一种多肽自组装纳米载体及其制备方法与流程

本发明涉及一种多肽自组装纳米载体及其制备方法，属于自组装纳米材料技术领域。

背景技术：

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)占肺癌的3/4以上，由于早期肺癌缺乏明显的症状，85％以上确诊时已是中晚期从而失去手术治疗的机会。传统化疗由于化疗中使用的抗癌药物对肿瘤细胞缺少有效的选择性，对正常组织的毒副作用以及肿瘤细胞的耐药性限制了抗癌的疗效，使nsclc难以治愈。为了有效的治疗nsclc，构建包载抗肿瘤药物的纳米肿瘤靶向传递系统将抗癌药物传送至靶组织、靶细胞，甚至是特定的细胞器，发挥靶向作用是癌症治疗的关键。

基因融合肽kala，其氨基酸序列如seqidno：1所示，是一种人工合成阳离子穿膜肽，具有良好的穿膜性能。nls是来源于病毒sv40大t抗原的碱性七肽，其氨基酸序列如seqidno：2所示。该nls多肽结构简单，效率高，具有介导外源性物质跨膜转运入核的能力。目前尚未见有将基因融合肽kala和十八烷脂酸(sa)依次连接到核定位信号nls多肽上以制得多肽自组装纳米载体nls-kala-sa的相关报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可以有效包载和压缩dna、mrna及核酸类药物，能够使kala穿膜作用实现细胞内吞的多肽自组装纳米载体及其制备方法。

本发明所述的多肽自组装纳米载体的制备方法为：采用fmoc固相合成法依次将基因融合肽kala、硬脂酸连接到nls多肽上，即得到多肽自组装纳米载体nls-kala-sa；其中，

所述基因融合肽kala的氨基酸序列如seqidno：1所示，所述nls多肽的氨基酸序列如seqidno：2所示。

具体的，上述制备方法主要包括以下步骤：

1)取2-氯三苯甲基氯树脂置于多肽合成装置中，加入n，n二甲基甲酰胺浸泡树脂，使其充分溶胀，之后排出n，n二甲基甲酰胺；

2)取nls多肽氨基酸序列中的最后一个氨基酸fmoc-l-pro-oh用n，n二甲基甲酰胺溶解，所得溶液转入上述多肽合成装置中，再加入n，n-二异丙基乙胺，室温条件下反应，使氨基酸充分固定在树脂上，反应完成后抽干反应液，剩余物料用n，n二甲基甲酰和甲醇交替洗涤；然后再用哌啶对其进行保护基的脱除，完成脱保护后抽干反应液，剩余物料用n，n二甲基甲酰和甲醇交替洗涤；之后取少许树脂置于由茚三酮、氰化钾和苯酚组成的混合溶液中，加热至沸腾观察树脂是否变色，如果变为红色，则表示氨基酸已偶联至树脂上，否则需要重新连接；

3)取nls多肽氨基酸序列中的倒数第二个氨基酸fomc-lys(boc)-oh和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐，用n，n二甲基甲酰胺溶解，所得溶液转入上述多肽合成装置中，再加入n，n-二异丙基乙胺，室温条件下反应，使fomc-lys(boc)-oh连接到上一个氨基酸上，反应完成后抽干反应液，剩余物料用n，n二甲基甲酰胺和甲醇交替洗涤；然后再用哌啶对其进行保护基的脱除，完成脱保护后抽干反应液，剩余物料用n，n二甲基甲酰胺和甲醇交替洗涤；之后取少许树脂置于由茚三酮、氰化钾和苯酚组成的混合溶液中，加热至沸腾观察树脂是否变色，如果变为蓝色，则表示第二个氨基酸已完全同上一个氨基酸偶联，否则需要重新连接；

4)重复上述步骤3)分别缩合nls多肽氨基酸序列中的其它氨基酸以及基因融合肽kala氨基酸序列中的各氨基酸，缩合顺序为从右到左依次进行，得到连接有基因融合肽kala的树脂；

5)取连接有基因融合肽kala的树脂和十八烷酸用n，n二甲基甲酰胺溶解，然后加入n，n-二异丙基乙胺，室温条件下反应，反应完成后用n，n二甲基甲酰胺和甲醇交替洗涤，得到连接有基因融合肽kala和十八烷酸的树脂；

6)将所得连接有基因融合肽kala和十八烷酸的树脂置于裂解液中裂解反应，过滤，收集滤液，向其中加入乙醚，有沉淀生成，离心，收集沉淀，得到多肽自组装纳米载体nls-kala-sa粗品；其中，所述裂解液按重量百分比计由下述组分组成：三氟乙酸94.5％、1,2-乙二硫醇2.5％、三异丙基硅烷1％和余量的水。

上述方法中，当n，n二甲基甲酰胺的用量作为溶剂使用时，其用量通常以能够溶解原料的量为宜；在用n，n二甲基甲酰胺和甲醇交替洗涤时，通常是交替洗涤3次。n，n-二异丙基乙胺作催化剂使用，其用量通常按0.1mmol的氨基酸或十八烷酸加入0.2-0.5ml的n，n-二异丙基乙胺计算。在进行保护基的脱除操作时，哌啶的用量(ml)通常为剩余物料质量(g)的1-2倍，加入哌啶后进行脱除保护基的反应时间通常为10min，脱除保护基操作通常进行2次。用于检测氨基酸是否连接上的由茚三酮、氰化钾和苯酚的混合溶液中，茚三酮、氰化钾和苯酚的体积比为1：1：1。

上述方法的步骤1)中，浸泡的时间通常为20-60min。

上述方法的步骤2)中，fmoc-l-pro-oh和2-氯三苯甲基氯树脂的摩尔比为97：3；在加入n，n-二异丙基乙胺后，反应时间为60min。

上述方法的步骤3)中，fomc-lys(boc)-oh和fmoc-l-pro-oh的摩尔比为3：1，苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐和fmoc-l-pro-oh的摩尔比为3：1，反应时间为40min。

上述方法的步骤4)中，在缩合基因融合肽kala中的各氨基酸时，除p、d、s、n的氨基检测呈红色，其它的氨基酸残基的氨基检测均呈蓝色。

上述方法的步骤5)中，所述连接有基因融合肽kala的树脂和十八烷酸的质量比为10：1，反应时间为60min。

上述方法的步骤6)中，裂解反应的时间为120min。

由上述方法制备得到的是多肽自组装纳米载体nls-kala-sa粗品，为了提高多肽自组装纳米载体nls-kala-sa的纯度，优选还包括将多肽自组装纳米载体nls-kala-sa粗品进行纯化的步骤，具体是将多肽自组装纳米载体nls-kala-sa粗品上色谱柱，经流动相梯度洗脱，收集含目标成分的洗脱峰，即得到纯化后的多肽自组装纳米载体nls-kala-sa；其中，所述的流动相由a液和b液组成，具体为：

a液：0.1％(体积)三氟乙酸的乙腈溶液；

b液：0.1％(体积)三氟乙酸的水溶液。

在上述纯化步骤中，采用c18色谱柱，先将多肽自组装纳米载体nls-kala-sa粗品用由33％(体积)的a液和67％(体积)的b液组成的流动相溶解后再上样，具体的洗脱条件为：

0-40min内，a液：b液＝33-53％(体积)：67-47％(体积)。

本发明还包括由上述方法制备得到的多肽自组装纳米载体nls-kala-sa。

与现有技术相比，本发明的特点如下：

1、采用fmoc固相合成法依次将基因融合肽kala、十八烷酸(sa)连接到核定位信号nls多肽上，制备得到多肽自组装纳米载体nls-kala-sa，该nls介导的kala多肽纳米载体同时具有主动穿过细胞膜和跨膜转运入核的能力，在该多肽分子中引入sa烷基链可以稳定α-螺旋肽的二级结构并诱导多肽形成更加稳定的自组装体。

2、本发明所述多肽自组装纳米载体nls-kala-sa通过自组装功能可以有效包载和压缩dna、mrna及核酸类药物，能够使kala穿膜作用实现细胞内吞；通过多肽载体α-螺旋构象转变可以逃离内涵体进入细胞质，快速定位细胞核；通过nls与核转运蛋白相互作用进入细胞核，发挥抗癌药物核定位靶向作用，克服抗癌药物对肿瘤细胞缺少有效的选择性，对正常组织的毒副作用，从而实现该纳米基因传递系统对肿瘤的核定位靶向治疗。

附图说明

图1为本发明所述多肽自组装纳米载体nls-kala-sa的化学结构示意图；

图2为本发明实施例1中c18色谱柱纯化多肽自组装纳米载体nls-kala-sa粗品的色谱图；

图3为本发明实施例1制得的目标产物的高效液相色谱图；

图4为本发明实施例1制得的目标产物的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：

本发明所述的多肽自组装纳米载体nls-kala-sa的化学结构示意图如图1所示，其制备方法包括以下步骤(制备方法中涉及的基因融合肽kala的氨基酸序列如seqidno：1所示，所述nls多肽的氨基酸序列如seqidno：2所示)：

1)取1g2-氯三苯甲基氯树脂置于反应管中，加入1mln，n二甲基甲酰胺浸泡树脂30min，使树脂充分溶胀，之后排出n，n二甲基甲酰胺，剩余物料用二氯乙烷洗涤2次；

2)取33.7mg(0.1mmol)氨基酸fmoc-l-pro-oh(nls多肽氨基酸序列中的最后一个氨基酸)用1mln，n二甲基甲酰胺溶解，所得溶液转入上述反应管中，再加入0.5mln，n-二异丙基乙胺，室温条件下反应60min，使氨基酸充分固定在树脂上，反应完成后抽干液体，剩余物料用n，n二甲基甲酰和甲醇交替洗涤3次；然后加入1ml哌啶，反应10min排出液体，之后再加入1ml哌啶，反应10min，排出液体，剩余物料用n，n二甲基甲酰和甲醇交替洗涤3次；之后取少许树脂置于0.05ml由茚三酮、氰化钾和苯酚按1：1：1的体积比组成的混合溶液中，加热至沸腾观察树脂是否变色，如果变为红色，则表示氨基酸已偶联至树脂上，否则需要重新连接；

3)取氨基酸fomc-lys(boc)-oh(nls多肽氨基酸序列中的倒数第二个氨基酸)三倍(3×0.1mmol)和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐三倍(3×0.1mmol)，用1mln，n二甲基甲酰胺溶解，所得溶液转入上述反应管中，再加入0.5mln，n-二异丙基乙胺，室温条件下反应40min，使fomc-lys(boc)-oh连接到上一个氨基酸上，反应完成后抽干液体，剩余物料用n，n二甲基甲酰胺和甲醇交替洗涤3次；然后加入1ml哌啶，反应10min排出液体，之后再加入1ml哌啶，反应10min，排出液体，剩余物料用n，n二甲基甲酰和甲醇交替洗涤3次；之后取少许树脂0.05ml由茚三酮、氰化钾和苯酚按1：1：1的体积比组成的混合溶液中，加热至沸腾观察树脂是否变色，如果变为红色，则表示第二个氨基酸已完全同上一个氨基酸偶联，否则需要重新连接；

4)重复上述步骤3)分别缩合nls多肽氨基酸序列中的其它氨基酸以及基因融合肽kala氨基酸序列中的各氨基酸，每一次缩合之后都要进行保护基的脱除操作以及是否成功偶联的检测操作(除p、d、s和n的氨基检测呈红色，其它的氨基酸残基的氨基检测均呈蓝色)，在完成最后一个色胺酸w的缩合后，得到连接有基因融合肽kala的树脂；

5)取连接有基因融合肽kala的树脂和十八烷酸用1mln，n二甲基甲酰胺溶解，然后加入1mln，n-二异丙基乙胺，室温条件下反应60min，反应完成后用n，n二甲基甲酰胺和甲醇交替洗涤3次，得到连接有基因融合肽kala和十八烷酸的树脂；

6)将所得连接有基因融合肽kala和十八烷酸的树脂置于裂解液中裂解反应120min，过滤，收集滤液，向其中加入2ml乙醚，有沉淀生成，离心，收集沉淀，用乙醚洗涤3次，常温下挥干，得到多肽自组装纳米载体nls-kala-sa粗品200mg；其中，所述裂解液按重量百分比计由下述组分组成：三氟乙酸94.5％、1,2-乙二硫醇2.5％、三异丙基硅烷1％和余量的水；

7)先准备流动相：a液：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；b液：0.1％三氟乙酸的水溶液；

然后将200mg多肽自组装纳米载体nls-kala-sa粗品用由33％(体积)的a液和67％(体积)的b液组成的流动相溶解至20ml，过滤，收集滤液，得到样品；

之后用a液平衡c18色谱柱10min，将样品溶液上样，洗脱条件为：0-40min内，a液：b液＝33-53％(体积)：67-47％(体积)，收集各主峰，所得色谱图如图2所示，将收集的各主峰进行质谱分析，发现保留时间为30.459min的峰为目标物；

8)将含目标物的溶液结冰后上冷冻干燥机冻干，24h后取出冻干样品，取微量粉末溶解后用高效液相色谱进行纯度分析，所得高效液相色谱纯度分析图如图3所示，其显示纯度达到达到95％以上；同时进行质谱复检，质谱分析图如图4所示，结果显示无误。

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<110>桂林医学院

<120>一种多肽自组装纳米载体及其制备方法

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