含有丹酚酸盐的组合物及其应用的制作方法

本发明涉及药物研发领域，具体涉及丹酚酸类化合物的二甲双胍盐及其制备方法和用途。

背景技术：

糖尿病是当前威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病之一，根据国际糖尿病联盟(IDF)2015年统计，世界范围内共有4.15亿成年人患有糖尿病，其中中国糖尿病人数最多，为1.1亿，居全球首位，因糖尿病死亡的人数约占全因死亡人数的14.5％，其中46.6％的患者年龄不足60岁，糖尿病及其并发症是导致患者过早死亡的主要原因。

糖尿病肾病DN(diabetic nephropathy)和糖尿病神经病变(diabetic neuropathy)是糖尿病中最常见的两个慢性并发症，研究发现，通过降低血糖可以减轻或延缓糖尿病慢性并发症，但不能从根本上控制糖尿病并发症的发生和发展。

目前，二甲双胍被推荐作为2型糖尿病控制血糖的一线用药，首选用于单纯饮食控制或体育锻炼无效的2型糖尿病，尤其适用于肥胖患者，也与胰岛素联合用于1型和2型糖尿病。其主要药理作用是通过减少肝糖输出和改善外周胰岛素抵抗而降低血糖，但是临床上使用的二甲双胍盐酸盐由于水溶性强，胃肠道吸收差，会产生一些如腹泻、呕吐等胃肠道的不良反应。

丹酚酸是丹参水溶液中的酚酸类化合物，目前对从中分离纯化出的单体丹酚酸A和丹酚酸B研究较多，药理研究显示，丹酚酸A或丹酚酸B均对糖尿病动物的受损神经和肾具有明显的保护作用。专利CN101347422公开了丹酚酸A能够降低动物血糖，促进细胞葡萄糖吸收，以及降低血脂，降低哺乳动物体重，促进伤口愈合和代谢功能。说明丹酚酸A能可用于防治糖尿病高血糖症，糖尿病心血管并发症，糖尿病肾病，糖尿病末梢神经病变；CN102961372公开了丹酚酸B具有抑制胰岛淀粉样多肽聚集和治疗糖尿病中作用；CN101095720公开了丹参总酚酸的制备方法，以及丹参总酚酸在防治糖尿病肾病方面的应用。

但丹酚酸A和丹酚酸B的化学稳定性都很差，容易吸水变质，pH值、光照和温度也容易让其降解，因此限制了其的临床应用。

技术实现要素：

为克服现有技术存在的上述缺陷，本发明将丹酚酸A或丹酚酸B与二甲双胍成盐，成盐后的丹酚酸A或丹酚酸B一方面稳定性得到显著提高，另一方面药效活性也得到了显著增强。

本发明首次公开了具有下列通式结构的复盐：

X·(Y)_n

其中X为丹参中的酚酸类化合物，其在复盐中以阴离子的形式存在，具体而言，X可为丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸或迷迭香酸，优选丹酚酸A或丹酚酸B；Y为二甲双胍，其在复盐中以阳离子的形式存在，X和Y以离子键结合，n代表Y的个数，n＝1/2、1或2。

本发明还提供了上述复盐的制备方法，该方法包括以下步骤：

第一步：将盐酸二甲双胍和强碱性物质分别溶解到醇类有机溶剂中，搅拌后过滤；

第二步：将游离的X酸溶解到醇类有机溶剂中，再加入弱酸搅拌；

第三步：将第一步所得溶液加入第二步所得溶液中，析出固体即为X·(Y)n。

其中所述强碱选自氨基化合物、胍类化合物、季铵碱类化合物、醇钠、醇钾、氢氧化钾或氢氧化钠，优选氢氧化钾；所述弱酸优选乙酸，所述醇类有机溶剂可为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等，优选乙醇；上述方法中，盐酸二甲双胍与游离X酸的摩尔比为(1-2)∶1。

当游离的X酸为丹酚酸A时，所述复盐的制备方法还可以包括以下步骤：

第一步：将盐酸二甲双胍和强碱分别溶解到醇类溶剂中，搅拌后过滤；

第二步：将丹酚酸A溶解到有机溶剂中；

第三步：将第一步所得溶液加入第二步所得溶液中，析出固体即为X·(Y)n。

上述制备方法中，所述强碱选自氨基化合物、胍类化合物、季铵碱类化合物、醇钠、醇钾、氢氧化钾或氢氧化钠，优选氢氧化钾或氢氧化钠，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、石油醚或乙腈；盐酸二甲双胍与丹酚酸A的摩尔比为1∶1。

本发明还提供了包含上述复盐和可药用载体的药物组合物，上述复盐具体包括丹酚酸A的二甲双胍盐、丹酚酸B的二甲双胍盐、丹酚酸C的二甲双胍盐、紫草酸的二甲双胍盐或迷迭香酸的二甲双胍盐中的一种或多种，药物组合物丹酚酸A的二甲双胍盐和丹酚酸B的二甲双胍盐的摩尔比例为1∶1、1∶2或2∶1，优选2∶1。

上述药物组合物，复盐成分除了含有50～99质量％的丹酚酸A的二甲双胍盐和20～99质量％的丹酚酸B的二甲双胍盐，还可以含有0.1～5质量％的丹酚酸C的二甲双胍盐、1～5质量％的紫草酸的二甲双胍盐、1～5质量％的迷迭香酸的二甲双胍盐。

本发明所提供的复盐或药物组合物可用于制备防治糖尿病或糖尿病并发症药物，其中糖尿病并发症选自肾病、神经病变、视网膜病变、白内障、心肌病和心脏组织缺血，优选糖尿病肾病或糖尿病周围神经病变。

本发明还提供了第二组药物组合物，其包含(1)丹参中的酚酸类化合物或其可药用盐，(2)二甲双胍或其可药用盐、抗氧化剂、赋形剂。其中所述的酚酸类化合物为丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、紫草酸和迷迭香酸中的一种或多种，所述的酚酸类化合物的可药用盐为酚酸类化合物的金属盐或氨基酸盐，优选镁盐、赖氨酸盐、组氨酸盐或精氨酸盐，所述的二甲双胍的可药用盐具体为二甲双胍盐酸盐。该药物组合物中所述的酚酸类化合物包括50％～99％的丹酚酸A、40％～90％的丹酚酸B、0.1％～5％的丹酚酸C、1％～5％的紫草酸、1％～5％的迷迭香酸，其中丹酚酸A和丹酚酸B的摩尔比例为(1-2)∶1。

本发明所公开的第二组药物组合物中酚酸类化合物和二甲双胍的摩尔比例为1∶5、1∶10、1∶15或1∶20。

本发明所公开药物组合物的给药途径可为口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等方式给药。

给药剂型可以是液体制剂如溶液剂、胶体溶液、乳剂、混悬剂、注射剂、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂等；固体剂型如普通片剂、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片、胶囊剂如硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气雾剂、喷雾剂等；还可以是半固体剂型如软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明药物组合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

若将本发明药物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂；稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

若将本发明药物制成胶囊剂，可以将本发明有效成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中；或是将本发明有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明药物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明药物的胶囊剂。

若将本发明药物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

本发明药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为50-2500mg或100-2000mg，优选剂量为140mg、180mg、220mg、260mg、300mg、340mg、380mg、420mg、460mg、500mg、540mg、580mg、620mg、650mg、680mg、720mg、750mg、800mg、820mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1200mg、1500mg。

附图说明

图1：实施例2方法二所制备产物的1H-NMR图谱。

图2：实施例2方法三所制备产物的1H-NMR图谱。

图3：实施例2方法四所制备产物的1H-NMR图谱。

图4：实施例2方法五所制备产物的1H-NMR图谱。

图5：实施例2方法六所制备产物的1H-NMR图谱。

图6：实施例3方法一所制备产物的1H-NMR图谱。

图7：实施例3方法二所制备产物的1H-NMR图谱。

图8：大鼠灌胃丹酚酸B的二甲双胍盐后体内的血药浓度变化。

具体实施方式

实施例1：丹参酚酸化合物的制备

1、丹酚酸A的制备

取丹参粗粉100g，加8倍量水，在80℃温浸3次，每次1小时，滤过，合并滤液，4000转/分钟离心10分钟，取上清液过1400大孔吸附树脂柱，先用水洗至糖检测反应为阴性后，再改用20％乙醇洗脱至FeCl₃反应为阴性，再改为40％乙醇洗脱至FeCl3反应为阴性，收集洗脱液，60℃条件下，减压浓缩至无醇味，加盐酸调节pH值至3～5，用药液1.5倍量体积的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯相，乙酸乙酯萃取液减压浓缩至浸膏状，60℃真空干燥6小时，得淡黄色粉末，即为丹酚酸A。

2、丹酚酸B的制备

取丹参药材，乙醇提取，过滤，滤液合并，浓缩，离心，取上清液过HPD-400A大孔吸附树脂柱，水洗弃去，20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至乙醇至尽，离心，取上清液过聚酰胺吸附树脂柱，水洗弃去，40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，65％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至乙醇至尽，浓缩液调节pH值3，用有机溶剂乙酸乙酯萃取，真空干燥，即得丹酚酸B。

实施例2：丹酚酸B的二甲双胍盐的制备

方法一：盐酸二甲双胍(17mg，0.1mmol)溶解在0.2毫升的水中将其滴加到丹酚酸B(72mg，0.1mmol)的0.3毫升的水溶液，有大量的固体产生，再加入碳酸氢钠(8.4mmol，0.1mmol)有大量的气泡产生，继续搅拌5分钟，再加1毫升的乙醇，反应液变清澈，再加入丙酮，有少量的固体析出，量很少。

方法二：盐酸二甲双胍(17mg，0.1mmol)和碳酸氢钠(8.4mg，0.1mmol)溶解在0.2毫升的水中将其滴加到丹酚酸B(72mg，0.1mmol)的0.3毫升的水溶液中，有固体和气泡产生，继续搅拌5分钟，倒出液相，剩余棕色油状物拉干得到棕色固体，送¹H-NMR检测，图谱显示纯度不高(见附图1)。

方法一和方法二制备所得到的丹酚酸B的二甲双胍盐的固体形态均不好，上述成盐方法中，产物量较少，核磁检测纯度也一般，碳酸氢钠和盐酸反应生成的氯化钠也不容易除去。

方法三：盐酸二甲双胍(256mg，1.5mmol)和氢氧化钾(83mg，1.5mmol)加入到10毫升的乙醇中，50℃搅拌2小时，再室温搅拌1小时，过滤，滤液滴加到丹酚酸B(1.08g，1.5mmol)的25毫升的乙醇溶液中，有固体析出直接旋干，得亮黄色固体1.3g，送1H-NMR，图谱显示纯度不高，且含有大量的乙醇，部分丹酚酸B不能成盐(见附图2)。

方法四：盐酸二甲双胍(68mg，0.4mmol)和氢氧化钾(22.4mg，0.4mmol)加入到5毫升的乙醇中，室温搅拌3小时，过滤，滤液滴加到丹酚酸B(142mg，0.2mmol)的3毫升的乙醇溶液中，有固体析出，继续搅拌10分钟，有大量的固体析出，倒出上层清液，固体拉干，得浅棕色固体送1H-NMR，图谱显示固体的纯度较差，产物含有乙醇(见附图3)。

方法五：丹酚酸B(141mg，0.2mmol)溶解在乙醇2毫升中，将二甲双胍(51.6mg，0.4mmol)加入到上述混合物中，有大量的固体析出，搅拌5分钟，再加入乙酸乙酯又有固体析出，静置，倒出液相，固体抽干送1H-NMR，图谱显示固体的纯度较差(见附图4)。

方法六：将盐酸二甲双胍(512mg，3.0mmol)和氢氧化钾(168mg，3.0mmol)分别加入到25毫升的乙醇中，50℃搅拌2小时，再冷却到室温，过滤，滤液备用。将丹酚酸B(1.08g，1.5mmol)溶解到20毫升的乙醇中，再加入冰乙酸(360mg，6mmol)室温搅拌下将上述备用滤液滴加到上述混合物中，有大量的固体析出，静置，倒出上层清液，固体抽干，得到浅棕色固体1.0g，所制得产物纯度较纯，核磁图谱见附图5，¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：10.56～8.00(m，9H)，7.16～7.10(m，5H)，6.99(s，5H)，6.79～6.69(m，4H)，6.59～6.37(m，5H)，6.19～6.14(m，2H)，5.82(d，J＝5.2Hz，1H)，4.86～4.82(m，2H)，4.18(d，J＝5.2Hz，1H)，3.04～2.84(m，13H)，2.79～2.73(m，1H)，2.60～2.52(m，1H).

实施例3：丹酚酸A的二甲双胍盐的制备

方法一：盐酸二甲双胍(165.6mg，1mmol)和氢氧化钾(56mg，1mmol)加入到5毫升的乙醇中，40℃搅拌4小时，过滤，丹酚酸A(494mg，1mmol)溶解在乙醇5毫升中，再加入乙酸(120mg，2mmol)将滤液加入到上述混合物中，加毕，再加入乙酸乙酯(100毫升)有大量的固体析出，搅拌10分钟，静置，倒出液相，固体抽干，得到亮黄色固体，送1H-NMR检测，图谱显示上述盐得纯度较好(见附图6)。

方法二：盐酸二甲双胍(87mg，0.5mmol)和氢氧化钾(28mg，0.5mmol)加入到2.5毫升的乙醇中，50℃搅拌2小时，过滤，滤液备用；丹酚酸A(247mg，0.5mmol)溶解在乙酸乙酯(25毫升)中，将滤液加入到上述混合物中，有大量的固体析出，搅拌10分钟，静置，倒出液相，固体抽干，得到亮黄色固体，送1H-NMR，核磁图谱显示(见附图7)，所得盐纯度很好，盐中含有乙酸乙酯。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：7.82(d，J＝15.6Hz，1H)，7.23～6.90(m，8H)，6.78～6.68(m，3H)，6.65～6.52(m，3H)，6.44(d，J＝8.8Hz，1H)，6.21(d，J＝16Hz，1H)，4.87～4.83(m，1H)，3.02～2.97(m，1H)，2.91(s，6H)，2.73～2.66(m，1H).

实施例4：丹酚酸二甲双胍盐的稳定性研究

分别将实施例2所制备的丹酚酸B二甲双胍盐及丹酚酸B室温避光保持，从新制，放置3天，放置7天，放置14天，分别取样送LC-MS，比较分析样品纯度的变化，LC-MS检测结果显示，随着时间延长，丹酚酸B复盐样品中丹酚酸B含量变化不明显，而游离的丹酚酸B样品中丹酚酸B含量降低较多，以上研究表明丹酚酸制备成二甲双胍盐后，稳定性得到改善。

实施例5：本发明化合物对STZ诱导糖尿病大鼠血糖、肾功能和神经病变的影响

5.1本发明化合物对糖尿病大鼠血糖水平的影响.

46只SD大鼠适应性喂养1周后，从中随机抽取6只作为正常对照组，其余作为糖尿病组。正常对照组喂养标准大鼠饲料，糖尿病组喂养高糖高脂饲料。喂养3周后糖尿病组大鼠空腹24小时后腹腔注射链霉佐菌素40mg/kg(用pH4.4的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液配成0.75％的浓度)，正常对照组仅注射柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液。共注射3次，每次间隔1周。

将糖尿病大鼠，随机分为5组，每组8只，分别为糖尿病模型组、二甲双胍组(100mg/kg)、丹酚酸B组(120mg/kg)、丹酚酸B二甲双胍复盐组(120mg/kg，实施例2终产物)、丹酚酸A二甲双胍复盐组(120mg/kg，实施例3终产物)，各组药物溶于含1％的CMC-Na的蒸馏水中灌胃，每日一次，连续给药4周后，对大鼠进行断尾取血，4000rpm离心10min，分离血清，按照血糖测定试剂盒中的说明测定大鼠血糖水平。

实验结果由表一可看出，丹酚酸A的二甲双胍盐及丹酚酸B的二甲双胍盐的降糖效果明显，结果具有统计学差异，与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

表一：化合物对糖尿病大鼠的降糖作用的影响

5.2本发明化合物对糖尿病大鼠周围神经病变的影响

(1)检测给药后糖尿病大鼠足底痛域感觉的变化

糖尿病大鼠造模、分组及给药方法参见5.1；给药第55天，将大鼠足底部一固定部位置于光电痛域检测器检测孔处，固定刺激强度，给予热刺激，观察大鼠足部移开的时间。

实验结果如表二，丹酚酸A的二甲双胍盐以及丹酚酸B的二甲双胍盐可提高糖尿病大鼠的痛觉灵敏性，对糖尿病大鼠的痛觉神经功能具有改善作用。

表二：化合物对糖尿病大鼠足底痛域感觉的影响

与模型组比较，*p＜0.05

(2)检测给药后糖尿病大鼠坐骨神经-肌肉传导速度的变化

糖尿病大鼠造模、分组及给药方法参见5.1，糖尿病大鼠给药第70天时，各组动物乌拉坦腹腔麻醉，俯卧固定，刺激电极为双针电极，电击棒用75％酒精消毒后，插入大鼠坐骨神经窝处坐骨神经干附近，记录电极同样用75％酒精消毒后插入大鼠腓肠肌肌腹，两电极相距约30毫米。

设备采用BL-420E型生物机能实验系统，刺激信号选择1毫伏，0.015毫秒，扫描速度为0.01秒，10kHz滤波，诱导信号放大50倍，根据实验所得参数计算神经肌肉动作电位潜伏期，传导速度计算公式为：MNCV＝刺激电极到记录电极的距离(m)/潜伏期(ms)。

实验结构见表三，丹酚酸A的二甲双胍盐以及丹酚酸B的二甲双胍盐可提高糖尿病大鼠的坐骨神经-肌肉传导速度，对糖尿病大鼠的神经传导功能具有改善作用。

表三：化合物对糖尿病大鼠神经传导功能的影响

与模型组比较，*p＜0.05

5.3本发明化合物对糖尿病大鼠肾功能的影响

(1)检测给药后糖尿病大鼠尿液中NAG/肌酐变化

糖尿病大鼠造模、分组及给药方法参见5.1，糖尿病大鼠给药第80天时，收集各组糖尿病大鼠尿液，用购自南京建成生物技术研究所的NAG、肌酐测试试剂盒检测糖尿病大鼠尿液中NAG/肌酐水平。

结果见表四，与模型组相比，丹酚酸A的二甲双胍盐以及丹酚酸B的二甲双胍盐均能降低糖尿病大鼠尿液中的NAG水平，具有统计学意义。

(2)检测给药后糖尿病大鼠血清中肌酐、尿素氮含量的变化

糖尿病大鼠造模、分组及给药方法参见5.1，糖尿病大鼠给药第80天时，摘眼球取血，血液样本收集后，2000r/min离心10min，收集上清，用购自南京建成生物技术研究所的肌酐、尿素氮试剂盒，测定糖尿病大鼠血清中的肌酐，尿素氮。

结果见表四，丹酚酸A的二甲双胍盐以及丹酚酸B的二甲双胍盐均可降低糖尿病大鼠血肌酐或血尿素氮水平，提示丹酚酸A的二甲双胍盐以及丹酚酸B的二甲双胍盐对糖尿病肾病具有改善作用。

表四：化合物对糖尿病大鼠的肾功能的影响

与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01

实施例6：丹酚酸B的二甲双胍盐的药代动力学

取12只大鼠分为两组，分为丹酚酸B(10mg/kg)组、丹酚酸B的二甲双胍盐(100mg/kg)组给药，各组大鼠口服灌胃给药，给药后分别于0、0.5、1、2、4、8、12、24、30小时眼眶取血约0.5毫升，取血后，样本经2000r/min离心10分钟，取上清-20℃保存，测定血药浓度，并绘制相应的药-时曲线。

从药-时曲线(图8)中可以发现，丹酚酸B的二甲双胍盐与单独使用丹酚酸B相比，在血浆中的吸收和消除半衰期明显延长，提高了生物利用度。