(一)
技术领域：
本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种石榴细胞的悬浮培养方法。(二)
背景技术：
：石榴(punicagranatuml.)是石榴科石榴属多年生落叶乔木或灌木，在我国南北都有栽培分布。石榴既是重要的食用水果植物，同时更是一种重要的药用植物。石榴的叶、花、根、果皮均可入药，具有重要医药价值,其细胞组织内含有苹果酸、鞣质、生物碱等多种成分，具有多种医药用途，石榴花中的活性物质还有止血功能。研究表明，石榴的醇浸出物及果皮水煎剂，具有广谱抗菌作用，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等有明显的抑制作用，石榴皮以及石榴树根皮提取的活性物质对人体的寄生虫有麻醉作用，是驱虫杀虫药的重要成分。目前石榴人工种植主要采用扦插繁殖，石榴容易遭受病毒的侵染而在扦插繁殖中传播病毒，从而使优良性状的遗传资源得不到保护，而种子繁殖周期又很长，最重要的是受季节变化和耕地逐渐减少的影响，无法满足石榴的市场需求。由于人工种植石榴存在上述问题，因此迫切需要找到一种能安全、快速而大量生产有效成分含量高的石榴细胞培养物的途径和方法。而采用组织培养技术不仅能解决石榴品种的繁殖变异问题，还可以通过细胞培养大量生产石榴碱次生代谢产物。石榴的悬浮细胞系的建立目前还未见报道，在工业生产中，通过石榴细胞培养是获得石榴细胞次生代谢药物和提取药理活性因子的有效途径之一，而且可研究石榴生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对石榴的遗传育种具有特殊意义。(三)技术实现要素：本发明的目的在于提供一种石榴细胞的悬浮培养方法。本发明采用的技术方案是：一种石榴细胞的悬浮培养方法，所述方法按如下步骤进行：(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的石榴腋芽作为外植体，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用质量浓度0.1％hgcl2消毒液浸泡8～12min，再用无菌水冲洗3～5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；(2)石榴愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23～28℃下，暗培养10～15天，然后每天光照8～12小时、光照强度为1000～1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-ba(即6-苄氨基腺嘌呤)0.5～2.0mg/l、2，4-d(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0～3.0mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6.0g/l的ms固体基本培养基,培养基的ph值为5.8；(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-ba0.5～1.5mg/l、2，4-d1.0～4.0mg/l、蔗糖30g/l的ms液体基本培养基,培养基的ph值为5.8；(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的石榴单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50g/l的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-ba0.1～1.0mg/l、2，4-d1.0～3.0mg/l、酸水解酪蛋白0.2～0.8g/l、蔗糖30g/l的ms液体培养基,培养基的ph值为5.8；(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15～25天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，即为鲜重；细胞增殖倍数＝(收获量鲜重—接种量鲜重)/接种量鲜重；细胞的生长速率(即每升培养液中每天生长量)＝(收获鲜重—接种量鲜重)/培养天数。上述(3)、(4)、(5)步骤中石榴细胞的培养条件均为温度23～28℃，ph值5.8，每天光照6～12小时，光照强度为1000～1500lx，摇床转速为120r/min。进一步，步骤(2)所述愈伤组织诱导培养基为添加6-ba1.0mg/l、2，4-d1.5mg/l的ms固体基本培养基。进一步，步骤(3)所述石榴细胞的预培养液体培养基为添加6-ba0.8mg/l、2、4-d2.0mg/l的ms液体基本培养基，预培养时间为7天。进一步，步骤(4)所述石榴细胞悬浮培养基为添加6-ba0.5mg/l、2，4-d2.0mg/l、酸水解酪蛋白0.6g/l的ms液体基本培养基,ph值为5.8、蔗糖30g/l。进一步，步骤(4)所述石榴细胞悬浮培养基的细胞团接种量是30g/l。本发明所述ms基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖。所述大量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加硝酸铵nh4no31.65克、硝酸钾(kno3)1.9克、氯化钙(cacl2·2h2o)0.44克、硫酸镁(mgso4·7h2o)0.37克、磷酸二氢钾(kh2po4)0.17克。所述微量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加碘化钾(ki)0.83毫克、硼酸(h3bo3)6.2毫克、硫酸锰(mnso4·4h2o)22.3毫克、硫酸锌(znso4·7h2o)8.6毫克、钼酸钠(na2moo4·2h2o)0.25毫克、硫酸铜(cuso4·5h2o)0.025毫克、氯化钴(cocl2·6h2o)0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加乙二胺四乙酸二钠(na2edta)37.3毫克，硫酸亚铁(feso4·7h2o)27.8毫克。所述有机物组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、盐酸硫胺素(vb1)0.1毫克，盐酸吡哆醇(vb6)0.5毫克，烟酸(vb5)0.5毫克。蔗糖浓度是20～40克/升，溶剂为水，ph为5.6～6.0。其中ms固体培养基包含琼脂，ms液体培养基内不包含有琼脂。本发明所述石榴腋芽选自浙江杭州园艺场的长势良好、无病虫害的石榴植株。本发明所述酸水解酪蛋白购自青岛海博生物公司。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明能够快速获得大量的石榴悬浮培养细胞。(2)本发明通过在细胞悬浮培养前对其进行预培养、以及在悬浮培养基中加入酸水解酪蛋白，有效提高了细胞生长速度，增加了细胞鲜重，实现了工厂化大规模生产石榴细胞。(3)本发明获得的石榴愈伤组织具有较高诱导率、生长旺盛、不褐化等优点，可长期继代保持，通过石榴愈伤组织进行细胞的悬浮培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的石榴细胞培养物，从而可有效解决当前石榴植物资源和药材资源短缺的问题。(四)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的石榴腋芽作为外植体，用自来水冲洗30min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30s，然后用质量浓度0.1％hgcl2消毒液浸泡8min，再用无菌水冲洗3遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；(2)石榴愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23℃下，暗培养10天，然后每天光照8小时、光照强度为1000lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-ba(即6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/l、2，4-d(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6.0g/l的ms固体基本培养基,培养基的ph值为5.8；(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-ba0.5mg/l、2，4-d1.0mg/l、蔗糖30g/l的ms液体基本培养基,培养基的ph值为5.8；(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的石榴单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20g/l的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-ba0.1mg/l、2，4-d1.0mg/l、酸水解酪蛋白0.2g/l、蔗糖30g/l的ms液体培养基,培养基的ph值为5.8；(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15天进行第一次继代培养，以后每隔15天继代一次；(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，计算出石榴细胞的生物量增殖倍数为1.48倍，细胞的生长速率为2.16g/g/(d·l)；上述(3)、(4)、(5)步骤中石榴细胞的培养条件均为温度23℃，ph值5.8，每天光照6小时，光照强度为1000lx，摇床转速为120r/min。实施例2酸水解酪蛋白对石榴细胞悬浮培养的影响选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的石榴单个细胞或疏松细胞小聚集体转接到添加不同激素的细胞悬浮培养基中，其它操作同实施例1，石榴细胞悬浮培养结果见表1所示。结果表明，不同激素组合的培养基可以不同程度地诱导石榴细胞增殖，但是当培养基中添加酸水解酪蛋白之后，细胞褐化率减少，细胞生长倍数增加，细胞生长速率也增加，其中添加0.6g/l酸水解酪蛋白，细胞生长速率最快，达到3.50g/(d·l)，细胞增殖倍数达到2.95倍。表1酸水解酪蛋白对石榴细胞悬浮培养的影响实施例3细胞的预培养对石榴细胞悬浮培养的影响将实施例1步骤(2)中获得的石榴无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行不同天数的预培养，其它步骤同实施例1，石榴细胞悬浮培养结果见表2所示。结果表明，预培养7天后，继代培养3代的石榴细胞生物量增殖最大，细胞增殖倍数为3.04倍,细胞的生长速率为3.45g/(d·l)。表2预培养对石榴细胞悬浮培养的影响预培养时间(天)细胞增殖倍数(倍)细胞生长速率g/(d·l)01.051.2951.892.5673.043.4592.763.06实施例4接种量对石榴细胞悬浮培养的影响选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的石榴单个细胞或疏松细胞小聚集体，以不同的接种量转接到细胞悬浮培养基中，其它步骤同实施例1，石榴细胞悬浮培养结果见表3所示。结果表明，接种量为30g/l时，继代培养3代的石榴细胞生长速率最大，细胞增殖倍数为2.82倍,细胞的生长速率为3.36g/(d·l)。表3接种量对石榴细胞悬浮培养的影响接种量(g/l)细胞增殖倍数(倍)细胞生长速率(g/((d·l)202.462.69302.823.36502.592.73实施例5(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的石榴腋芽作为外植体，用自来水冲洗50min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇3min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡50s，然后用质量浓度0.1％hgcl2消毒液浸泡10min，再用无菌水冲洗4遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；(2)石榴愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在25℃下，暗培养12天，然后每天光照10小时、光照强度为1200lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-ba(即6-苄氨基腺嘌呤)1.0mg/l、2，4-d(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6.0g/l的ms固体基本培养基,培养基的ph值为5.8；(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行7天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-ba(即6-苄氨基腺嘌呤)0.8mg/l、2，4-d(即2,4-二氯苯氧基乙酸)2.0mg/l、蔗糖30g/l的ms液体基本培养基,培养基的ph值为5.8；(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的石榴单个细胞或疏松细胞小聚集体，以30g/l的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-ba0.5mg/l、2，4-d2.0mg/l、酸水解酪蛋白0.6g/l、蔗糖30g/l的ms液体培养基,培养基的ph值为5.8；(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了20天进行第一次继代培养，以后每隔20天继代一次；(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，计算出石榴细胞的生物量增殖倍数为2.78倍，细胞的生长速率为3.46g/g/(d·l)；上述(3)、(4)、(5)步骤中石榴细胞的培养条件均为温度25℃，ph值5.8，每天光照10小时，光照强度为1200lx，摇床转速为120r/min。实施例6(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的石榴腋芽作为外植体，用自来水冲洗60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡60s，然后用质量浓度0.1％hgcl2消毒液浸泡12min，再用无菌水冲洗5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；(2)石榴愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在28℃下，暗培养15天，然后每天光照12小时、光照强度为1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-ba(即6-苄氨基腺嘌呤)2.0mg/l、2，4-d(即2,4-二氯苯氧基乙酸)3.0mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6.0g/l的ms固体基本培养基,培养基的ph值为5.8；(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-ba(即6-苄氨基腺嘌呤)1.5mg/l、2，4-d(即2,4-二氯苯氧基乙酸)4.0mg/l、蔗糖30g/l的ms液体基本培养基,培养基的ph值为5.8；(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的石榴单个细胞或疏松细胞小聚集体，以50g/l的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-ba1.0mg/l、2，4-d3.0mg/l、酸水解酪蛋白0.8g/l、蔗糖30g/l的ms液体培养基,培养基的ph值为5.8；(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了25天进行第一次继代培养，以后每隔25天继代一次；(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，计算出石榴细胞的生物量增殖倍数为1.64倍，细胞的生长速率为1.86g/(d·l)；上述(3)、(4)、(5)步骤中石榴细胞的培养条件均为温度28℃，ph值5.8，每天光照12小时，光照强度为1500lx，摇床转速为120r/min。当前第1页12