一组鉴定龟甲的特异性引物及其鉴定方法与流程

本发明涉及一组鉴定龟甲的特异性引物及其鉴定方法，属于中药鉴定技术领域。

背景技术：

龟甲(testudiniscarapaxetplastrum)，为龟科动物乌龟(chinemysreevesii)的背甲及腹甲，是一种传统的动物类中药，其始记载于《神农本草经》，被列为上品。历代本草均有记载，现被国家卫生局列为药食两用类中药。龟甲性微寒，味咸甘，归肝、肾、心经，能滋阴潜阳、益肾强骨、养血补心、固经止崩等，主治阴虚潮热、骨蒸盗汗、头晕目眩、虚风内动、筋骨痿软、心虚健忘、崩漏经多等。

龟甲为临床常用中药，其基原乌龟养殖困难且生长期较长，一般最少5～6年方可供药用，导致国内药材资源不足。此外，同名异物、民间用药差异、亲缘物种的纹路、颜色等形态学特征相似以及专业经验的缺乏等因素，常有龟甲伪品和掺伪品混入市场，如巴西龟、花龟，对用药的安全性和有效性均带来不良影响。目前，龟甲的鉴别仍然主要依靠传统的性状鉴别技术，即从外观、色泽、质地、气味等方面来评价，其经验依赖性强、准确性较低。此外，部分产品在经过一系列的加工处理后，难以应用形态学考察等常规方法进行有效鉴别。

由于dna存在于大多数生物组织中且非常稳定，检测用量少，因此可以选择龟甲特有的dna片段作为用于专属性鉴定的识别物。在运用分子标记技术鉴定龟甲的研究中，有研究人员设计一对专用于乌龟的鉴别引物，用于龟甲药材及原动物的鉴定。也有研究人员针对cytb和coi序列，设计2对特异性引物，建立复合pcr技术对龟甲药材进行真伪鉴别；然而，该技术仅可应用于龟甲药材及基原样品，尚无法鉴别饮片及掺伪品，应用范围较为局限。此外，利用基于coi序列的dna条形码技术对乌龟及常见混伪品进行分子鉴定，该方法亦仅用于药材及基原，且荧光干扰、碱基错配、生物进化速率等因素使得种内变异阈值难以确定，检验结果的准确性存疑。此外，还有步骤繁琐、时间和成本高等固有缺陷。

pcr具有特异性好、灵敏度高(指数增加)、重复性好、操作简便、高通量(每台仪器单次可扩增96个样品)等优势；然而，在常规pcr技术利用dna序列进行物种的鉴定过程中，由于采用了coi、its等区域的通用引物，因此在完成扩增后，需要进行产物测序并与基因数据库比对，然后才能判断种属，步骤较多、耗时长、需要专门设备；此外，还无法实现对于掺伪品的检识，或者由于掺伪现象而影响鉴定结果。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的问题，建立较为完善的龟甲鉴定体系，即基原、药材、饮片。

本发明针对龟甲正品以及常见伪品的基原分别设计了特异性引物，并提供了利用特异性引物扩增技术鉴别龟甲的方法。该法无需测序，操作简单、专属性强、耗时短，能准确、直观地鉴别龟甲的真伪(包括掺伪)。本发明为龟甲的专属性鉴定提供一条新的途径，有助于监控龟甲产品的质量，从而有利于保障临床用药的安全性、有效性，具有重要的应用价值。

本发明通过以下步骤达到快速检测龟甲系列产品的目的：

本发明首先提供一组用于鉴定龟甲的特异性引物，所述引物为pcr-1或pcr-2或pcr-3，pcr-1的上下游引物如seq.id.no.1和2所示；pcr-2的上下游引物如seq.id.no.3和4所示；pcr-3的上下游引物如seq.id.no.5和6所示。

进一步的，在上述特异性引物鉴定过程中，若受试样品为完整的龟甲且结果显示为阳性，则判断为正品龟甲，若受试样品经切片或粉碎，为非完整的龟甲(如碎片、粉末)且结果显示为阳性，则需进一步鉴定是否为掺伪品(含巴西龟龟甲或花龟龟甲或两者均有)，上述用于鉴定龟甲的特异性引物组还包括引物pts-1或pts-2、pms-1或pms-2，pts-1的上下游引物如seq.id.no.7和8所示；pts-2的上下游引物如seq.id.no.9和10所示；pms-1的上下游引物如seq.id.no.11和12所示；pms-2的上下游引物如seq.id.no.13和14所示。

所述的引物pcr-1、pcr-2和pcr-3均来自于乌龟(chinemysreevesii)，同样的能用于检测并达到鉴定龟甲的目的；所述的引物pts-1、pts-2均来自于巴西龟(trachemysscripta)，同样的能用于检测并达到鉴定龟甲中是否掺杂有巴西龟甲的目的；引物pms-1或pms-2均来自于花龟(mauremyssinensis)，同样的能用于检测并达到鉴定龟甲中是否掺杂有花龟甲的目的。

具体的如下表所示：

本发明还提供一种特异性鉴定龟甲的试剂盒，所述试剂盒包括上述的特异性引物pcr-1或pcr-2或pcr-3引物对、dna阳性对照、pcr反应体系、电泳检测体系。

进一步的，所述试剂盒还包上述的特异性引物pts-1或pts-2并且和/或包括引物对pms-1或pms-2引物对。

本发明还提供一种通过特异性引物鉴定龟甲的方法，首先制备供试品溶液，然后利用pcr及琼脂糖凝胶电泳技术快速检测目标片段。

其中供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行：

(1)将龟甲产品粉碎，过40目筛，收集细粉，加入适量的sds裂解液和蛋白酶k(料液比为10-200:1mg/ml)，充分混匀，于55℃～65℃孵浴提取1h～6h，离心后取上清液；

(2)加入与上清液等体积的tris平衡酚，充分混合，离心后取上清液，加入与上清液等量的酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)，充分混合，离心后取上清液；

(3)加入与上清液等量的三氯甲烷-异戊醇(24:1)，充分混合，离心后取上清液，再加入上清液体积1/10倍量的5m乙酸钾溶液和上清液体积2倍量的预冷的96％乙醇，充分混合，-20℃冷冻过夜，离心后弃去上清液；

(4)加入预冷的70％乙醇500μl洗涤沉淀，离心后弃去上清液，沉淀物于室温下晾干或冻干，用适量te缓冲液溶解，质量检查，-20℃或4℃下保存，备用。

一种通过特异性引物鉴定龟甲的方法，检测方法按照下述步骤进行：

(1)以制备的供试品溶液dna为模板，配制pcr反应体系；

(2)设定pcr扩增程序，进行pcr扩增；

(3)制备琼脂糖凝胶，将扩增产物进行电泳分析；

(4)电泳结束后通过凝胶成像分析系统进行检测。

其中，步骤(1)中所述的pcr反应体系，以总体积25μl为例，包括：1×pcr缓冲液、2.0mmol/lmgcl2、0.2mmol/ldntps、0.1μmol/l～0.4μmol/l引物对、0.625u～1.0utaqdna聚合酶、模板dna1ng～150ng，加灭菌双蒸水补足至25μl。

步骤(2)中所述的pcr扩增程序为：95℃3min；95℃30s，60℃～68℃10s～30s，72℃1min，循环数30～40；72℃5min～7min。

步骤(3)中所述的电泳检测是指扩增产物采用含荧光染料eb的2％～3％琼脂糖凝胶进行分析后以凝胶成像系统检测，制胶及电泳的缓冲液均为tbe，上样量为3μl～10μl。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明的制备方法以sds裂解液和蛋白酶k为提取溶剂，用恒温混匀仪孵浴，从龟甲产品中提取dna，然后以酚仿抽提法进行纯化，不仅降低了杂质对后续pcr鉴定的干扰，而且该方法操作时间短，成本低，与柱纯化相比，样品的用量及供试品溶液浓度灵活可变，杂质不易堵塞纯化柱以及避免纯化柱引起的吸附损失，使得方法适用范围更广泛。

(2)本发明涉及的引物与公开已知的特异性引物相比，针对龟甲及其常见伪品设计了多对引物，且能在物种水平上进行区分，可以实现掺伪品的鉴定；此外，扩增的目的产物很短(≤120bp)，非常有益于目的片段的扩增，降低模板降解导致扩增假阴性的机率。该特异性引物鉴定龟甲的方法与常用的基于coi基因的dna条形码技术进行鉴定技术相比，适用范围更广，可适用于龟甲基原、药材、饮片及其掺伪品。此外，该方法抗干扰能力强、无需进行测序、便捷经济、高通量，能直观而准确地对龟甲进行鉴定。

本发明中的检测方法可直接、简便、高通量地对龟甲产品进行准确鉴定，无需测序，比基于coi基因的dna条形码研究技术更为直观、经济、快速，且具有适用范围广、抗干扰能力强、可识别掺伪品等特点，为龟甲产品的真伪快速鉴定提供了一种新的方案。

附图说明

图1是鉴定方法流程图。

图2是特异性引物筛选电泳验证结果图，图中a为对pcr-1、pcr-2、pcr-3的验证结果，b为对pts-1、pts-2、pms-1、pms-2的验证结果。

图3是特异性引物优化电泳结果图；图中a为对温度的优化结果；b为对循环数的优化结果。

图4是本发明的特异性引物组的特异性验证电泳结果图。

图5是本发明特异性引物扩增产物的测序结果与目的片段比对图。

图6是本发明特异性引物对自制龟甲掺伪品检测电泳结果图，图中a为引物pcr-2和pts-2对乌龟与巴西龟混合品的检测；b为引物pcr-2和pms-1对乌龟与花龟混合品的检测；c为引物pcr-1和pms-2对乌龟与花龟混合品的检测；d为引物pcr-3和pts-1对乌龟与巴西龟混合品的检测。

图7是本发明特异性引物pcr-2、pts-2、pms-1对不同批次市售龟甲基原样品检测电泳结果。

图8是本发明特异性引物pcr-2(a)、pts-2(b)、pms-1(c)对不同批次市售龟甲药材检测电泳结果。

图9是本发明特异性引物pcr-2(a)、pts-2(b)、pms-1(c)对不同批次市售龟甲饮片检测电泳结果。

图10是本发明特异性引物pcr-1(a)、pcr-3(b)、pts-1(c)及pms-2(d)对不同批次市售龟甲饮片检测电泳结果。

图中，cr为乌龟基原样品、ts为巴西龟基原样品、ms为花龟基原样品、ps为鳖基原样品、af为佛罗里达鳖基原样品；m：lowladdersn127；p：阳性对照；n：阴性对照；crm：龟甲对照品121494-201403。

cr:ts为乌龟与巴西龟混合的自制掺伪品；cr:ms为乌龟与花龟混合的自制掺伪品；7:1、3:1、1:1、1:3、1:7为五种乌龟与巴西龟或花龟不同的掺伪比例。

cr1～10为10批乌龟基原样品、ts1～2为2批巴西龟基原样品、ms1～2为2批花龟基原样品、yg1～10为10批龟甲药材、sg1～10为10批龟甲饮片。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例和附图进一步说明。

本发明中涉及到的样品材料均来自市售，各简写及名称如下：

cr4：乌龟基原样品，来自江苏无锡；ts1：巴西龟基原样品，来自江苏镇江；ms1：花龟基原样品，来自浙江杭州；ps1：鳖基原样品，来自江苏无锡；af1：佛罗里达鳖基原样品，来自江苏苏州；crm：龟甲对照品121494-201403。

cr为乌龟基原样品，1来自浙江湖州，4来自江苏无锡；ts为巴西龟基原样品，1来自江苏镇江，2来自江苏无锡；ms为花龟基原样品，1来自浙江杭州，2来自江苏无锡；ps为鳖基原样品，1来自江苏无锡，4来自江苏泰州；af为佛罗里达鳖基原样品，1、2均来自江苏苏州。

cr1～10为10批乌龟基原样品，1、2来自浙江湖州不同市场，3来自上海，4、5来自江苏无锡不同市场，6来自江苏盐城，7来自浙江诸暨，8来自江苏镇江，9来自浙江杭州，10来自河南南阳；

ts1～2为2批巴西龟基原样品，1来自江苏镇江，2来自江苏无锡；

ms1～2为2批花龟基原样品，1来自浙江杭州，2来自江苏无锡；

yg1～10为10批龟甲药材，1～6购自安徽亳州久铭堂药业，7～8购自安徽亳州宁云堂药业，9～10购自河北保定祁州堂中药材；

sg1～10为10批龟甲饮片，均购自亳州市佰世信中药饮片有限公司。

实施例1：龟甲试剂盒特异性引物的设计、筛选、优化及验证

(1)试剂

十二烷基硫酸钠、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙二胺四乙酸二钠、蛋白酶k(20mg/ml，sigma-aldrich，p6556)、tris平衡酚(lifesciences，t0250)、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、ezup柱式动物基因组dna抽提试剂盒(生工，b518251)、dreamtaqgreendnapolymerase(thermoscientific，#ep0712)、dntpmix(thermoscientific，#r0192)、agarose、ethidiumbromide(sunshinebio，sn314-1)、硼酸，试剂均为分析纯。

(2)方法

设计特异性引物：

根据dnaman软件比对的乌龟及其常见伪品的基因差异chinemysreevesii(accessionno.：nc_006082.1、ay676201.1、fj469674.1、kj700438.1)，trachemysscripta(accessionno.：nc_011573.1、fj392294.1、km216749.1)，mauremyssinensis(accessionno.：nc_016685.1、fj871126.1、kc333650.1)，利用oligo7软件设计特异性引物，引物序列如下表所示，由上海生工有限公司合成。

筛选特异性引物：

将龟甲基原样品(包括乌龟及其常见伪品)粉碎，称取40目以下粉末50mg，加入995μl的sds裂解液和5μl蛋白酶k，充分混匀，56℃下于恒温混匀仪(拓普森科学仪器有限公司)600rpm孵浴提取6h，离心后取上清液；加入上清液体积1倍量的tris平衡酚，充分混匀，离心后取上清液；加入上清液体积1倍量的酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)，充分混匀，离心后取上清液；加入上清液体积1倍量的三氯甲烷-异戊醇(24:1)，充分混匀，离心后取上清液；加入上清液体积1/10倍量的5m乙酸钾溶液和上清液体积2倍量的预冷的96％乙醇，充分混合，-20℃过夜，离心后弃去上清液；加入预冷的70％乙醇500μl洗涤沉淀，离心后弃去上清液；室温晾干或冻干，以25μlte缓冲液溶解，得到基因组dna供试品溶液，质量检查，-20℃或4℃下保存，备用。

配制pcr反应体系：1×pcr缓冲液，2.0mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntps，0.2μmol/l上下游引物，0.625utaqdna聚合酶，模板dna50ng，加灭菌双蒸水补足至25μl。离心后，置于pcr仪(5331thermalcycler，eppendorf)进行扩增，反应条件：95℃3min；95℃30s，65℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min。8μl扩增产物采用含eb的2％琼脂糖凝胶进行分析。电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据各电泳条带的有无及亮度、分子量大小以筛选特异性引物。

结果如图2所示，各特异性引物对其相应物种进行扩增分析结果均有明亮的条带，其分子量与预期扩增的目的片段长度相一致。其中，pts-1、pts-2针于五个受试物种特异性均非常好；pms-1、pms-2两引物除对巴西龟物种有非常微弱的非特异性扩增外，对其余四个物种的特异性均非常好；乌龟的三对pcr引物中pcr-2的特异性优于pcr-1和pcr-3，pcr-1和pcr-3除对花龟有微弱的非特异性扩增外，对其余四个物种的特异性均非常好。通过各扩增参数的优化均有望用于龟甲样品的真伪鉴定。

优化特异性引物：

根据特异性引物的筛选结果，以引物pcr-2、pts-2、pms-1为例。通过退火温度、引物浓度、循环数等参数对筛选的特异性引物进行优化。

如图3所示表明，在35个循环扩增反应下，pcr-2在退火温度为66℃时，扩增效果最佳；pts-2在退火温度为64℃时，扩增效果最佳；而pms-1在退火温度为68℃时，巴西龟物种仍有极其微弱的非特异性扩增，且对花龟物种本身的扩增也有所抑制。因而，通过循环数对pms-1进一步优化，结果表明，31个循环下pms-1扩增效果最好；由于饮片为多个样品混合物，综合检测效率考虑，pcr-2/pts-2引物的较优扩增条件为95℃3min；95℃30s，66℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min。pms-1引物的较优扩增条件为95℃3min；95℃30s，66℃30s，72℃1min，31个循环；72℃7min。同样的方法，对其他引物对进行优化。

验证龟甲试剂盒引物：

随机抽取已鉴定的乌龟及常见伪品的基原样品的甲壳各2批在优化的条件下进行pcr扩增、琼脂糖凝胶电泳分析及凝胶成像系统检测，根据电泳条带的有无以及分子量大小以对特异性引物进行验证。此外，通过纯化后的扩增产物进行进一步的双向测序确认是否为目的片段。

结果如图4所示，特异性引物通过不同批次乌龟及其常见掺伪品在优化的条件下进行特异性验证，乌龟的dna通过特异性引物进行扩增后在120bp处产生条带；其常见混伪品(来源于巴西龟、花龟)则与各自的特异性引物进行扩增后，分别在81bp、105bp处产生条带，且引物间无交叉反应，体现出了很强的专属性。此外，测序比对结果如图5，测序结果与目的产物序列基本一致，表明所获得的扩增产物确实为预期扩增的目的片段。

实施例2：龟甲试剂盒引物用于自制掺伪品的检测应用

用预先粉碎的乌龟、巴西龟、花龟基原的甲壳粉末混合制备龟甲掺伪品，两种龟甲掺伪品(cr:ts、cr:ms)按5种不同的比例(7:1、3:1、1:1、1:3、1:7)进行混合，每个样品的终质量为50mg。然后通过sds法进行提取纯化，并在优化的条件下进行分析。

首先制备供试品溶液，然后利用pcr及琼脂糖凝胶电泳技术快速检测目标片段。

其中供试品溶液的制备方法按照下述步骤进行：

(1)将龟甲产品粉碎，过40目筛，收集细粉，加入适量的sds裂解液和蛋白酶k(料液比为10-200:1mg/ml)，充分混匀，于56℃孵浴提取6h，离心后取上清液；

(2)加入与上清液等体积的tris平衡酚，充分混合，离心后取上清液，加入与上清液等量的酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)，充分混合，离心后取上清液；

(3)加入与上清液等量的三氯甲烷-异戊醇(24:1)，充分混合，离心后取上清液，再加入上清液体积1/10倍量的5m乙酸钾溶液和上清液体积2倍量的预冷的96％乙醇，充分混合，-20℃冷冻过夜，离心后弃去上清液；

(4)加入预冷的70％乙醇500μl洗涤沉淀，离心后弃去上清液，沉淀物于室温下晾干或冻干，用适量te缓冲液溶解，质量检查，-20℃或4℃下保存，备用。

以制备的供试品溶液dna为模板，配制pcr反应体系，设定pcr扩增程序，进行pcr扩增。

所述的pcr反应体系，总体积25μl，包括：1×pcr缓冲液、2.0mmol/lmgcl2、0.2mmol/ldntps、0.1μmol/l～0.4μmol/l引物对、0.625u～1.0utaqdna聚合酶、模板dna50ng，加灭菌双蒸水补足至25μl。

pcr扩增程序为：95℃3min；95℃30s，60℃～68℃10s～30s，72℃1min，循环数30～40；72℃5min～7min。

扩增产物采用含荧光染料eb的2％琼脂糖凝胶进行分析后以凝胶成像系统检测，制胶及电泳的缓冲液均为tbe，上样量为8μl。

结果如图6所示，5种不同比例的进行混合的两种掺伪品由相应物种的特异性引物pcr-2、pts-2、pms-1扩增分析，其条带位置与预期扩增的目的片段长度相一致，表明本发明的特异性引物能鉴定出掺伪品中的相应物种。同样的，pcr-1、pcr-3、pts-1及pms-2扩增分析后亦能鉴定出掺伪品中的相应物种。

实施例3：不同批次市售龟甲样品的检测

方法同实施例2。

将不同批次市售龟甲样品(基原、药材及饮片)粉碎，称取40目以下粉末50mg，通过sds法进行提取纯化及质量检查。此后，配制pcr反应体系，将其置pcr仪按上述优化的条件进行扩增。随后，将8μl扩增产物采用含eb的2％琼脂糖凝胶及tbe缓冲液进行分析，电泳结束后，通过凝胶成像系统检测，并根据电泳条带的有无以及分子量大小以判定龟甲的真伪。此外，乌龟、巴西龟及花龟的阳性对照物质通过分别称取40目以下基原样品粉末50mg，通过sds法进行提取纯化及质量检查后，冻干制备dna阳性对照物质，并注明其中dna的质量。

结果如图7～9所示，34批市售龟甲样品中，2批龟甲基原样品通过pms-1进行扩增后在105bp处产生条带，鉴定为花龟甲。2批龟甲基原样品、2批龟甲药材通过pts-2进行扩增后在81bp处产生条带，鉴定为巴西龟甲。其余10批龟甲基原样品、8批龟甲药材、10批龟甲饮片通过pcr-2进行扩增后均在120bp处产生条带，除饮片外均鉴定为正品龟甲产品；由于饮片为多个样品混合物，需进一步通过pts-2、pms-1验证是否为掺伪品。检测发现该10批龟甲饮片均无阳性反应，结果表明亦为正品龟甲产品。此外，如图10所示，通过pcr-1、pcr-3、pts-1及pms-2对龟甲饮片扩增分析，发现结果与pcr-2、pts-2及pms-1的扩增结果相一致，表明同样能用于龟甲产品的鉴定。

序列表

<110>江苏大学

<120>一组鉴定龟甲的特异性引物及其鉴定方法

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>乌龟(chinemysreevesii)

<400>1

tatcgttacagcccatgcct20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>乌龟(chinemysreevesii)

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gcgctccgatcattaaaggt20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>乌龟(chinemysreevesii)

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aacctggcatattatggtct20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>乌龟(chinemysreevesii)

<400>4

caatcaacttgaacgagggt20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>乌龟(chinemysreevesii)

<400>5

caacccaaaaccttccgaac20

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>乌龟(chinemysreevesii)

<400>6

ggattctattggcatgaccac21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>巴西龟(trachemysscripta)

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agagaaggactttaaccctcg21

<210>8

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<212>dna

<213>巴西龟(trachemysscripta)

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gtttatgcccgatagacctca21

<210>9

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<212>dna

<213>巴西龟(trachemysscripta)

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gcccaaactaacagacaaccg21

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<212>dna

<213>巴西龟(trachemysscripta)

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cagcgaagtaagtagttcacc21

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<212>dna

<213>花龟(mauremyssinensis)

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tcctcgggataatccacgaac21

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<212>dna

<213>花龟(mauremyssinensis)

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<212>dna

<213>花龟(mauremyssinensis)

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tgtcacctattacgctggcaa21

<210>14

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<212>dna

<213>花龟(mauremyssinensis)

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acaataaagcccaggaaaccg21