一种来源于黑曲霉的单胺氧化酶用于手性胺中间体的制备的制作方法

文档序号：18094156发布日期：2019-07-06 10:56阅读：454来源：国知局

本发明属于应用微生物与酶工程领域，具体涉及一株黑曲霉及其基因组编码的一种新型单胺氧化酶，并利用来源于该菌株的单胺氧化酶作为生物催化剂制备若干手性胺中间体。

背景技术：

手性胺是重要和关键的药物结构单元，目前约40%的药物含有手性胺结构，手性胺高效制造技术是手性药物制造工业进步与发展所必须的关键技术。目前，手性胺的制备主要以化学不对称拆分和合成为主，生物催化制造手性胺则主要采用脂肪酶和转氨酶作为催化剂，对单胺氧化酶（mao）的研究和使用较少。

光学活性δ¹-吡咯烷类化合物是制备很多药物的关键手性中间体，这些分子中包含多个手性中心，合成难度极高。例如，(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸是治疗丙型肝炎药物特拉瑞韦（telaprevir）的关键手性中间体，该药物由vertex公司与强生公司联合开发。

采用手性酸试剂通过非对应异构体结晶成盐的拆分方法仍是目前获得光学纯手性胺的主要方法,但理论收率仅有50%成为这一技术的最大弊端。利用过渡金属催化亚胺不对称氢化还原是获得手性胺的另一重要途径，然而这一方法也存在很多不足：如需要活化的亚胺底物；需要使用过渡金属，如rh，ru，ir和ti，但昂贵的价格限制了它们在工业化中的应用。

近年来，随着生物催化技术的不断发展，研究者们积极探索发现和挖掘新酶作为生物催化剂用于手性胺的合成。采用单胺氧化酶不对称氧化消旋胺底物来获得光学纯手性胺的研究目前还主要停留在实验室研发阶段，成果主要集中在国外几个课题组，如英国的turner小组。

为获得高效的手性胺催化工艺，首先应解决单胺氧化酶来源极其有限的问题，迄今为止成功应用的只有黑曲霉单胺氧化酶。从环境中筛选新型微生物菌株作为催化剂是常用的有效途径之一。然而原始菌株直接转化可能存在安全性、遗传稳定性问题，原始菌株内的其他酶可能对底物作用生成副产物等问题，因此将原始菌株的关键单胺氧化酶基因克隆并异源表达，以重组菌或者酶用于生物转化则可避免上述问题，且这种催化体系较为简单，稳定，产物分离提纯容易，易于工业化。

技术实现要素：

本发明的目的是公开一个产自新筛选的黑曲霉（aspergillusniger）的高对映选择性单胺氧化酶anmao2-1，并利用该酶与化学磺化反应相偶联，一锅法反应构建含三个手性中心且水溶性和稳定性更好的光学纯(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-磺酸钠中间体，再通过化学腈化和水解，得到高光学纯度的特拉瑞韦（telaprevir）关键手性中间体(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸。

基于上述发明目的，本发明首先提供一种单胺氧化酶anmao2-1。该酶是从一株黑曲霉（aspergillusniger）中通过基因狩猎法克隆调取出来的。该菌从植物园土壤中富集、分离并经过多轮筛选后获得。

本发明还提供一种上述单胺氧化酶anmao2-1作为生物催化剂转化底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷，并与化学磺化反应相偶联，一锅法反应生成光学纯(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-磺酸钠中间体，再通过化学氰化和水解，得到高光学纯度的特拉瑞韦（telaprevir）关键手性中间体(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸的应用。

其中，从上述黑曲霉（aspergillusniger）中关键单胺氧化酶基因aamao7-6的调取和转化包括以下步骤：

（1）基因狩猎法克隆扩增anmao2-1基因：

采用ctab法提取黑曲霉（aspergillusniger）的基因组dna。通过对已报道对单胺氧化酶基因进行序列对比和同源分析，根据n端和c端保守序列设计兼并引物，以提取的黑曲霉（aspergillusniger）基因组dna为模板进行pcr，将其中的单胺氧化酶基因克隆扩增出来。

其中，上述步骤中涉及的anmao2-1基因pcr扩增所用引物为：

正向5¢-ggatccatgtcccgctccagcgaaggc-3¢（酶切位点bamhi），反向5¢-gaattcctacaacctagccctccccccctc-3¢（酶切位点ecori）；

pcr条件为，95°c预变性5分钟，95°c变性30秒，55°c退火30秒，72°c延伸90秒，30个循环，最后72°c延伸10分钟。pcr产物连入pmd19t载体构建ta克隆，测序结果显示含有一段由34个核苷酸组成的内含子序列。

anmao2-1基因（含内含子）碱基数为1548bp，其序列为（seqidno.1）

atgtcccgctccagcgaaggctacctctggacccctgagcaaatcacctcaggcctacccacagacgcagtccaccccagcacgcccgccctccgcacccactacgacgtgatagtcatcggggccggattcgccggactaattacagcccgcgacctaagcagaaagcacaatctcaacgtcctgctcctagaagcgcgggaccgcatcggtggtcgaacatggacagccaaggttctcggcgaggagatcgaaatgggcgggacctgggttcactggaaccagccgcatctgtatgccgagctgcatcggtacggactgcaccggaatctgaagacctctgcggggtcattcacgcctgtggatcagtggttcaggtccagtagtggtcctgtggagaaggtttctgttgaagattaccaggctacgcttgagcgcgttgcagagaagtttttcgcaattgatgggctggacagtcgtgcgttgatgccgtatccgcatgattcgctgagggagccggcgccgtggaagaggtatgattatcttagtgtggaggagcggttggagatgtcggatttggatgggttgccggggtgggagaaagagctgtttgcgtctaatgttagtacgtttgggagtgcgccggtgaaggatattgggtttgtggaggcgctgcggtggtttgcgctgggagggcatagtatggctggggtgtttgagttggcgggggtgtacaaattggggagtggagggatgacttcttttgcgagggctattttgggggacttcactggtcatgttagctttggaacggttgttgagcagattaatcatggtcgtgatatggtagaggttgtcactaaggatgggaggagggttggggctcgtgcggtggtgtcgacggttccgctgtatgtttctttcctatctcaccttctgttgctttagatatatccacctgactaacctaacgacagaaactgcctcaacgacatccaatttcaacccccactcacccccctccgacaagcagccatcacaaaaggccacattaacaaaggcgcaaagatccacttcaagcttcgcgaaacactaccgggttggttctttactgcacatgacggcagtgactccagctttgtctttgcgttctcagatcacaatggaacccagctaacaggcccgtctggcacctggtgcattggatttgggtacaacgatcaacttactaataagaaggatagcaaatatatcttgcagagattcaagcatgatgttaacccggatgtggatattgatgcctatgccacccatgattggatgaatgatccgtatgcgaaaggggcttgggcgtgctggggaccaaatactgcgtcagaatacttggaggaacttcagaaaccgcatggacgggttgtgtttgcgagcgcggattgggcggacgggtggagggggtttgtggatggtgcgattgagaggggacaggctgctgtgggggaggttttggggatgctggaggggagagagggggggagggctaggttgtag

采用重叠pcr除去anmao2-1基因中的内含子。重叠pcr所用引物为正向5¢-tggtgtcgacggttccgctgaactgcctcaacgacatcca-3¢，反向5¢-tggatgtcgttgaggcagttcagcggaaccgtcgacacca-3¢；

pcr条件为，50ul反应体系，变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃1分30秒，共30个循环，采用pfudnapolymerase。pcr产物连入pmd19t载体构建ta克隆，测序结果显示已正确除去内含子序列。

anmao2-1基因（除去内含子）碱基数为1482bp，其序列为（seqidno.2）

atgtcccgctccagcgaaggctacctctggacccctgagcaaatcacctcaggcctacccacagacgcagtccaccccagcacgcccgccctccgcacccactacgacgtgatagtcatcggggccggattcgccggactaattacagcccgcgacctaagcagaaagcacaatctcaacgtcctgctcctagaagcgcgggaccgcatcggtggtcgaacatggacagccaaggttctcggcgaggagatcgaaatgggcgggacctgggttcactggaaccagccgcatctgtatgccgagctgcatcggtacggactgcaccggaatctgaagacctctgcggggtcattcacgcctgtggatcagtggttcaggtccagtagtggtcctgtggagaaggtttctgttgaagattaccaggctacgcttgagcgcgttgcagagaagtttttcgcaattgatgggctggacagtcgtgcgttgatgccgtatccgcatgattcgctgagggagccggcgccgtggaagaggtatgattatcttagtgtggaggagcggttggagatgtcggatttggatgggttgccggggtgggagaaagagctgtttgcgtctaatgttagtacgtttgggagtgcgccggtgaaggatattgggtttgtggaggcgctgcggtggtttgcgctgggagggcatagtatggctggggtgtttgagttggcgggggtgtacaaattggggagtggagggatgacttcttttgcgagggctattttgggggacttcactggtcatgttagctttggaacggttgttgagcagattaatcatggtcgtgatatggtagaggttgtcactaaggatgggaggagggttggggctcgtgcggtggtgtcgacggttccgctgaactgcctcaacgacatccaatttcaacccccactcacccccctccgacaagcagccatcacaaaaggccacattaacaaaggcgcaaagatccacttcaagcttcgcgaaacactaccgggttggttctttactgcacatgacggcagtgactccagctttgtctttgcgttctcagatcacaatggaacccagctaacaggcccgtctggcacctggtgcattggatttgggtacaacgatcaacttactaataagaaggatagcaaatatatcttgcagagattcaagcatgatgttaacccggatgtggatattgatgcctatgccacccatgattggatgaatgatccgtatgcgaaaggggcttgggcgtgctggggaccaaatactgcgtcagaatacttggaggaacttcagaaaccgcatggacgggttgtgtttgcgagcgcggattgggcggacgggtggagggggtttgtggatggtgcgattgagaggggacaggctgctgtgggggaggttttggggatgctggaggggagagagggggggagggctaggttgtag

anmao2-1基因（除去内含子）编码494个氨基酸，序列为（seqidno.3）：

msrssegylwtpeqitsglptdavhpstpalrthydvivigagfaglitardlsrkhnlnvllleardriggrtwtakvlgeeiemggtwvhwnqphlyaelhryglhrnlktsagsftpvdqwfrsssgpvekvsvedyqatlervaekffaidgldsralmpyphdslrepapwkrydylsveerlemsdldglpgwekelfasnvstfgsapvkdigfvealrwfalgghsmagvfelagvyklgsggmtsfarailgdftghvsfgtvveqinhgrdmvevvtkdgrrvgaravvstvplnclndiqfqppltplrqaaitkghinkgakihfklretlpgwfftahdgsdssfvfafsdhngtqltgpsgtwcigfgyndqltnkkdskyilqrfkhdvnpdvdidayathdwmndpyakgawacwgpntaseyleelqkphgrvvfasadwadgwrgfvdgaiergqaavgevlgmlegreggrarl

而后将测序正确的质粒以bamhi和ecori酶切，将其连入以同样酶消化的pet28a（+）空载体中，构建重组质粒，并转入大肠杆菌bl21（de3）中，构建重组菌，中以常规方法过量表达。后文涉及生物转化和应用的基因及酶均指去除内含子后的序列及蛋白表达产物。

（2）重组菌生物催化：

挑取单克隆至lb（含卡那霉素50μg/ml）培养基中，37°c过夜培养，以1%的接种量转接至lb（含卡那霉素50μg/ml）培养基中，37°c培养3h，加入0.5mmiptg诱导后，30°c继续培养至20~36h。8000rpm，4°c离心收集菌体，用ph值为8.0、0.1m浓度的磷酸钾缓冲溶液洗涤2次，获得湿菌体。

取上述新鲜培养的湿菌体重悬于ph值为8.0、1m浓度的磷酸钾缓冲液，加入底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷，反应过程中向反应体系中通入氧气，转化体系中菌体浓度为50~150g/l，底物终浓度为1~20g/l，转化温度为30°c，转速为230rpm，转化时间为1~24h。反应过程中采用tlc检测反应情况,展开剂比例为石油醚：乙酸乙酯：三乙胺=15:1:0.1，碘显显色。

（3）anmao2-1酶的蛋白纯化

anmao2-1酶的纯化采用镍柱亲和层析（bio-rad）。将上述步骤（2）诱导培养20~36h后的菌体以13,000rpm，4°c离心收集，重悬于buffera（50mm磷酸盐缓冲液，ph8.0，300mmnacl，10mm咪唑），超声破碎（超声10s，间隔30s，30次），之后以13,000rpm，4°c离心20分钟，将上清液加入已用buffera平衡的柱料中，轻微混匀30分钟，用含有20mm咪唑的buffera漂洗杂蛋白，再用含250mm咪唑的buffera的缓冲液洗脱目的蛋白，最后电泳鉴定纯度，并用bcaproteinassaykit测定蛋白浓度。

（4）单胺氧化酶anmao2-1不对称氧化与亲核加成磺化偶联反应：

表达anmao2-1酶的大肠杆菌重组菌的菌体培养、获得湿菌体的步骤同步骤（2）。

生物转化条件：在三口圆底反应烧瓶中分别加入磷酸盐缓冲液（ph8.0，0.1m）,底物和湿菌体/酶，其中顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷终浓度为20g/l，湿菌体终浓度为50g/l，过氧化氢酶（cat，30ku/mg）终浓度为1000ku/l，在37°c,250rpm条件下开始反应24小时，反应过程中保持通入氧气。反应过程中滴加nahso3溶液(nahso3摩尔物质的量为底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷的1.2倍)，不对称氧化生成的亚胺中间体随即与nahso3发生反式亲核加成反应，生成水溶性和稳定性更好的含3个手性中心的(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-磺酸钠产物，反应过程中滴加3nnaoh调节反应体系ph维持在8.0左右。

（5）氰化反应制备(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-腈

氰化反应条件：环戊基甲醚（cpme）50ml加入到步骤（4）的反应液中，溶液降温至10°c。缓慢滴加15mlnacn水溶液(nacn摩尔物质的量为底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷的1.2倍)，于半小时滴加完毕。10°c继续反应1小时，过滤除去不溶物，取有机相，水相用cpme3×20ml萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后减压蒸馏除去溶剂，残留物即为(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-腈。

（6）水解反应制备(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸

水解反应条件：将步骤（5）得到的(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-腈与10ml浓盐酸（33%）分别加入到50ml圆底烧瓶中，加热回流过夜。降温至室温后向圆底烧瓶中加入氨水条件体系ph至7.0。采用离子交换层析法进行纯化，已填好的阳离子交换树脂柱先用1nhcl洗涤，后用纯水洗涤至ph中性为止。将反应液上柱，用纯水洗涤3~5个柱体积后用5%的氨水洗涤，接收洗脱产物，洗脱过程用茚三酮显色进行监测，减压蒸馏除去溶剂所得类白色固体即为(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸的铵盐。步骤（4）~（6），反应总收率约44%，产物(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸光学纯度为91%ee值。产物在乙醇-甲基叔丁基醚混合液中重结晶后总收率34%，光学纯度提高到95%ee值。此氨基酸产物的光学纯度采用手性高效液相色谱（hplc）分析法来确定。手性hplc条件:手性柱chirex3126(d)-penicillamine（50mm×4.6mm,5micron），流动相h2o:ch3cn=90:10,2mmcuso4,流速0.8ml/min,，柱温25°c,监测波长247nm，产物保留时间tr=6.7分钟和9.8分钟。

本发明涉及的黑曲霉（aspergillusniger）其关键单胺氧化酶基因anmao2-1可高立体选择性转化顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷生成亚胺中间体(3ar,6as)-六氢环戊二烯并[c]吡咯啉，并可与化学磺化反应相偶联，一锅法反应构建(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-磺酸钠中间体，再通过化学腈化和水解，得到高光学纯度的特拉瑞韦（telaprevir）关键手性中间体(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸。目前国内外还未有专利及文献报道从黑曲霉（aspergillusniger）中挖掘单胺氧化酶以及将其用于特拉瑞韦（telaprevir）关键手性中间体(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸的制备。anmao2-1与已报道的功能蛋白mao-n-d5（pdb数据库id：2vvm）的最高相似度为32.9%，为(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸生物催化合成提供了可供选择的新型酶源。

目前，国内外还未有专利及文献报道采用单胺氧化酶不对称氧化与化学磺化反式亲核加成反应相偶联，一锅法反应生成光学纯(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-磺酸钠中间体用于制备特拉瑞韦（telaprevir）关键手性中间体(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-羧酸。

凡是与anmao2-1氨基酸相似度高于70%且具有催化顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷生成(3ar,6as)-六氢环戊二烯并[c]吡咯啉功能的酶均属于本发明的保护范围。另外，采用单胺氧化酶不对称氧化与化学磺化反式亲核加成反应相偶联，一锅法反应生成光学纯(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-磺酸钠的合成方法也在本发明的保护范围。

附图说明

图1是anmao2-1蛋白纯化后sds-page图。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例1：基因组dna提取

采用ctab法提取基因组dna操作方法如下：

菌株培养：将少量黑曲霉（aspergillusniger）斜面种子接种于曲霉培养基中，30°c，230rpm培养24~36h制备种子液，以0.5%~2%的接种量转接至曲霉培养基中扩大培养，培养条件：30°c，230rpm，48~72h。曲霉培养基成分：0.3%kh2po4；0.15%mgso4•7h2o；0.1%酵母膏；0.06%蛋白胨；2%葡萄糖；20%土豆。

取0.5~1.0g菌丝体至研钵中，加石英砂液氮研磨粉碎。将该粉末转移到2.0ml的ep管中，加入600ul的dna抽提液（每50mg菌体加500μl），振荡，混匀，55℃保温60分钟。用4mol/lnacl调整溶液nacl浓度为1.4mol/l，然后加入1/10体积的10%ctab溶液，混匀，65℃保温10分钟。加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀，冰浴30分钟。4℃，15000r/分钟离心10分钟。将上清液转移到另一ep管中，加入等体积的异丙醇混匀，冰浴30分钟。取出ep管，10000r/分钟，4℃离心10分钟，弃上清液，75%乙醇洗涤两次，空气干燥，加入150ulddh2o溶解沉淀即得基因组总dna。dna抽提液组成：0.1mol/ltris-hcl（ph8.0），0.01mol/ledta，2%sds，100μg/mlproteinasek，0.5%β-mercaptoethanol。

实施例2：基因狩猎法克隆扩增anmao2-1基因

通过对已报道对单胺氧化酶基因进行序列对比和同源分析，根据n端和c端保守序列设计兼并引物，以实施例1中获得的基因组dna为模板进行pcr，将其中的单胺氧化酶基因克隆扩增出来。

pcr反应体系为50ul，分别由5ul×10pfudnapolymerasebuffer(含mg²⁺)，1ulprimerf，1ulprimerr，4uldntp，1ul基因组dna，0.5ulpfudnapolymerase和37.5ulddh2o组成。其中，pcr扩增所用引物为：

primerf：5¢-ggatccatgtcccgctccagcgaaggc-3¢（酶切位点bamhi），primerr：5¢-gaattcctacaacctagccctccccccctc-3¢（酶切位点ecori）；

pcr条件为，95°c预变性5分钟，95°c变性30秒，55°c退火30秒，72°c延伸90秒，30个循环，最后72°c延伸10分钟。pcr产物连入pmd19t载体构建ta克隆，测序结果显示含有一段由57个核苷酸组成的内含子序列。anmao2-1基因（含内含子）碱基数为1548bp，其序列为（seqno.1）。

采用重叠pcr除去anmao2-1基因中的内含子。

第一轮pcr：将之前提取的质粒pmd19t-anmao2-1作为模板，进行pcr，反应体系(50ul)如下：

前段基因(a)：5ul×10pfubuffer(含mg²⁺)，1ulprimerf，1ulprimerrm，4uldntp，1ulpmd19t-anmao2-1，0.5ulpfudnapolymerase，37.5ulddh2o。

后段基因(b)：5ul×10pfubuffer(含mg²⁺)，1ulprimerfm，1ulprimerr，4uldntp，1ulpmd19t-anmao2-1，0.5ulpfudnapolymerase，37.5ulddh2o。重叠pcr所用引物为fm5¢-tggtgtcgacggttccgctgaactgcctcaacgacatcca-3¢，rm5¢-tggatgtcgttgaggcagttcagcggaaccgtcgacacca-3¢；

pcr条件为，95°c预变性5分钟，95°c变性30秒，55°c退火30秒，72°c延伸90秒，30个循环，最后72°c延伸10分钟。

采用凝胶回收试剂盒回收2段pcr产物，回收产物编号：7-6-a和7-6-b。

第二轮pcr：将之前回收的pcr产物2-1-a和2-1-b作为模板，进行pcr，反应体系(50ul)如下：5ul×10pfubuffer(含mg²⁺)，1ulprimerf，1ulprimerr，4uldntp，1ul2-1-a，1ul2-1-b，0.5ulpfudnapolymerase，36.5ulddh2o。

采用凝胶回收试剂盒回收pcr产物，并与pmd19-t载体连接，转化到感受态细胞e.colidh5α中，lb平板（含氨苄青霉素100ug/ml）培养，通过蓝白斑筛选选出阳性克隆进行培养，提取质粒和测序。

10ul连接体系：1ulpmd19-t载体，5ulnebsolutioni，4ulpcr回收产物，16℃下过夜连接。

转化：将连接片段4ul转化到e.colidh5α中，la平板（含10ul×5x-gal，7ul1miptg）37℃培养。

蓝白斑筛选：挑取白色单克隆菌落(每个平板挑2个菌)到3mllb液体培养基（含氨苄青霉素100ug/ml）的试管中，37℃，180rpm下培养17小时。

采用细菌质粒小提试剂盒提取质粒pmd19t-anmao2-1。质粒测序结果显示已正确除去内含子序列。anmao2-1基因（除去内含子）碱基数为1482bp，其序列为（seqno.2）

实施例3：将anmao2-1基因构建在基因工程菌株中

对质粒pmd19t-anmao2-1进行双酶切。酶切体系40ul，由33ulpmd19t-anmao2-1，1.0ulbsa，1.0ulbamhi，4ulnebbuffer3组成，37℃酶切3小时后补加1.0ulecori，继续于37℃酶切3小时。

对载体pet28a进行双酶切。酶切体系40ul，由33ulpet28a，1.0ulbsa，1.0ulbamhi，4ulnebbuffer3组成，37℃酶切3小时后补加1.0ulecori，继续于37℃酶切3小时。

酶切产物采用凝胶回收试剂盒进行回收和纯化。

连接：10ul体系，6ulanmao2-1（bamhi/ecori)，2ulpet28a(bamhi/ecori)，1ult4dnaligasebuffer，1ult4dnaligase。16℃下连接过夜。

转化与培养：将连接的10ul载体pet28-anmao2-1转化到感受态细胞e.colidh5α中，涂布在lb平板（含卡那霉素50μg/ml），于37℃培养箱培养过夜。从生长含有pet28-anmao2-1的e.colidh5α平板上挑取单克隆菌落，于含卡那霉素（kan）抗性的lb液体培养基中培养，37℃，180rpm。采用细菌质粒小提试剂盒提取质粒pet28-anmao2-1。

转化到基因工程菌中与培养：将2ul质粒pet28-anmao2-1转化到感受态细胞e.colibl21中，涂布在lb平板（含卡那霉素50μg/ml），于37℃培养箱培养过夜。从生长含有pet28-anmao2-1的e.colibl21平板上挑取单克隆菌落，于含kan抗性的lb液体培养基中培养，180rpm，37℃，培养过夜。以1%的接种量转接至lb（含卡那霉素50μg/ml）培养基中，37°c培养3小时，加入0.5mmiptg诱导后，30°c继续培养至16~20小时。8000rpm，4°c离心收集菌体，用ph值为8.0、0.1m浓度的磷酸钾缓冲溶液洗涤2次，获得湿菌体可用于后续生物转化反应。

实施例4：单胺氧化酶anmao2-1重组菌全细胞生物催化

单胺氧化酶anmao2-1重组菌的培养方法和菌体收集方法见说明书发明内容部分。

（1）取菌体1.0g，重悬于10ml磷酸盐缓冲液（ph8.0，0.1m），加入底物10mg，30°c，230rpm转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3ar,6as)-六氢环戊二烯并[c]吡咯啉，经tlc薄层层析色谱分析，底物的转化率为24%。

（2）取菌体1.0g，重悬于10ml磷酸盐缓冲液（ph8.0，0.1m），加入底物10mg，反应瓶中通入纯氧，30°c，230rpm转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3ar,6as)-六氢环戊二烯并[c]吡咯啉，经tlc薄层层析色谱分析，底物的转化率为30%。

（3）取菌体1.0g，重悬于10ml磷酸盐缓冲液（ph8.0，0.1m），加入底物10mg，过氧化氢酶（cat，30ku/mg）1ul，反应瓶中通入纯氧，30°c，230rpm转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3ar,6as)-六氢环戊二烯并[c]吡咯啉，经tlc薄层层析色谱分析，底物的转化率为44%。

（4）取菌体1.0g，重悬于10ml磷酸盐缓冲液（ph8.0，0.1m），加入底物10mg，过氧化氢酶（cat，30ku/mg）1ul，反应瓶中通入纯氧，37°c，230rpm转化24h。以10ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3ar,6as)-六氢环戊二烯并[c]吡咯啉，经tlc薄层层析色谱分析，底物的转化率为78%。

（5）取菌体1.5g，重悬于10ml磷酸盐缓冲液（ph8.0，0.1m），加入底物500mg，过氧化氢酶（cat，30ku/mg）1ul，反应瓶中通入纯氧，37°c，230rpm转化24h。以10ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3ar,6as)-六氢环戊二烯并[c]吡咯啉，经tlc薄层层析色谱分析，底物的转化率为43%。

实施例5：单胺氧化酶anmao2-1纯酶生物催化

转化体系：磷酸钾缓冲液（0.1m，ph8.0），纯酶浓度2g/l，底物顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷，过氧化氢酶（cat，30ku/mg）1ul，反应瓶中通入纯氧，30°c生物转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到产物(3ar,6as)-六氢环戊二烯并[c]吡咯啉，经tlc薄层层析色谱分析，底物的转化率为22%。

实施例6：单胺氧化酶anmao2-1不对称氧化与磺化反应偶联

单胺氧化酶aamao7-6重组菌的培养方法和菌体收集方法见说明书发明内容部分。

在100ml圆底三口反应烧瓶中分别加入10ml重悬菌液（用0.1m，ph8.0磷酸钾缓冲液重悬1.5g湿菌体），2克顺式-7-氮杂双环[3,3,0]辛烷，过氧化氢酶（cat，30ku/mg）5ul，反应瓶中持续通入氧气，反应开始后缓慢滴加5mlnahso3溶液(nahso32.2g)，于1h内加毕，随后继续在37°c,230rpm条件下反应24小时，反应过程中滴加3nnaoh调节反应体系ph维持在8.0左右。反应结束后用10ml乙酸乙酯萃取，除去有机相，水相加入3nhcl调节ph＜2，用3×10ml甲基叔丁基醚（mtbe）萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏后得类白色固体即为(1s,3ar,6as)-八氢环戊二烯并[c]吡咯-1-磺酸，收率81%。

序列表

<110>说明书

<120>一种来源于黑曲霉的单胺氧化酶用于手性胺中间体的制备

<130>成都渊源生物科技有限公司

<141>2017-12-28

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