一种流式电穿孔装置的制作方法

本实用新型涉及电穿孔领域，特别是涉及流式电穿孔装置，通过电场将流动的生物活性物质递送进流动的活细胞的方法和装置。

背景技术：

电穿孔现象是20世纪70年代发现的，利用电场处理细胞，形成微孔，但是不对细胞造成永久性的损伤，微孔可自行复位。这项发现使生物活性物质进入细胞成为可能。已有的研究发现，有四个现象可能在电穿孔的过程中起作用。第一个现象是绝缘击穿。绝缘击穿指的是高电场在细胞膜上产生小的微孔或洞的能力。一旦产生微孔，细胞就可以荷载生物活性物质。第二个现象是绝缘聚束效应，它指的是在均匀的电场中通过泡囊的堆放产生相互自吸引。第三个现象是泡囊融合。泡囊融合指的是通过绝缘击穿产生微孔的生物泡囊的膜在近距离内与其在绝缘击穿位点处结合在一起的趋势。第四个现象是在高频电场存在下细胞沿着它们的一个轴排列成一条直线的趋势。因此，为了荷载和卸下细胞泡囊，电穿孔涉及在泡囊旋转预定位，泡囊穿孔和泡囊的介电常数中的应用。

在现有技术中可得到的电穿孔室大多被设计为仅在静态使用，这些静态的电穿孔室受体积的限制，不适于处理大量的样品，也不能使用高压或重复的充电。为了进行大体积处理细胞，发展出了流式电穿孔室。

流式电穿孔指的是这样的过程，其包括：将细胞的悬浮液和外源的生物活性物质的混悬液转移到由流体室或流体流道构成的设备中；所述流体室或流体流道由沿着流体室或流体流道的侧面设置、并且被配置为、使所述流体室或流体流道内的混合液受到适合于电穿孔的电场作用的电极构成；以及将经过电穿孔的细胞悬浮液从设备中转移出。该方法对于大规模体积的细胞特别有效。

一般来说，用于流式电穿孔的装置包含两个平面电极，要进行电穿孔的细胞悬液持续而稳定地流过两个电极之间，直到整个细胞悬液都进行了电穿孔。流式电穿孔装置包含带电极和接口的电穿孔室，细胞悬液可通过接口注入。电极与能给电极提供高压脉冲的电路相连。高压脉冲由程序控制计算机控制。现在已开发出了流式电穿孔系统，该系统能够对较大体积的细胞进行电穿孔，获得导入目的分子的活细胞。但是，目前成功商业化的流式电穿孔仪却极为少见，一方面与市场的需求有直接的关联，另一方面是由于电穿孔的效率和产品的稳定性有关。

流式电穿孔的条件因细胞类型的不同而不同，还因期望导入到细胞内的分子的类型不同而不同。对于任何一个特定类型的细胞来说，都存在一个最佳的处理条件，其中包括最佳电压、脉冲宽度，最佳时间间隔、脉冲次数进行脉冲。为了使施加到细胞上的电脉冲次数达到最佳，在使用本领域所描述的流式电穿孔装置时，细胞悬液通过电穿孔室、在电极之间的流速以及脉冲的频率都是可以选择的，从而对一定体积的细胞悬液进行最佳次数的脉冲。例如，对于一个特定细胞来说，如果已知每个细胞上施加的最佳脉冲数是2，通过电穿孔室的体积是1ml，那么，流速就设定为每一单位时间1ml，每一单位时间内施加的脉冲次数为2。如果以这种方式进行电穿孔，在这个例子中每个细胞就会受到2次脉冲。但是，细胞悬液通过电穿孔室的水动力学流动会导致细胞以不同的速率通过室以及在电极之间流动。由于离室壁远的地方比靠近室壁的地方流速高，因此，在电极之间向液流中心流动的细胞通过电极之间的区域所需要的时间会低于单位时间，其受到的脉冲次数可能会少于2次，而靠近室壁流动的细胞通过电极之间的区域所需要的时间会高于单位时间，其受到的脉冲次数可能高于2次。由于在这个例子中每个细胞受到的最佳脉冲次数为2次，但是，很明显并不是每个细胞都受到了最佳次数的脉冲，因此，细胞悬液的整体电穿孔效果就不是最佳的。

电穿孔的最佳条件根据电穿孔的特定细胞类型以及想要通过电穿孔导入到细胞内的分子类型的不同而不同。利用试验的方法解决这个问题是可能的，利用静态的室有组织地改变电穿孔的条件，然后将确定于这些试验的最佳条件应用到流式电穿孔系统中。这个方法有两个缺点。第一，由于进行大量样品的静态室电穿孔需要耗费大量的时间，因此，用于每次静态电穿孔的细胞在试验中也会发生改变。第二，使用这种方法只是因为人们认为静态室电穿孔的最佳条件与流式电穿孔是一样的，但是并不知道这是否真实。

我们期望的是利用一个细胞样品就能够确定使用同一个装置进行所有电穿孔试验的最佳条件，这个条件可用于治疗或其他目的所需的细胞大规模电穿孔。

电转杯主要是以插入金属电极的比色杯形式，用于电穿孔或电融合。用于这种用途的容器多半是小容器，其底部封闭，顶部开口，且内部空间通过两对平行相对布置的侧壁构成。内部空间的作用是接收其中悬浮了待处理细胞的细胞悬浮液，即通常是缓冲水溶液或细胞培养介质。这种比色杯多半包含布置在一对相对排布的侧壁底部附近的施加电压的一对电极。放电期间，电流流过两个电极之间的细胞悬浮液，能使核酸或其他分子进入细胞或根据所选择的条件而导致细胞融合。电极多半由金属制成，其中铝最常用。但这些公知的、可商购的比色杯有一个缺点，就是金属离子在放电期间会发射到缓冲溶液中，对细胞产生不希望有的刺激，使细胞中毒。例如，采用铝制比色杯，可说明由于Al³⁺离子的释放产生的副作用。此外，采用具有金属制成的电极的比色杯，会发生不希望有的沉淀，这也是由于从电极释放金属离子产生的。这种沉淀可以是金属氢氧化物或金属离子与缓冲溶液中的生物大分子的结合物。最后，铝制比色杯的另一个缺点是，比色杯的电阻在放电期间降低，大概是由于具有较高电阻的氧化铝层通过电流而从电极脱落。

现有技术中对电极材料做了尝试性的改进，例如，专利 CN03805811.1公开了一种掺杂至少一种导电物质的塑料的导电合成材料制成的电极，并且塑料中的掺杂物的总浓度为20-80％w/w，掺杂物由碳纤维、石墨、碳黑和/或碳纳米管组成，能够用电流有效处理细胞、细胞衍生物。专利CN201610044870.8公开了一种细胞电转染装置，电极表面具有纳米线结构，纳米线选自氧化铜纳米线、二氧化钛纳米线、金纳米线、银纳米线、铜纳米线、钛纳米线、铁纳米线、铂纳米线、钛铂合金纳米线、氧化铁纳米线、二氧化锡纳米线、金属包覆的硅纳米线中的任一种，使用的转染电压小于等于10V，利用电极表面微观结构使局部场强增加3-4个数量级，但是该电转染装置仅仅是用于贴壁细胞的静态电穿孔。

根据研究人员的研究，目前流式电转染过程中存在的主要技术问题是电解水造成的阴极周围溶液pH变化、阳极电极表面氧化产生有害物质、电流的焦耳效应导致溶液温度升高以及电转产生的气泡等异物引起电场强度及其分布的变化。

本实用新型的流式电穿孔室的研发过程中，电极研发作为核心内容，其中电极材料更是关键，电极材料直接与细胞溶液接触，在电穿孔过程中发生电化学反应，导致电场变化，影响结果，同时不稳定的阳极材料会有金属离子析出，引起细胞死亡或污染细胞溶液，造成更大的危害。因此，本实用新型研发的具有生物兼容性的稳定电极材料是解决流式电穿孔商业化应用的首要问题。

本实用新型的流式电穿孔室在电穿孔过程，电极与细胞溶液接触，在电极表面易发生电解水反应，产生气泡，理想情况下，气泡会随着液体流动，快速从电极内部排出。

但是由于电极结构和电极材料表面粗糙度的影响，如果气泡在电穿孔室内部滞留，由于气泡不导电，电极内电场强度分布发生变化；同时气泡占据腔室，会改变溶液流速，导致细胞流过电极区域接受到的电流脉冲信号次数和强度的改变，造成电穿孔结果发生变化。因此，本实用新型需要解决电穿孔时产生的气泡以及如何将气泡排出的技术问题。

流体进入电穿孔室时，由于导管与电穿孔室的横截面积的差异，会产生瞬间的压强改变，流体在电穿孔室流动的过程中，如何保持液体横截面流动相对速度的稳定，使流体的流速与脉冲的次数稳定，也是本实用新型需要解决的技术问题。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种用于流式电穿孔的装置的改进电极，其能够替代铝电极的使用，并比铝电极具有更高的电转染效率和细胞存活率。

本实用新型的另一目的在于提供一种流式电穿孔的装置，其能够使流体以相对恒定的速度流过流式电穿孔室。

本实用新型的另一目的在于提供一种流式电穿孔的装置，通过电极结构的优化及电场的控制来优化气泡的产生及排出，避免气泡在电极内部滞留影响电转结果。

本实用新型的另一目的在于提供一种流式电穿孔的装置的制备方法，该方法步骤简单，操作方便，产品易于标准化处理。

为实现本实用新型的上述目的，采用以下的技术方案：

本实用新型的流式电穿孔装置，主要包括支架和限定流体流动通道的平面电极，两片平面电极平行嵌入支架，组成一个电穿孔腔室，所述平面电极包括用于放置与高压脉冲电源有电联系的装置，两片平面电极分别接入高压脉冲电源输出电信号的正、负极，接通电信号后，在两片平面电极之间的所述电穿孔腔室形成均匀的电场，从而使沿所述流体流动通道移动流经所述电穿孔腔室的流体经历脉冲电场。

本实用新型的流式电穿孔电极选用导电性能良好的金属材料，同时需要稳定的电化学性能，在电穿孔过程中不能与细胞溶液发生化学反应，避免产生有害物质。

可供选择的电极材料有铝、不锈钢、金、银、钛、铂、铱、铌、钌、铑、钼、钨、导电陶瓷等。

优选所述的电极材料为金、钛、铂、铱、铌、钌、钼、钨、铑；

优选所述平面电极材料表面可以添加涂层或镀层，涂层或镀层材料与基材的材料不同；

优选所述平面电极的涂层或镀层材料为金、银、钛、氧化铱、铱、铂、铌、钌、钼、铑、钨、导电陶瓷材料中的一种或几种。

优选所述平面电极的材料为铂镀金、铂镀银、铂镀铱、铂镀铌、铂镀钌、铂镀钼、铂镀铑、铂镀导电陶瓷。

优选所述平面电极的材料为钛镀金、钛镀银、钛镀铱、钛镀铂、钛镀铌、钛镀钌、钛镀钼、钛镀铑、钛镀导电陶瓷。

优选所述平面电极的材料为铱镀金、铱镀银、铱镀铂、铱镀铌、铱镀钌、铱镀钼、铱镀铑、铱镀导电陶瓷。

优选所述平面电极的材料为铑镀金、铑镀银、铑镀铱、铑镀铂、铑镀铌、铑镀钌、铑镀钼、铑镀导电陶瓷。

优选所述平面电极的镀层的厚度为0.1μm-10μm。

优选所述平面电极的涂层或镀层的制备方法为涂抹或电镀，制备工艺：包括前处理、预处理、涂抹或电镀、烘干的步骤。

前处理包括选取合适基材进行外形加工、表面喷砂处理，根据镀层厚度选取不同的喷砂目数、使用酸清洗表面氧化层。

预处理包括使用清洗剂进行超声清洗，去离子水冲洗去除清洗剂残留。

涂抹包括使用浸泡或毛刷或喷枪喷/涂抹后烘干将基材表面涂上均匀的涂层，电镀包括使用电解法在基材表面镀上均匀的镀层，涂抹或电镀后使用去离子水冲洗，去除涂抹液或电镀液，烘干备用。

优选所述平面电极的形状为方形、圆形、椭圆形中的一种或几种。

优选所述平面电极的表面积为10-2500mm²，优选为 50-1000mm²。

优选所述平面电极的厚度为0.5-5mm，

优选所述平面电极的厚度为1-3mm。

优选所述平面电极的表面光滑平整，与支架接触平缓无断差且密封。

优选所述两片平面电极分别由相同或异种材料制成。

优选所述两片平面电极之间的距离为0.5-8mm。

优选所述两片平面电极之间的距离为1-5mm。

本实用新型流式电穿孔装置的支架用于固定平面电极，所述支架材料选用医疗级的工程塑料。

所述支架通过注塑成型或CNC或3D打印的方式制成。

本实用新型的流式电穿孔装置，还包括导管，所述导管与支架连接，所述导管包括进液管和出液管。

优选所述支架上设置至少一个流体缓冲区域，所述流体缓冲区域位于导管与平面电极之间。

优选所述流体缓冲区域的水平截面为三角形、正梯形、倒梯形、方形、半圆形、半椭圆形等。

优选所述支架设置进液口和出液口，所述进液管与进液口连接，所述出液管与出液口连接。

流体通过进液口流入腔室，在电场的作用下，完成电穿孔，最后通过出液口流出。

优选所述出液管的直径不小于所述进液管的直径。

优选所述导管的直径在2-10mm之间。

优选所述导管选用医疗工程塑料或医用硅胶。

优选所述导管与支架的进液口或出液口的连接方式包括但不限于螺纹连接，卡扣连接，包覆连接，超声焊接等。

利用本实用新型所述流式电穿孔装置经过处理的电穿孔细胞，细胞电转染率至少60％以上，细胞存活率至少60％以上。

本实用新型的流式电穿孔装置的制备方法，所述装置通过注模法或CNC或3D打印制造，先制作留有两个凹陷窗的支架，接着将平面电极安装到所述凹陷窗中，然后再将平面电极封装。

本实用新型的流式电穿孔装置的使用方法，向所述平面电极施加电压，产生电流，所述电流达到最高120A/cm²，通过电穿孔原理将生物活性物质转入细胞。

本实用新型的流式电穿孔装置的使用方法，将细胞和生物活性物质物质置于溶液中，并将溶液转移到流式电穿孔装置内，所述生物活性物质向细胞中转移，通过连接所述电压脉冲的电流密度为 2-14A/cm²，脉冲宽度为0.01-100ms的电流实现。

本实用新型的流式电穿孔装置的使用方法，通过场强 200V-10KV/cm，脉冲宽度0.01-100ms的电压脉冲实现所述生物活性物质到活细胞中的转移。

本实用新型提供一种流式电穿孔系统，含有本实用新型所述的流式电穿孔装置，还含有电脉冲发生装置，还包括电极冷却控温装置，还包括至少一个流体装储装置，利用温度调节装置能够对权利要求1-22任一项所述的流式电穿孔装置的周围环境设定温度在0-40℃之间，利用二氧化碳发生器使系统内二氧化碳的浓度在3-8％之间。

本实用新型的流式电穿孔装置用于将生物活性物质转染进细胞的用途，其特征在于，所述生物活性物质包括但不限于药剂、基因 DNA、RNA、抗体或其他的蛋白质、细胞因子、纳米颗粒等。

优选所述细胞的种类包括但不限于原核细胞、真核细胞、植物原生质体等。

优选原核细胞包括细菌、真菌、酵母菌。

优选真核细胞包括动物细胞系细胞，原代细胞，卵细胞等。

与现有技术相比，本实用新型的流式电穿孔装置取得了显著的进步以及预料不到的技术效果：

本实用新型能够使流体以均一稳定的流速流过电穿孔室，有效的排除产生的气泡，提高电穿孔效率；

本实用新型优选的平面电极材料制成的平面电极，能够提供持续稳定的电流，在缓冲溶液存在下，能提供稳定的均匀电场，能够显著提高电穿孔效率，同时保证细胞高存活率；

本实用新型优选的平面电极在与缓冲液接触后，即使较高的脉冲电压，令人意外的发现产生的电解反应非常小，同时产生的气泡非常少，对能够持续对平面电极施压脉冲提供了有利的条件；

本实用新型的平面电极在工作状态产生的OH^-(阴极效应)少，不改变细胞液的pH值，对细胞伤害小，细胞存活率高；

本实用新型的流式电穿孔装置生产工艺简单，制备成本低，产品制作能够标准化生产，批次处理细胞液体积更大，转染效率和细胞存活率更高，稳定性更好，使用方法操作方便。

本实用新型的流式电穿孔装置是目前最先进的流式电穿孔产品，能够用于实际的实验室及生产环节进行电转染，具有巨大的商业化空间。

附图说明

为了更清楚的说明本实用新型实施例的技术方案，以下将对实施例中所需要使用的附图做简单的介绍。

图1不同尺寸铝电极的电流稳定性；

图2加导电陶瓷涂层的钛电极、铝电极和不锈钢镀金电极的电流稳定性；

图3加导电陶瓷涂层的钛平面电极电转后溶液颜色变化；

图4铝电极电转后溶液颜色变化；

图5不锈钢镀金电极电转后溶液颜色变化；

图6纯钛电极的电转后溶液颜色；

图7钛镀铂电极的电转后溶液颜色；

图8加导电陶瓷涂层的钛平面电极电转后电极表面变化(左边为阳极、右边为阴极)；

图9铝电极电转后电极表面变化(左边为阳极、右边为阴极)；

图10不锈钢镀金电极电转后电极表面变化(左边为阳极、右边为阴极)；

图11纯钛电极电转后电极表面变化(左边为阳极、右边为阴极)；

图12钛镀铂电极电转后电极表面变化(左边为阳极、右边为阴极)；

图13流体正进正出方式示意图；

图14流体缓冲区域结构侧视图；

图15电极冷却控温装置示意图；

注释

1-导管(出液管)；2-支架出液口；3-第一缓冲区域；4-电穿孔室；

5-第一平面电极；6-第一平面电极冷却装置；7-导管(进液管)；8-导管(进液管)；9-第二缓冲区域；10-支架；11-第二平面电极冷却装置；12-第二平面电极。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本实用新型的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本实用新型，而不应视为限制本实用新型的范围。实施例中未注明具体条件者，按照本领域常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例一

电极的形状和尺寸的选择

本实用新型的流式电穿孔装置采用平面电极，平面电极的尺寸大小决定了单位时间内处理细胞的速度，电穿孔腔室的长度、宽度和间距分别有不同的影响。

在流速恒定的情况下，平面电极的长度影响电极内部溶液流动的时间，增加电极长度会增加气泡流过电极区域时与电极表面接触时间，增加气泡滞留的概率。

平面电极的宽度影响电极内部溶液流动的速度，流体中间区域流速快，边缘区域流速慢，电极宽度越大，偏差越明显。

平面电极的间距影响电场的强度，根据公式E＝U/d，相同电压下，间距越大，电场越小。增加电极间距，如果要达到最佳的电转强度，就需要提高电压，增加仪器的输出。

实验方案设计：使用不同长度与宽度的比例关系的平面电极制作流式电穿孔装置，用空缓冲液测试电流数据变化，同时观测气泡产生和排出情况，优化平面电极的长度与宽度比例关系。

平面电极的形状选择长方形或正方形。平面电极测试材料选择铝，测试样本长宽厚尺寸分别设定为：15×10×2mm，25×4×2mm， 25×2×2mm，12.5×4×2mm。用CNC或3D打印制作带有两个凹陷窗口的支架，所述凹陷窗口的尺寸与上述平面电极的尺寸一致。平面电极嵌入凹陷窗口中，再将支架封装，形成一个带有流体流入口和流出口的电穿孔室。将上述装置的两片电极分别连接脉冲电源输出端的正负极。电转条件150V/11ms/1次，加入相应体积的EL缓冲溶液(苏州壹达公司及其代理商有售产品，货号：H10305)，记录电击过程中的电流数据变化情况(参见附图1)，全程观察气泡产生与排出情况。

电击过程检测结果：长度25mm的电极，电击过程中产生的小气泡容易在电极内累积，附着在电极表面，逐渐成长为大气泡再排出，引起电流周期性波动，造成电场稳定性下降。长度12.5mm的电极，电击过程中产生的小气泡随溶液流动排出，很少在电极内累积，电流稳定性好，但平面电极为2×4mm的电穿孔室总体积只有2× 8mm的一半，相同条件下选取2×8mm规格，以提高单位时间内的处理量。长度和电极间距不变的情况下，单独改变电极宽度，宽度越大，单位时间处理量越大，反之宽度越小，单位时间处理量越小。但是加大宽度后，电极两侧区域与中间区域内溶液流速差异也会变大，综合考虑15×10×2mm为优选的电极尺寸。

实施例二

平面电极材料的选择

本实用新型的流式电穿孔装置，平面电极材料研发作为核心内容，平面电极表面应光滑平整，与支架接触平缓无段差且形成密封腔室，尽量减少气泡滞留可能性。通过电极材料的选择、电极结构的优化及电场强度的控制，来消减电击过程中电化学反应产物对电转染效果的不利影响。

实验方案设计：本实施例可供选择的平面电极材料的种类为铝、304不锈钢、纯金、不锈钢镀金、纯钛、加导电陶瓷涂层的钛，纯铂、钛镀铂、纯铱；

铝：作为电穿孔材料广泛用于电转染领域；

304不锈钢：生物亲和性好，成本低，最常用的医用金属材料；

不锈钢镀金：金具有稳定的化学和导电性能，具有良好的生物兼容性；

纯钛：具有良好生物兼容性的金属材料，广泛应用于生物医疗领域；

加导电陶瓷涂层的钛：苏州大学材料物理实验室提供，涂层材料为导电陶瓷，具有良好的抗氧化性能；

钛镀铂：稳定的阳极材料，广泛用于电解工业，并具有良好的生物兼容性；

纯金：具有极高的抗腐蚀的稳定性，良好的导电性和导热性，极易加工成形，并很容易镀到其它金属和陶器及玻璃的表面上

纯铂：化学性质极稳定，不溶于强酸强碱溶液，具有催化活性，可做抗癌药物。

纯铱：化学性质非常稳定，不溶于王水，铱在高技术领域中得到广泛的使用，如航天技术，制药和汽车行业。

将上述材料制成长×宽×厚为15×10×2mm的平面电极。同实施例一，用CNC或3D打印制作带有两个凹陷窗口的支架，所述凹陷窗口的尺寸与上述平面电极的尺寸一致。将上述材料制成的平面电极嵌入凹陷窗口中，再将支架封装，形成一个带有流体流入口和流出口的电穿孔室。将上述已嵌入支架中的两片电极分别连接脉冲电源输出端的正负极，制成一个电穿孔装置。

试验一，在空缓冲液条件下(是指缓冲液中没有细胞和生物活性物质)，选择加导电陶瓷涂层的钛平面电极、铝电极、不锈钢镀金电极、纯钛电极、钛镀铂电极，使用150V电压，11ms脉宽，电击次数为1次，间隔为2352ms电转条件，30ml的电转体积电击测试组装电极稳定性，记录电击过程中的电流数据，实验结果参见图2，同时观察电转后溶液变化，参见图3-7，和平面电极表面变化，参见图8-12。

由图2可见，不锈钢镀金电极的电流从4A逐渐升高到5A；铝电极电流从4.5A迅速升高到5A，后电流一直在5A上下波动；加导电陶瓷涂层的钛平面电极电流从开始到结束都非常稳定，保持在 4.8A。加导电陶瓷涂层的钛电极、铝电极和钛镀铂电极电流相对稳定，不锈钢镀金电极电流逐渐上升，纯钛电极初期电流会下降，然后缓慢上升，后面逐步趋于平稳，并且电流波形发生变化。各种材料处理后溶液的变化由图3-7可见，加导电陶瓷涂层的钛平面电极会与溶液中的氯离子发生反应，电转后溶液变黄(图3)，析出的离子成分会对电转后细胞存活率造成影响，离心后无明显沉淀。

电击过程中，铝和不锈钢镀金材料，阳极发生剧烈氧化反应。铝电极的Al³⁺会与溶液中OH^-等反应产生白色沉淀(图4)，因此，产生氧化物会脱落到细胞溶液中，不可用作阳极材料。而不锈钢镀金平面电极表面的金脱落(图10)，溶液变成微黄(图5)。

上述三种材料均有产生白色泡沫团，其中铝电极产生最多，并且有白色沉淀物析出(图4)。

纯钛平面电极电击后，溶液未变色，但离心后有明显颗粒沉淀，且全部过程都存在沉淀(图6)。

钛镀铂平面电极电击后，溶液未变色，未见明显沉淀，离心后也无沉淀物(图7)。

电转后，将电极拆开，由图8-12可见，电转后加导电陶瓷涂层的钛平面电极表面未见明显氧化(图8)，而铝(图9)和不锈钢镀金平面电极阳极均有氧化，尤其不锈钢镀金平面电极的镀金层已脱落(图10)。纯钛电极阳极氧化形成氧化层(图11)，钛镀铂电极表面未见氧化(图12)。

试验二，将含有pMAX质粒(购于Lonza Human T cell NuCleofector Kit，货号：VAPA-1002)和CHO-S细胞(北京大学医学院周教授惠赠，周教授购于Life，货号R80007)及EL Buffer 电转缓冲液的流体从上述电穿孔装置底部逐渐注入电穿孔室中，选择不同的电极材料，分别经过在150V电压，11ms脉宽，电击次数为 1次，间隔为2352ms，以及在150V电压，5ms脉宽，电击次数为 3次，间隔为784ms条件下电场处理，然后从顶部开口处流出，对细胞进行培养，测定电转染率，细胞存活率等指标。

表1加导电陶瓷涂层的钛电极、铝电极、不锈钢镀金电极和纯钛电极在150V 11ms 1次条件下处理细胞实验结果

注释：TE：电转效率；VE：细胞存活率；MIX：综合效率；MFI：平均荧光强度；

上述四种电极材料电转结果表明，30ml电转体积，转染效率基本维持不变，有5％左右的波动，电转效率：纯钛＞加导电陶瓷涂层的钛＞铝＞不锈钢镀金；细胞存活率：纯钛＞加导电陶瓷涂层的钛＞不锈钢镀金＞铝；综合效率：纯钛＞加导电陶瓷涂层的钛＞铝＝镀金不锈钢；荧光强度：纯钛＞铝＞加导电陶瓷涂层的钛＞不锈钢镀金。

表2加导电陶瓷涂层的钛电极和钛镀铂电极在150V 5ms 3次条件下电转细胞实验结果

钛镀铂电极和加导电陶瓷涂层的钛电极在转染效率上个体间差异较小，但钛镀铂电极的存活率要比涂层电极高15％，二者的荧光强度基本一致，因此钛镀铂电极综合效率要高于加导电陶瓷涂层的钛电极。

虽然纯钛电极电转结果优于铝、不锈钢镀金电极，但纯钛电极的阳极会发生氧化，电场稳定性发生变化，而且在电转后溶液中观察到黑色物脱落，因此纯钛不适合作为阳极材料；而加导电陶瓷涂层的钛电极电转溶液会发黄。钛镀铂电极和加导电陶瓷涂层的钛电极电转效率接近，钛镀铂电极的细胞存活率更高，因此钛镀铂电极综合效率要高于加导电陶瓷涂层的钛电极。

实施例三

流体缓冲区域

如果支架进液口截面为圆形，而平面电极腔室区域截面为方形，直接从圆形变为方形，则容易产生滞留区，滞留区溶液流速为零，此区域为无效电转区，且易累积气泡。因此需要在进液口和平面电极区域增加缓冲区，平缓过渡，避免产生滞留区，确保平面电极区域内溶液流速稳定。理论上，缓冲区体积越大，则电极区流速越稳定。同理，在平面电极区和支架出液口之间也要增加缓冲区，避免快速收口，压强变化影响流速。缓冲区溶液内压强逐渐变大，方便电解产生的气泡流过时，容易在管壁上累积气泡，如果气泡无法及时排出，体积逐渐变大，缓冲区的作用被抵消，无法起到稳定流速的效果。这时需要考虑缓冲区的形状，首先收口的方式可以增加溶液内压强，有利于气泡排出。其次不能有拐角产生滞留区，最后外形过渡应平滑，溶液内压强不能有剧烈变化。

实验方案设计：在电穿孔室的顶部和底部分别设置流体缓冲区域(参见图13)，用于克服流体从支架进液口进入电穿孔室时的瞬间压强的改变，缓冲区域的形状设置成圆锥形、方形、弧形和梯形(参见图14)，选择钛镀铂平面电极进行电转染。

表3不同缓冲区形状电极在150V 5ms 3次电转条件下的电转效果

实验结果表明：圆锥形缓冲区域电穿孔装置在出液口处累积气泡变少，剩余气泡多累积在电极内部侧边直角处；方形缓冲区电穿孔装置在出液口积累大量气泡并在积累到一定量时一次排出，造成液流不均匀；弧形缓冲区电穿孔装置积累的气泡最少，电流最稳定，转染效率最高；梯形缓冲区电穿孔装置的气泡积累情况和转染效率则居中。

尽管已经用具体实施方式来说明和描述了本实用新型，然而应意识到，在不背离本实用新型的精神和范围的情况下，可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本实用新型范围内的所有这些变化和修改。