3’ltr的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。在某些实施方案中，在5’ltr和3’ltr之间是本发明的car或抗体的表达框，包括相应的启动子序列、car或抗体的编码序列以及polya加尾信号序列。

在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如cn201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)seqidno:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如cn201510638974.7seqidno:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如cn201510638974.7seqidno:5所示。

转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用cmv启动子控制转座酶编码序列的表达。cmv启动子的序列可如cn201510638974.7seqidno:6所示。

在某些实施方案中，本发明含嵌合抗原受体的编码序列的载体为cn201510638974.7所公开的pnb328载体。可采用本领域常规的方法制备本发明的嵌合抗原受体的编码序列，并将其克隆入合适的载体中。

在某些实施方案中，所述用于将目的基因整合到宿主细胞的基因组中的载体不含有转座酶编码序列。例如，可在pnb328载体的基础上除去转座酶编码序列即可获得这类载体。通常，用这类载体将pd1抗体的编码序列及信号肽编码序列(如轻链信号肽的编码序列)整合到宿主细胞的基因组中。示例性的轻链信号肽的氨基酸序列如seqidno：1第1-20位氨基酸残基所示，示例性的轻链信号肽的编码序列如seqidno：2第1-60位碱基所示。

在某些实施方案中，本文所述的经car基因修饰并能表达pd1抗体的t细胞可转入：用于在t细胞基因组中整合入嵌合抗原受体表达框的含转座酶编码序列的载体，和用于在t细胞基因组中整合入本文所述的pd1抗体的表达框的不含转座酶编码序列的载体。

优选地，所述t细胞转入了以pnb328载体为骨架载体构建的含嵌合抗原受体表达框的载体以及以ps328载体(与pnb328相比不含转座酶编码序列)为骨架载体构建的含pd1抗体表达框的载体。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体的编码序列如seqidno:6所示；所述pd1抗体的编码序列如seqidno:2第61-1485位碱基序列。在某些实施方案中，所述含pd1抗体的表达框的载体中，pd1抗体的信号肽为轻链信号肽。示例性的轻链信号肽的氨基酸序列可如seqidno:2第1-60位氨基酸残基所示。更具体而言，在某些实施方案中，所述在t细胞基因组中整合入嵌合抗原受体编码序列的含转座酶编码序列的载体依次含有5’ltr、启动子、cd8信号肽编码序列、t1e、eaaak接头、herin、igg4fcch2ch3铰链区的编码序列、cd28跨膜区的编码序列、cd28胞内结构域的编码序列、cd3ζ胞内信号域的编码序列、polya加尾信号序列、3’ltr和转座酶的编码序列及其启动子；所述在t细胞基因组中整合入本文所述的pd1抗体的编码序列的不含转座酶编码序列的载体在5’ltr和3’ltr之间依次含有启动子、轻链信号肽的编码序列、pd1抗体的编码序列和polya加尾信号序列。

优选地，转染时，含嵌合抗原受体编码序列的载体与含pd1抗体编码序列的载体的质量比为1～7：1～7，优选1：1～5，优选1：1～3，更优选1：1～2，更优选1：1。

转染的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述载体转染感兴趣的细胞中。

感兴趣的细胞可以是本领域周知的各种t细胞，包括但不限于外周血t淋巴细胞、细胞毒杀伤t细胞(ctl)、辅助t细胞、抑制/调节性t细胞、γδt细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)等混合细胞群体的t细胞。在某些实施方案中，t细胞可来源于b细胞恶性肿瘤患者的pbmc。在某些实施方案中，t细胞为原代培养t细胞。

本发明还提供一种组合物，所述组合物含有含本文所述嵌合抗原受体表达框的载体和含本文所述pd1抗体的表达框的载体。该组合物中还可含有合适的试剂，包括但不限于转染用的试剂。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有含本文所述嵌合抗原受体表达框的载体和含本文所述pd1抗体的表达框的载体，或者含有本文所述的组合物。试剂盒中还可配有将所述载体转入细胞中的试剂或仪器。

应理解，本文所述的表达框除含有本文所述的car或抗体的编码序列外，还至少含有合适的启动子和polya加尾信号序列。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的t细胞或所述t细胞及其表达的pd1抗体。药物组合物中可含有合适的药学上可接受的载体或辅料。药物组合物中含有治疗或预防有效量的t细胞。可根据患者的病情等因素确定t细胞的治疗或预防有效量。

本发明还提供本文所述的t细胞或其药物组合物或所述t细胞及其表达的pd1抗体在制备治疗或预防恶性肿瘤(癌症)的药物中的用途；优选地，所述恶性肿瘤是与pd1和/或erbb受体相关的肿瘤；更优选地，所述恶性肿瘤的癌细胞表面异常表达至少一个egfr家族成员蛋白。更优选地，所述恶性肿瘤选自：肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、头颈癌、胆管癌、胆囊癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌、霍奇金淋巴瘤、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

实施例1：重组质粒ps328-antipd1、ps328-antipd1-wt和pnb328-ehcar-ek-28tiz的构建

委托上海捷瑞生物公司合成ehcar-ek-28tiz基因、anti-pd1基因和anti-pd1-wt基因，结构模式如图1所示。将各基因分别装入用ecor1+sali双酶切的pnb328和ps328载体(pnb328的结构及序列参见cn201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文；与pnb328相比，ps328缺少pb转座子序列，其它元件与pnb328载体相同)中，构建质粒，分别命名为pnb328-ehcar-ek-28tiz、ps328-antipd1和ps328-antipd1-wt。

结构模式图中的轻链信号肽的核苷酸序列如seqidno:2第1-60位碱基序列所示；anti-pd1-wt的编码如seqidno:4所示(氨基酸序列如seqidno:3第21-495位氨基酸残基所示)；anti-pd1的核苷酸序列如seqidno:2第61-1488位碱基序列所示；cd8信号肽的核苷酸序列如seqidno:6第1-66位碱基序列所示；t1e的核苷酸序列如seqidno:6第67-231位碱基序列所示；herin的核苷酸序列如seqidno:6第232-276位碱基序列所示；eaaak-linker(ek-linker)的核苷酸序列如seqidno:6第277-513位碱基序列所示；migg4fcch2ch3铰链跨膜区核苷酸序列如seqidno:6第514-1197位碱基序列所示；cd28跨膜区(cd28tm)的核苷酸序列如seqidno:6第1-66位碱基序列1198-1281所示；cd28胞内共刺激信号结构区域(cd28ic)核苷酸序列如seqidno:6第1282-1404位碱基序列所示；cd3ζ胞内信号域核苷酸序列如seqidno:6第1405-1740位碱基序列所示。各结构模式图中未示出启动子序列和polya加尾信号序列，其分别位于5’ltr和信号肽序列之间以及3’ltr之前。

实施例2：不同质量配比的pnb328-ehcar-ek-28tiz和ps328-antipd1质粒构建的嵌合抗原受体修饰t细胞的阳性率及抗体表达量测定

分别将pnb328-ehcar-ek-28tiz和ps328-antipd1质粒的量设置为1ug+7ug、2ug+6ug、3ug+5ug、4ug+4ug、5ug+3ug、6ug+2ug、7ug+1ug这7种配比，进行cart细胞构建。构建方法如下：

外周血单核细胞(pbmcs)由上海细胞治疗生产中心分离获得。将pbmc贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始t细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；取八个1.5ml离心管，每管加入5×10⁶个细胞，编号a、b、c、d、e、f、g和h，1200rmp,离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自lonza公司)，各管按比例加入电转试剂共100ul，a、b、c、d、e、f和g管分别加入不同质量配比的重组质粒pnb328-ehcar-ek-28tiz和ps328-antipd1，h管加入6ug对照质粒(pnb328，用于构建mock-t细胞)；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的六孔板中(含2％fbs的aim-ⅴ培液)，混匀，置于37℃，5％co2培养箱培养，六小时后加入刺激因子il-2和egfr/anti-cd28，37℃，5％co2培养3～4天，观察t细胞的生长情况，获得自表达pd1抗体的ehcar-ek-28tizt细胞。分别检测7种配比下构建的cart细胞阳性率及抗体分泌量。

1.流式检测cart细胞阳性率

收集上述七种car-t和mock-t细胞，各分为两份，每份1×10⁶个细胞，生理盐水洗涤两遍，100ul生理盐水重悬细胞，一份加入1ug的egfr-生物素，另一份不加，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，再次用100ul生理盐水重悬细胞，加入1ul的链霉素-pe抗体，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，上机检测，以只加二抗的为对照。

结果如图2a所示，pnb328-ehcar-ek-28tiz和ps328-antipd1质粒的量，以7ug+1ug的形式构建的car-t细胞阳性率最高。

2.elisa检测ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞抗体表达量。

①用包被液将pd1抗原稀释至0.5ug/ml(5ul+1ml包被液)，100ul/孔包被酶标反应板，4℃过夜。

②用pbst清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。

③每孔加封闭液100ul，37℃孵育1小时。

④用pbst清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。

⑤加入样品及标准品，100ul/孔，设复孔和对照孔，37℃孵育1小时。

⑥用pbst清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。

⑦封闭液将iggf4hrp1：30000稀释，100ul/孔，37℃孵育45分钟。

⑧用pbst清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。

⑨加入显色液tmb，100ul/孔，37℃避光显色10-15min。

⑩加入终止液终止反应，50ul/孔。

酶标仪上450nm处测od值，绘制标准曲线，计算pd1抗体浓度。

结果如图2b所示，pnb328-ehcar-ek-28tiz和ps328-antipd1质粒的量，以1ug+7ug的形式构建的car-t细胞分泌的抗体量最高。

综合阳性率和抗体分泌量结果，选用4ugpnb328-ehcar-ek-28tiz和4ugps328-antipd1构建ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞，效果最好。

实施例3：构建ehcar-ek-28tizt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞并测定阳性率及抗体表达量

取6ugpnb328-ehcar-ek-28tiz质粒用于构建ehcar-ek-28tizt细胞，分别取4ugpnb328-ehcar-ek-28tiz和4ugps328-antipd1质粒用于构建ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞，构建方法同实施例2。

流式检测ehcar-ek-28tizt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的阳性率，方法同实施例2。结果见图3a，自表达pd1抗体不会降低cart细胞的阳性率。

elisa检测ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞抗体表达量,方法同实施例2，结果见图3b。

实施例4：ehcar-ek-28tiz和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞增殖速率的对比

各取3×10⁵个细胞实施例3培养至第8天的ehcar-ek-28tizt细胞、ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞和实施例2培养的mock-t细胞，放置到12孔板中培养，培养体积均为1ml。准备96孔白色不透光板，从三组细胞中，各取80μl含细胞的培养液加入到不同的孔中，同时补80μl营养液至原来的12孔板中。再向96孔板中加入80μlcelltiter-glo试剂，在震荡仪上混匀2min，并在室温下孵育10min，酶标仪读luc荧光值。所用的celltiter-gloluminescentcellviabilityassay试剂盒购自promega公司。培养的第9，10，11，12，13天，每天都从12孔板中培养的细胞中取样，按以上步骤检测，根据荧光值绘制细胞增殖曲线。

结果如图4所示，ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的增殖速度明显高于ehcar-ek-28tizt细胞，说明表达pd1抗体可以促进car-t细胞的增殖。

实施例5：ehcar-ek-28tiz和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的细胞表型测定分析

收集实施例3获得的两种ehcar-ek-28tizt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞，细胞数后以1×10⁶个细胞/管分别加入6个1.5ml的ep管中，pbs洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；其中2管分别加入检测活化t细胞表型的流式抗体anti-cd107α-pe和anti-cd69-pe，有1管加入检测记忆t细胞表型的流式抗体anti-cd45ro-pecy5+anti-cd197-fitc+anti-cd62l-pe，有1管分别加入检测抑制性t细胞表型的流式抗体anti-pd1-pe，另外2管分别加入同型对照流式抗体igg1-pe和igg1-pe+igg2a-pecy5+igg2a-pe，每种抗体2μl(均购自jacksonimmunoresearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，pbs清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上机检测。

实验结果发现，流式检测ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的衰老表型pd1的表达量显著低于ehcar-ek-28tiz(图5a)；ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的活化表型cd69和cd107α的表达量高于ehcar-ek-28tiz细胞(图5b和5c)；同时，cd62l(l-选择素)为中央记忆t细胞的标志，cd197为效应记忆t细胞的标志，ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞中效应t细胞的比例明显高于ehcar-ek-28tiz细胞和mock-t细胞(图5d)。这些结果说明，表达pd1抗体可以抑制car-t细胞的耗竭，促进car-t细胞的活化，增强其免疫杀伤功能。

实施例6：ehcar-ek-28tiz和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞杀伤功能对比

选取mhcclassi分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(rtca)检测实施例3获得的两种ehcar-ek-28tizt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：

(1)调零：每孔加入50μldmem或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；

(2)靶细胞铺板：人肝癌细胞hcclm3、人肝癌细胞hep3b和人非小细胞肺癌h23(购买于美国菌种保藏中心atcc)按每孔10⁴个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；

(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以转入pnb328空载体的mockt细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线；

结果如图6所示。自表达pd1抗体的ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞对多种肿瘤细胞的杀伤作用明显强于ehcar-ek-28tizt细胞以及对照t细胞。

实施例7：ehcar-ek-28tizt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞在egfr抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比

用5ug/ml的egfr抗原包被96孔板，4℃包被过夜，pbs清洗3遍，加入1×10⁵(100ul体积)的实施例3制备得到的ehcar-ek-28tizt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞以及对照的mockt细胞(转入pnb328空载体)，培养24h后收集细胞上清。检测这三种t细胞受egfr抗原刺激后细胞因子的分泌情况。

结果如图7所示，ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞的il-2和ifn-γ分泌量相显著高于ehcar-ek-28tizt细胞和mock-t，说明自表达pd1抗体可以促进car-t细胞分泌细胞因子。

实施例8：ehcar-ek-28tizt细胞、ehcar-ek-28tiz-antipd1-wtt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞体内抗肿瘤作用。

购买4～6周龄nsg小鼠20只，平均分为5组，每组4只，接种肝癌细胞株hcclm3-luc，每只1×10⁷，成瘤10天后，尾静脉注射pbs(100ul)、mock-t、ehcar-ek-28tizt细胞、ehcar-ek-28tiz-antipd1-wtt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞(1×10⁷个细胞/只)，观察记录小鼠体内肿瘤荧光变化。

结果显示pbs、mock-t、ehcar-ek-28tiz-antipd1-wtt细胞对肿瘤模型没有治疗效果，ehcar-ek-28tizt细胞和ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞具有很好抗肿瘤效果，但ehcar-ek-28tiz-antipd1t细胞效果明显更好。具体如图8所示。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>上海细胞治疗研究院

上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司

<120>靶向erbb受体家族且自表达pd-1抗体的car-t细胞及其用途

<130>17a010

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>495

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metglualaproalaglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro

151015

aspthrthrglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser

202530

leuserproglygluargalathrleusercysargalaserlysgly

354045

valserthrserglytyrsertyrleuhistrptyrglnglnlyspro

505560

glyglnalaproargleuleuiletyrleualasertyrleugluser

65707580

glyvalproalaargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

leuthrileserserleugluprogluaspphealavaltyrtyrcys

100105110

glnhisserargaspleuproleuthrpheglyglyglythrlysval

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gluilelysglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglygly

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