一种半滑舌鳎抗病免疫相关基因及其应用的制作方法

本发明属于水产遗传育种技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎抗病免疫相关基因及其在抗病力评价中的应用。

背景技术：

半滑舌鳎主要分布在我国沿海地区，是我国重要的海水经济养殖鱼类，由于肉质鲜美，营养价值高而深受人们喜爱。近年来，我国半滑舌鳎养殖业迅猛发展，养殖规模不断扩大，养殖产量也逐年增加，已经成为我国主导水产养殖品种之一。但是伴随着半滑舌鳎养殖业的快速发展，越来越多的问题也开始暴露出来，其中最严重的就是高密度养殖带来了病害的频繁爆发，造成了严重的经济损失，尤其是哈维氏弧菌所引起的肠道和鳃的溃烂最为严重。药物虽然短时间内可以在一定程度上防治病害，但也会带来一些弊端，例如长期频繁使用抗生素及其它一些化学药物会引起病原微生物产生耐药性，药物在鱼类体内残留及对水环境造成污染等，对人类的生存环境和健康将会产生潜在的威胁。因此，探讨半滑舌鳎抗病免疫的分子机制，寻求抗病相关分子标记，进而开展抗病分子育种研究就显得非常迫切。

近年来在硬骨鱼类抗病免疫研究中发现了两个与哺乳类不同的新的免疫球蛋白(ig)：igz和igt，依据重链(h)恒定区结构的不同而分别命名。igz是在斑马鱼中首次发现的一种不同于igm和igd的新型免疫球蛋白。几乎同时，igt在虹鳟中被发现，并证明igt是一种免疫抗体，特别是在鱼类肠道粘膜抗感染免疫中起重要作用，并且推断igt很有可能与哺乳动物的iga相似，在肠道粘膜免疫中发挥主导作用。

抗病性状是鱼类的重要经济性状，但鱼类生活在水中，难以对其抗病力进行评价，迄今也少有鱼类抗病相关基因标记的报道。因此鱼类抗病力评价，特别是无损伤抗病力评价是困扰鱼类遗传育种科技工作者的一个难题。如果能够找到一个抗病相关基因标记并用于鱼类抗病力的无损伤评价，这将极大推动鱼类抗病良种的选育进程，加快抗病良种的培育。鱼类体表皮肤粘液是鱼类免疫防御的第一道防线，在鱼类抵抗外源病原微生物侵染中发挥着重要作用。尽管在鱼类皮肤黏液中检测到一些免疫球蛋白和酶类等活性物质的存在，但有关鱼类皮肤粘液与鱼体抗病力的关系的研究迄今尚未见报道。如果能从鱼类皮肤黏液中找到一种能够代表鱼类抗病力的基因标记，则有可能建立一种通过检测黏液中基因标记物的水平评价其抗病力的无损伤检测技术，这在鱼类抗病育种中将具有重大应用价值和广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种半滑舌鳎抗病免疫基因及其作为无损伤抗病力评价标记的应用方法，为鱼类抗病机理研究和抗病良种选育提供基因序列和抗病选育的基因标记。

本发明首先提供一种从半滑舌鳎中筛选的抗病免疫基因蛋白，其氨基酸序列为seqidno:1；

编码上述抗病免疫基因的蛋白，其一种核苷酸序列为seqidno:2；

本发明另一个方面提供上述抗病免疫基因在半滑舌鳎抗病力检测中的应用方法；

本发明再一个方面提供一种检测上述抗病免疫基因的方法，是检测上述基因在半滑舌鳎皮肤粘液中表达的方法；

所述的方法包括皮肤粘液中rna的提取方法；是收集待检测的半滑舌鳎鱼皮肤粘液，过滤后再向纯净的粘液中加入rna保存液，摇使粘液和rna保存液充分混匀，在提取rna时，先离心将粘液与rna保存液分离开，将粘液放入加入了trizol试剂的无酶离心管中进行研磨，再加入trizol试剂静放使核蛋白复合物完全解离；然后放到4℃离心机12000rpm离心，弃沉淀；上清液加入l氯仿，剧烈摇动使之充分混匀，4℃下12000rpm离心；吸取上清液，按照每1mltrizol加入500μl的异丙醇充分混匀后，‐20℃放置1～2h以充分沉淀rna；沉淀结束后，4℃下12000rpm离心；倒掉上清液后收集rna沉淀，用75％的乙醇洗涤，4℃下12000rpm离心去除乙醇，再加入rnase‐free的超纯水将rna沉淀充分溶解；

所述的方法使用的检测引物，其一种序列信息如下：

igt‐rt‐f：5’‐tactacatcacttggtctgaacacg‐3’(seqidno:3)

igt‐rt‐r：5’‐gcttttgacactccatccattac‐3’(seqidno:4).

本发明还提供上述抗病免疫基因表达的检测引物及其在皮肤粘液中表达的检测方法；

本发明所筛选的基因用于抗病性半滑舌鳎的筛选中，是通过检测鱼体皮肤粘液中igt的表达水平，igt的表达水平越高，其抗病能力越强。

本发明首次克隆了半滑舌鳎igt基因，获得了其cdna序列，设计了其表达检测的pcr引物，建立了皮肤粘液rna提取以及粘液中igt基因表达的检测方法以及将皮肤粘液中igt基因的表达水平作为抗病力评价指标的应用方法，从而创建了半滑舌鳎抗病力无损伤检测的分子方法，可以应用于亲鱼抗病力测试及抗病良种选育。本发明的技术方法也可在其它鱼类上进行推广应用。

附图说明

图1：半滑舌鳎igtcdna全长序列和开放阅读框编辑的基酸序列；

图2：半滑舌鳎不同组织中igt的表达量。横坐标表示半滑舌鳎中不同的组织，纵坐标表示igt的表达量；其中组织的英文缩写：l:肝脏；sp:脾脏；k:肾脏；i:肠；gi:鳃；sk:皮肤；m:肌肉；h:心脏；hk:头肾，bl:血液，h:小时‐。下同。

图3‐1：半滑舌鳎的肝脏在感染后不同时间点的igt表达量的变化。横坐标表示感染后不同时间点，纵坐标表示igt在半滑舌鳎肝脏中的表达量；

图3‐2：半滑舌鳎的肾脏在感染后不同时间点的igt表达量的变化。横坐标表示感染的不同时间点，纵坐标表示igt在半滑舌鳎肾脏中的表达量；

图3‐3：半滑舌鳎的脾脏在感染后不同时间点的igt表达量的变化。横坐标表示感染后不同时间点，纵坐标表示igt在半滑舌鳎脾脏中的表达量；

图3‐4：半滑舌鳎的肠在感染后不同时间点的igt表达量的变化。横坐标表示感染后不同时间点，纵坐标表示igt在半滑舌鳎肠中的表达量；

图3‐5：半滑舌鳎的鳃在感染后不同时间点的igt表达量的变化。横坐标表示感染的不同时间点，纵坐标表示igt在半滑舌鳎鳃中的表达量；

图3‐6：半滑舌鳎的皮肤在感染后不同时间点的igt表达量的变化。横坐标表示感染的不同时间点，纵坐标表示igt在半滑舌鳎的皮肤中的表达量；

图4：2014年半滑舌鳎的抗病家系和易感家系的igt表达量的差异性。横坐标表示半滑舌鳎不同的组织，纵坐标表示igt在不同组织的表达量，lr(lowresistance)表示易感家系，用灰色柱形表示，hr(highresistance)表示抗病家系，用条纹柱形表示；gi:鳃；l:肝脏；sp:脾脏；k:肾脏；i:肠。

图5：2017年半滑舌鳎的抗病家系和易感家系的igt表达量的差异性。横坐标表示半滑舌鳎不同的组织，纵坐标表示igt在不同组织的表达量，lr(lowresistance)表示易感家系，用灰色柱形表示，hr(highresistance)表示抗病家系，用条纹柱形表示；gi:鳃；sp:脾脏；i:肠。

图6‐1：2017年半滑舌鳎抗病家系和易感家系鱼的粘液中igt表达量的比较。横坐标表示半滑舌鳎的粘液，纵坐标表示igt在粘液中的表达量，lr(lowresistance)表示易感家系，用灰色柱形表示，hr(highresistance)表示抗病家系，用条纹柱形表示；

图6‐2：2016年半滑舌鳎抗病家系和易感家系鱼的粘液中igt表达量的比较。横坐标表示半滑舌鳎的粘液，纵坐标表示igt在粘液中的表达量，lr(lowresistance)表示易感家系，用灰色柱形表示，hr(highresistance)表示抗病家系，用条纹柱形表示。

具体实施方式

本发明首先通过半滑舌鳎免疫相关组织(脾脏等)转录组测序和生物信息学分析发现了半滑舌鳎igt基因的部分mrna序列，随后通过与半滑舌鳎基因组序列的比对和race扩增，获得了半滑舌鳎免疫球蛋白igt基因的全长cdna序列，并研究了该基因的表达模式，揭示了其表达量与半滑舌鳎抗病力之间的关系。率先发现半滑舌鳎体表粘液中存在igt基因的表达，并且igt基因的表达水平与抗病力之间存在正相关关系，从而建立了将igt基因的表达水平作为评价鱼体抗病力的一个指标，为鱼类抗病育种提供了一个新的技术途径。

下面以半滑舌鳎igt基因的克隆、不同组织的表达模式及其在抗病家系和不抗病家系中的表达检测为例，结合附图，对本发明的实施方式进行详细说明。

实施例1：半滑舌鳎igt基因全长cdna的克隆及其序列分析

1、全长cdna序列的克隆：申请人陈松林等通过半滑舌鳎抗病家系免疫组织(脾脏等)转录组测序和生物信息学分析发现了半滑舌鳎igt基因的部分mrna序列，片段的长度为645bp，随后通过与他们测序获得的半滑舌鳎基因组序列的比对和race扩增，获得了半滑舌鳎免疫球蛋白igt基因的全长cdna序列。用于race扩增的4条race引物序列为：

igt‐gsp‐5：5’‐gtgctgtttttgatgtgctgtccgtct‐3’；

igt‐ngsp‐5：5’‐acatcggcagagacaggttg‐3’；

igt‐gsp‐3：5’‐atcacttggtctgaacacgacggcac‐3’；

igt‐ngsp‐3：5’‐gaagacaaagcagggctacttg‐3’。

2、序列的拼接和比对分析：用dnastar中的editseq处理以去除引物和载体序列；使用seqman将得到的序列和已知序列拼接，得到全长cdna序列(图1)；用editseq寻找并翻译开放阅读框(orf)；用blastn和blastx程序计算我们获得的cdna克隆片段与genbank序列数据库中已存的dna序列的同源性。该基因的cdna全长为1655个碱基(seqidno:2)，包括21个碱基的5’非编译区，1494个碱基的开放阅读框和140个碱基的3’非编译区。该基因的开放阅读框编码一个497个氨基酸的蛋白(seqidno:1)，理论蛋白分子量为55.27kd，理论等电点约为5.336(图1)。

通过比对，该基因与已报道的虹鳟的igt基因遗传相似性为40％，因此命名为半滑舌鳎igt基因。

实施例2：半滑舌鳎igt基因在正常鱼及哈维氏弧菌感染后的鱼的免疫组织中的表达模式分析

采用实时定量pcr方法检测igt基因在正常半滑舌鳎鱼的肌肉、心脏、肠、肾脏、头肾、肝脏、脾脏、鳃、皮肤和血液中的表达水平，研究了该基因在不同组织的表达模式；用实时定量pcr的方法检测了在感染哈维氏弧菌前后，其肝脏、肾脏、脾脏、肠、鳃和皮肤6个免疫相关组织中igt基因的表达水平，分析了该基因与半滑舌鳎免疫应答的关系。

1、首先取正常半滑舌鳎鱼的10个组织，分别为肌肉、心脏、肠、肾脏、头肾、肝脏、脾脏、鳃、皮肤和血液，立即放入装有1ml的离心管中。用trizol法提取这些组织的总rna，用takara反转录试剂盒反转录为cdna。根据igt基因序列设计基因特异引物(igt‐rt‐f：5’‐tactacatcacttggtctgaacacg‐3’和igt‐rt‐r：5’‐gcttttgacactccatccattac‐3’)，用实时定量pcr的方法检测igt基因在上述10个组织中的相对表达量。反应条件为：先95℃30s变性；然后95℃5s，60℃34s,40个循环。结果显示：除了在肌肉中igt的表达量极少之外，igt基因在半滑舌鳎中各个组织均有表达，其中在鳃、肠、脾脏和肾脏中表达量较高，且在鳃中igt的表达量最高(图2)。

2、对实验组的半滑舌鳎进行腹腔注射哈维氏弧菌，在注射后0h，12h，24h，48h，72h，96h的六个时间点，分别取肝脏、肾脏、脾脏、肠、鳃和皮肤6个组织。用实时定量pcr的方法检测igt基因在上述6个组织中的表达量。所用引物、试剂和实验方法均同上一步介绍。结果显示：在注射哈维氏弧菌后各组织的igt表达水平均上调，其中在感染后12h，肝脏和皮肤中的igt基因表达量达到最高；在感染后24h，肾脏中igt基因的表达量达最高；感染后48h时，脾脏和鳃中的igt基因表达量达最高；而肠中igt的表达量从感染后12h到96h一直处于升高状态。但是，在除了肠之外的5个组织中的大体趋势都是igt的表达量先升高，后开始逐渐下降。以上结果表明igt基因参与了半滑舌鳎在病原菌感染后的免疫防御反应(图3)。

实施例3：半滑舌鳎抗病家系和易感家系不同组织中igt基因的表达模式分析

1.半滑舌鳎抗病和易感家系的制作

采用申请人陈松林以前发明的方法建立半滑舌鳎家系(陈松林等，2010)。当半滑舌鳎家系鱼苗生长至8-15cm时，采用腹腔接种方法对各家系鱼苗进行哈维氏弧菌感染。感染实验按照以前建立的方法进行。每个家系随机选取80-150尾鱼苗进行正式感染实验，感染用鱼苗养殖在2-3立方米的玻璃钢水槽中。感染后，每天对各家系鱼苗的状态及死亡数量进行观察记录，在病原菌感染发病后收集濒临死亡或刚刚死亡的实验鱼，记录死亡时间及鱼体全长、体重，体宽等数据，同时采集感染后存活的个体并记录其全长、体重，体宽等数据，在所有家系鱼苗停止死亡后(感染后15-20天)，统计各家系鱼苗的存活鱼苗数，计算存活率。将同一批次感染实验中存活率排在前3名的家系定为抗哈维氏菌病家系(简称抗病家系)，将存活率排在后3名的家系定为哈维氏菌病易感家系(简称易感家系)。

2.抗病家系和易感家系不同组织igt表达水平的测定

采用实时定量pcr方法检测了2014年和2017年半滑舌鳎抗病家系和易感家系中肝脏、肾脏、脾脏、肠和鳃的igt基因的表达水平，分析了该基因表达水平与半滑舌鳎抗病力之间的关系。

1)、2014年半滑舌鳎抗病家系和易感家系鱼不同组织中igt基因表达水平的比较：采取半滑舌鳎抗病家系和易感家系鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠和鳃5个组织。rna提取、pcr所用引物、试剂和实验方法均同上一步介绍。定量pcr结果显示：在抗病家系鱼的脾脏、肠和鳃中的igt基因的表达水平均显著高于易感家系，而肾脏和肝脏中igt的表达水平在抗病家系和易感家系间则没有明显差别(图4)。

2)、2017年半滑舌鳎抗病家系和易感家系鱼不同组织中igt基因表达水平的比较：分别取2017年的半滑舌鳎抗病家系和易感家系各5条鱼的脾脏、肠和鳃等3个组织。rna提取方法、定量pcr所用引物、试剂和实验方法均同上一步介绍。结果显示：在抗病家系鱼的脾脏、肠和鳃中的igt基因的表达量均比易感家系鱼的高(图5)。

实施例4：半滑舌鳎体表皮肤粘液中igt基因表达的检测方法及其与半滑舌鳎抗病力相关性的分析

1.半滑舌鳎抗病家系和易感家系鱼的粘液中igt基因表达的检测方法

1)半滑舌鳎皮肤粘液的收集与总rna的提取方法：用于收集皮肤粘液的半滑舌鳎鱼一般为全长15厘米以上，取皮肤粘液时，首先将半滑舌鳎从水中捞出放在铺有保鲜袋的实验台上，用取样刀的刀背轻轻刮取鱼体表面使粘液集中，再用1ml的注射器吸取粘液，用200目的筛网折叠两层套在注射器头部，将注射器中的粘液通过筛网过滤后注射到1.5ml的无酶离心管中，从而过滤掉粘液中可能夹带的鳞片和皮肤，保证粘液的纯度。过滤后再向纯净的粘液中加入1ml的rna保存液，摇晃，使粘液和rna保存液充分混匀。

采用trizol试剂提取粘液中的总rna，具体步骤为：(1)先用离心机在4℃下12000rpm离心10min，将粘液与rna保存液分离开，将粘液中残留的rna保存液用滤纸吸掉，放入加入了500μltrizol试剂的无酶离心管中；(2)用研磨棒研磨，再加入500μltrizol试剂静放15min，使核蛋白复合物完全解离。放到4℃离心机12000rpm离心5min，弃沉淀；(3)加入0.2ml氯仿，剧烈摇动10min使之充分混匀，4℃下12000rpm离心20min；(4)吸取上清液，按照每1mltrizol加入500μl的异丙醇，充分混匀后，‐20℃放置1～2h以充分沉淀rna；(5)4℃下12000rpm离心10min，小心倒掉上清液；(6)收集rna沉淀，用75％的乙醇洗涤两次，4℃下12000rpm离心10min；(7)尽量吸尽残余的乙醇，打开离心管盖放在已经用紫外光杀毒的超净工作台中放置5min，使残余的乙醇完全发挥，但要注意不要让rna干透；(8)加入适量rnase‐free的超纯水，将rna沉淀充分溶解；(9)用琼脂糖凝胶电泳检测总rna质量，genequantprorna/dna分光光度计测定rna浓度；(10)将提取的rna放在‐80℃保存备用。

2).半滑舌鳎抗病家系和易感家系皮肤粘液中igt基因表达水平的比较

根据上述测定的粘液rna的浓度用takara反转录试剂盒将其反转录为cdna；采用半滑舌鳎igt基因表达检测的特异引物(igt-rt-f：5’-tactacatcacttggtctgaacacg-3’和igt-rt-r：5’-gcttttgacactccatccattac-3’)进行定量pcr检测，pcr方法和参数均同实施例2中的1中介绍的方法。采用这种方法对2017年的半滑舌鳎抗病家系5条鱼和易感家系5条鱼的粘液中的igt表达水平进行了定量分析，结果表明2017年的半滑舌鳎抗病家系鱼的粘液中的igt基因的表达水平明显比易感家系粘液中的表达水平高(图6‐1)。

同时，我们进行了2016年半滑舌鳎抗病家系和易感家系鱼的粘液中igt基因表达的比较分析，取2016年的半滑舌鳎抗病家系5条鱼、易感家系4条鱼的粘液。rna提取方法、定量pcr所用引物、试剂和实验方法均同上一步介绍。同样表明抗病家系鱼的粘液中的igt基因的表达量明显比易感家系粘液中的表达水平高(图6‐2)。通过2017年和2016年的半滑舌鳎抗病家系和易感家系粘液中igt表达水平的检测结果表明粘液中的igt基因的表达水平与抗病力之间存在正相关关系。

2、半滑舌鳎皮肤粘液中igt基因的表达水平作为抗病力评价指标的应用方法

采集半滑舌鳎鱼体表粘液，提取rna，反转录成cdna，采用半滑舌鳎igt基因的特异引物：

igt-rt-f：5’-tactacatcacttggtctgaacacg-3’

igt-rt-r：5’-gcttttgacactccatccattac-3’；

按照常规定量pcr方法进行igt表达水平分析，采用actin作为内参，绘制表达水平图，比较不同半滑舌鳎成鱼或亲鱼体表粘液的igt表达水平，选取igt表达水平高的成鱼进行养殖，或选取igt表达水平高的亲鱼繁殖后代，筛选出抗病免疫能力强的半滑舌鳎个体，或生产出抗病免疫能力提高的鱼苗。本发明的方法首次将皮肤粘液中igt基因的表达水平作为抗病力评价的指标，由此建立了半滑舌鳎抗病力无损伤检测的分子方法，这个方法在半滑舌鳎抗病力测试及抗病良种选育中具有重大应用价值，也可以在其它鱼类抗病育种上进行推广应用。

序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>一种半滑舌鳎抗病免疫相关基因及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>497

<212>prt

<213>半滑舌鳎(cynoglossussemilaevisgunther)

<400>1

metasnsermetlysthrgluaspcysalavaltyrpheglyalaarg

151015

alaasphisleuglytrpleuaspvaltrpglyalaglythrgluval

202530

thrvalglnsergluglnprothralaglnthrleupheprovalmet

354045

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505560

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65707580

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290295300

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355360365

asptyrtyrilethrtrpsergluhisaspglythrglyalaglyasn

370375380

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385390395400

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405410415

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<400>2

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<211>25

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<213>半滑舌鳎(cynoglossussemilaevisgunther)

<400>3

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<210>4

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<212>dna

<213>半滑舌鳎(cynoglossussemilaevisgunther)

<400>4

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