用于检测血液样品中肿瘤来源DNA的CpG甲基化的方法与流程
本发明涉及药物基因组学领域，并且特别地涉及在血液或血液来源样品中或在包含从肿瘤释放的dna的其他体液中检测来源于肿瘤的甲基化ankrd13b和/或foxf2dna的存在或不存在。这种检测可用于癌症的最低侵入性诊断，并且本发明提供了适于该目的的方法和寡核苷酸。
背景技术：
超过65年前，mandel和metais首次描述了其在人中存在细胞外核酸的观察结果(mandelp，metaisp.lesacidesnucleiquesduplasmasanguinchezl′homme.c.r.acad.sci.paris142，241-243.1948)，并且在四十多年后，可以明确证明，在从血浆、血清和其他体液分离的无细胞核酸中可以发现肿瘤相关的遗传改变(fleischhackerm，schmidtb.(2007)circulatingnucleicacids(cnas)andcancer--asurvey.biochimbiophysacta1775：181-232；jungk，fleischhackerm，rabiena.(2010)cell-freednainthebloodasasolidtumorbiomarker-acriticalappraisaloftheliterature.clinchimacta411：1611-1624)。这包括在不同形式的恶性肿瘤中观察到的表观遗传改变。dna甲基化是哺乳动物染色质的标志，并且已知在cpg二核苷酸背景下的胞嘧啶甲基化在调节发育中发挥作用并且在例如胚胎发生和细胞分化的基本生物学过程中具有重要意义(smithzd，meissnera.(2013)dnamethylation：rolesinmammaliandevelopment.natrevgenet14：204-220；gibneyer，nolancm.(2010)epigeneticsandgeneexpression.heredity(edinb)105：4-13)。因此，甲基化不仅调节基因转录，而且还在维持基因组稳定性、印记和x染色体失活中起作用。癌基因和肿瘤抑制基因中的表观遗传改变在癌症发生中具有关键的重要性(suvaml，riggin，bernsteinbe.(2013)epigeneticreprogrammingincancer.science339：1567-1570)。dna甲基化模式在癌细胞中极大地改变，并且因此可用于区分癌细胞与正常组织。因此，dna甲基化模式被用于诊断所有类型的癌症。比较近的理念是使用从肿瘤释放到例如血液中的游离循环肿瘤dna进行甲基化分析，作为患者体内肿瘤负荷的指示。这种分离并且用非常灵敏且高度特异性的方法表征来自肿瘤患者的细胞外核酸的能力产生术语“液体活检(liquidbiopsy)”。因此，医生不再仅仅依赖于组织活检和身体扫描的检查。
癌症越早期，治疗选择和治愈患者的机会就越好。因此，非常期望尽可能早地诊断癌症。然而，较早期癌症(其意味着肿瘤尺寸较小且癌细胞较少)释放较少的游离循环肿瘤dna。这由于以下事实而加剧：细胞外核酸的半衰期相当短，例如在血浆中短于6小时(ragoc，husodl，diehlf，karimb，liug等，(2007)serialassessmentofhumantumorburdensinmicebytheanalysisofcirculatingdna.cancerres67：9364-9370)。另一项困难是不得不在非肿瘤dna的高背景下检测少量甲基化肿瘤标志物dna，这极大地挑战了检测方法的灵敏度。使用基于在重亚硫酸盐转化(bisulfiteconversion)后选择性地扩增甲基化肿瘤dna的技术(例如甲基化特异性pcr(methylation-specificpcr，msp)并且尤其是heavymethyltm(hm)技术)已取得了非常好的结果(cottrell等，areal-timepcrassayfordna-methylationusingmethylation-specificblockers.nucleicacidsres.2004年1月13日；32(1)：e10)。
另一项困难是经常发生的在液体活检的背景dna中存在甲基化的非肿瘤dna，这取决于待检测的标志物和肿瘤。除非该背景非常低或最理想地不存在，否则可能难以区分健康对象与患有癌症的那些对象，因为液体活检中甲基化肿瘤dna的量通常非常低。到目前为止，该第二项困难已经被认可为由标志物和肿瘤提供，并且大部分通过提高特异性来解决，这导致检测灵敏度的丧失。然而，作为主要是癌症患者的替代，本发明人关注于健康对象的液体活检中的甲基化标志物以提高癌症检测的灵敏度和特异性。为此，他们不是筛选在来自肿瘤患者的样品中甲基化的标志物，而是筛选在健康对象的液体活检中未甲基化的潜在癌症标志物，以实现样品中甲基化非肿瘤dna的量最低或不存在。本发明人已出乎意料地发现，标志物ankrd13b和foxf2的甲基化基因组dna在健康对象的血液或血液来源样品中未发现或几乎未发现，并且这些标志物在癌组织中显示出明显的甲基化信号。这种特性对于标志物而言非常罕见，并且允许进行异常灵敏且特异性的检测。另外，本发明人鉴定出多种可以用这些标志物检测的癌症。根据这些发现调整的用于检测癌症的方法将通过提供最有希望的治疗时间窗口的可能性而允许改善对癌症患者的护理。
发明概述
在第一方面，本发明涉及用于检测来自对象之样品的具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna内和/或具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna内的dna甲基化的方法，所述样品包含来自血液的无细胞dna或是由其获得的样品。
在第二方面，本发明涉及用于在对象中检测癌症的存在或不存在或其风险的方法，其包括根据第一方面来检测dna甲基化。
在第三方面，本发明涉及选自引物、阻断剂(blocker)或探针的寡核苷酸，其具有与seqidno2至5或seqidno27至30的一段(stretch)连续核苷酸基本上相同或互补的序列。
在第四方面，本发明涉及至少包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸是第三方面的寡核苷酸。
在第五方面，本发明涉及第一方面或第二方面的方法、第三方面的寡核苷酸或第四方面的试剂盒用于诊断癌症、用于癌症预后、用于预测癌症治疗效果、用于评估针对癌症治疗的响应、用于监测癌症、用于筛选对象以检测提高的癌症可能性、或者用于对癌症或对象进行分类的用途。
在第六方面，本发明涉及用适于治疗癌症的癌症治疗方案在对象中治疗癌症的方法，其中已经根据第二方面的方法检测出癌症的存在。
附图说明
图1：优选靶区域的图谱。a：ankrd13b，b：foxf2。关于对seqidno的说明，参见表1。
图2：测定实例。a：ankrd13b，b：foxf2。dna序列在grch38基因组构建体的有义方向上。测定序列及其元件与在上方的基因组参照序列(基因组，示出了两条链)对齐。在基因组序列下方，示出了基因组dna的经重亚硫酸盐和pcr转化的有义链，其中非cpg背景下的c被转化为t(被重亚硫酸盐转化为u，其与a配对并通过扩增转化为t)。重亚硫酸盐链是用于扩增的初始模板。下面以灰色显示的反向互补链在通过扩增合成之前不可获得。所有dna单链序列根据其方向在两端标记有3′和5′。引物序列用下划线序列显示。其他寡聚物如阻断剂和探针以测定序列和基因组序列对齐显示。cpg背景下的胞嘧啶、其在相对链上的对应物和/或探针或阻断剂中间接或直接覆盖其的任何碱基以灰色背景显示。在不同情况下使用大写字母：对于所有基因组参照序列和对于其他链中未转化且与基因组序列相同的碱基。小写字母显示转化的碱基。
图3：对不同种类的样品用ankrd13b测定测量的dna甲基化的箱形图。在x轴下方的数字提供了进行了多少pcr反应以及其中有多少产生任何信号(＞0％)的信息，这是对数据进行定性分析的重要信息。平均甲基化以暗点显示。箱形图a提供了结直肠癌(colorectalcancer，crc)中诊断值的示例性信息：该标志物在来自正常患者的血浆中未显示出信号，在正常结肠组织中显示出非常少且低的信号，但在大多数结肠癌组织中显示出高信号，并且在对来自癌症患者的血浆进行的44％pcr反应中为阳性。箱形图b示出了两种正常组织类型和13种癌症组织类型。其提供了证据表明ankrd13b标志物是可用作胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌和前列腺癌中诊断性和/或预后性标志物的癌症标志物。
图4：对不同种类的样品用foxf2测定测量的dna甲基化的箱形图。平均甲基化以暗点显示。在x轴下方的数字提供了进行了多少pcr反应以及其中有多少产生任何信号(＞0％)的信息，这是对数据进行定性分析的重要信息。平均甲基化以暗点显示。箱形图a提供了结直肠癌(crc)中诊断值的示例性信息：该标志物在来自正常患者的血浆中几乎不显示信号，在正常结肠组织中显示出非常少且低的信号，但在大多数结肠癌组织中显示出高信号，并且在对来自癌症患者的血浆进行的76％pcr反应中为阳性。箱形图b示出了两种正常组织类型和13种癌症组织类型。其提供了证据表明foxf2标志物是可用作肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和食管癌中诊断性和/或预后性标志物的癌症标志物。
图5：对来自不同癌症类型的组织样品测量的两种癌症标志物ankrd13b和foxf2的平均甲基化[％]。两种标志物的聚类证明了分组(paneling)可以用于诊断癌症并且可以并行地指定一系列不同癌症的起源器官的范围。
图6：与具有极低量甲基化dna(50pg)的样品相比，来自健康个体的大体积血浆(合并的血浆)的ankrd13b测定实时pcr扩增曲线。
图7：与具有极低量甲基化dna(50pg)的样品相比，来自健康个体的大体积血浆的foxf2测定实时pcr扩增曲线。
图8：灰色：crc血浆的ankrd13b三重测定扩增曲线(和黑色：校准物)。点线曲线显示出如通过未甲基化septin9确定的未甲基化背景dna，虚线曲线显示出如通过甲基化septin9确定的crc肿瘤dna。直线显示出对ankrd13b测量的甲基化。
图9：灰色：crc血浆的foxf2三重测定扩增曲线(和黑色：校准物)。点线曲线显示出如通过未甲基化septin9确定的未甲基化背景dna，虚线曲线显示出如通过甲基化septin9确定的crc肿瘤dna。直线显示出对foxf2测量的甲基化。
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案之目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
优选地，本文使用的术语如“amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms：(iupacrecommendations)”，leuenberger，h.gw，nagel，b.和
在本说明书的文本通篇引用了数篇文献。无论是在上文还是在下文，本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明等)均在此通过引用整体并入。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明早于这些公开内容。
在下文，将对本发明的要素进行说明。这些要素随着一些具体实施方案列出，然而，应当理解，其可以以任何方式和以任意数量组合以产生另外的实施方案。多种描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于所明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并包括将明确描述的实施方案与任意数量的公开和/或优选要素进行组合的实施方案。此外，除非上下文另外说明，否则本申请中所有所述要素的任意排列和组合应均被视为通过本申请的描述而公开。
在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则词语“包括/包含”及其变化形式应理解为暗示包括所述整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。如本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容明确另外指出，否则未用数量词修饰的名词包括一个/种和/或更多个/种。
本发明的一些方面及其具体实施方案
在第一方面，本发明涉及用于检测来自对象之样品的具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna内和/或具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna内的dna甲基化的方法，所述样品包含来自血液的无细胞dna或是由其获得的样品。
在一个优选实施方案中，对象患有癌症的风险提高或被怀疑患有癌症，所述癌症选自胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌和前列腺癌(当针对seqidno：1检测dna甲基化时)，和/或所述癌症选自肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和食管癌(当针对seqidno：26检测dna甲基化时)，优选地如美国癌症协会(americancancersociety)所定义的。癌症可以是如下限定的任何亚型和阶段。
特别地，优选地当针对seqidno：1检测dna甲基化以诊断或筛选癌症时，以下一个或更多个风险因子可归于对象：
·胃癌：选自以下的一个或更多个风险因子：男性，50岁或更年长，种族(特别是西班牙裔美国人、非洲裔美国人或亚洲/太平洋岛民)，幽门螺杆菌(helicobacterpylori)感染，胃淋巴瘤，饮食富含熏制食品、咸鱼和肉类和/或泡菜，烟草消耗(特别是吸烟)，超重或肥胖，先前胃手术，恶性贫血，梅内特里耶病(menetrierdisease)(肥厚性胃病)，a型血，遗传性癌症综合征或诱因(predisposition)(包括遗传性弥漫性胃癌、遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynon-polyposiscolorectalcancer，hnpcc)、家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatouspolyposis，fap)、brca1和/或brca2突变、利-弗综合征(li-fraumenisyndrome)、波伊茨-耶格综合征(peutz-jegherssyndrome，pjs)、胃癌家族史(一级亲属，即父母、同胞兄弟姐妹或孩子)，非癌性胃息肉，eb病毒感染(epstein-barrvirusinfection)，职业(特别是煤炭、金属和橡胶行业的工人)，以及普通变异性免疫缺陷(commonvariableimmunedeficiency，cvid)。
·肝癌：选自以下的一个或更多个风险因子：45岁或更年长(特别是50岁或更年长)，男性，种族(特别是亚洲/太平洋岛民)，慢性病毒性肝炎，肝硬化，重度酒精使用(男性每天超过3或4个酒精单位，或者女性每天超过2或3个酒精单位；酒精单位定义为10ml(8g)纯酒精)，肥胖，2型糖尿病，遗传性代谢病(特别是导致肝硬化的那些，例如遗传性血色素沉着症、酪氨酸血症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、迟发性皮肤卟啉病、糖原贮积病、威尔逊病(wilsondisease))，暴露于致癌原(特别是黄曲霉毒素、氯乙烯和二氧化钍(thorotrast)、合成代谢类固醇、砷，寄生虫(特别是引起血吸虫病的那些)感染和烟草消耗(特别是吸烟)。
·结肠癌：选自以下的一个或更多个风险因子：50岁或更年长，个人结直肠息肉或结直肠癌病史(其中癌症完全移除)，个人炎性肠病病史，结直肠癌或腺瘤性息肉家族史(一级亲属)，具有遗传性综合征(例如家族性腺瘤性息肉病、lynch综合征(遗传性非息肉病性结肠癌或hnpcc)、特科特综合征(turcotsyndrome)、波伊茨-耶格综合征或mutyh相关息肉病)，种族(特别是非洲裔美国人或东欧血统的犹太人)，患有2型糖尿病，超重或肥胖，缺乏身体活动，烟草消耗(特别是吸烟)和重度酒精使用(如上限定)。
·卵巢癌：选自以下的一个或更多个风险因子：40岁或更年长(特别是63岁及更年长，并且更特别是绝经后)，女性，肥胖，35岁后首次足月妊娠或无妊娠，未使用生育控制丸(特别是从未使用或者在过去3个月、4个月或6个月内未使用)，暴露于生育药物(特别是克罗米芬柠檬酸盐)，暴露于雄激素、雌激素治疗和/或激素治疗，卵巢癌、乳腺癌或结直肠癌家族史(特别是在一级亲属中)，具有遗传性癌症综合征或诱因(例如遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征、pten肿瘤错构瘤综合征、遗传性非息肉病性结肠癌、波伊茨-耶格综合征、或mutyh相关息肉病)，个人乳腺癌病史，使用直接施用至生殖器区域的滑石粉，高脂饮食，使用镇痛药和烟草消耗(特别是吸烟)。
·食管癌：选自以下的一个或更多个风险因子：男性，50岁或更年长(特别是55岁或更年长)，胃食管反流性疾病，巴雷特食管(barrett’sesophagus)，烟草消耗(特别是吸烟)，重度酒精使用(如上限定)，超重或肥胖，饮食富含经加工肉类，经常饮用热液体，失弛缓症，胼胝症(tylosis)，普卢默-文森综合征(plummer-vinsonsyndrome)，职业(特别是暴露于化学烟雾如用于干洗的溶剂的工作)，过往食管损伤，其他癌症(例如肺癌、口腔癌或咽喉癌)的个人病史，和人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)感染。
·膀胱癌：选自以下的一个或更多个风险因子：烟草消耗(特别是吸烟)，职业(特别是暴露于芳族胺的工作和/或橡胶、皮革、纺织品、油漆和印刷行业的工人，以及机械师、理发师和卡车司机)，种族(特别是白人)，50岁或更年长(特别是55岁或更年长)，男性，慢性膀胱刺激和感染，个人膀胱癌或其他尿路上皮癌病史(完全移除的和/或其他亚型)，膀胱出生缺陷，膀胱癌家族史(特别是在一级亲属中)，具有遗传性综合征或诱因(例如视网膜母细胞瘤(rb1)基因突变、由pten基因中突变引起的考登病(cowdendisease)，或lynch综合征)，过往或当前环磷酰胺化学治疗，过往或当前利用对盆骨的辐射的放射治疗，暴露于吡格列酮、含有马兜铃酸的食品补充剂和/或饮用水中砷，以及低流体消耗。
·前列腺癌：选自以下的一个或更多个风险因子：50岁或更年长(特别是65岁或更年长)，男性，种族(特别是非洲裔美国人和非洲血统的加勒比海男性)，前列腺癌家族史(特别是在一级亲属中)，具有遗传性综合征或诱因(例如brca1或brca2基因突变，或lynch综合征)，饮食(特别是富含红肉或高脂肪乳制品)，肥胖，烟草消耗(特别是吸烟)，职业(特别是消防员)，前列腺炎症，性传播感染(特别是淋病或衣原体)和输精管切除术。
此外，优选地当针对seqidno：26检测dna甲基化以诊断或筛选癌症时，以下一个或更多个风险因子可归于对象：
·肺癌：选自以下的一个或更多个风险因子：烟草消耗(特别是吸烟)，暴露于氡，暴露于石棉，暴露于放射性矿石(例如铀)，吸入化学品或矿物质(例如砷、铍、镉、二氧化硅、氯乙烯、镍化合物、铬化合物、煤产品、芥子气或氯甲基醚)，吸入柴油机废气，对空气污染的暴露提高(例如由于在市中心工作和/或生活)，肺放射治疗，饮用水中有砷，个人肺癌病史(完全移除的和/或其他亚型)，以及肺癌家族史(特别是一级亲属)。
·结肠癌：选自上文关于seqidno：1限定的组的一个或更多个风险因子。
·乳腺癌：选自以下的一个或更多个风险因子：女性，45岁或更年长(特别是50或55岁或更年长)，具有风险提高的遗传性综合征或诱因(例如brca1、brca2、atm、tp53、chek2、pten、cdh1、stk11和/或palb2基因的突变)，乳腺癌家族史(特别是一级亲属)，在另一乳房部分中或另一个乳房中患有乳腺癌的个人病史，种族(特别是白人)，致密乳房组织(特别是乳房x线照片上为女性平均乳房密度的1.2至2倍的致密乳房)，良性乳房病症(例如(i)非增殖性病变，包括纤维化和/或单纯性囊肿、轻度增生、腺病(非硬化)、导管扩张、叶状肿瘤(良性)、单乳头状瘤、脂肪坏死、导管周纤维化、鳞状细胞化生和顶泌化生，以及上皮相关钙化；或(ii)无非典型的增殖性病变，包括通常的导管增生(无非典型)、纤维腺瘤、硬化性腺病、乳头状瘤(特别是乳头状瘤病)和放射状瘢痕；或(iii)非典型增殖性病变，包括非典型导管增生(atypicalductalhyperplasia，adh)和非典型小叶增生(atypicallobularhyperplasia，alh))，原位小叶癌，高于平均月经期数(例如由于在12岁之前行经和/或在55岁之后绝经)，先前胸部放射，己烯雌酚暴露，没有孩子或在30岁之后有第一个孩子(特别是与上面限定的年龄风险因子组合)，使用经口避孕药或贮库-乙酸甲羟孕酮，绝经后激素治疗，重度酒精使用(如上所限定)，超重或肥胖，以及缺乏身体活动。
·胃癌：选自上文关于seqidno：1限定的组的一个或更多个风险因子。
·食管癌：选自上文关于seqidno：1限定的组的一个或更多个风险因子。
在一个优选实施方案中，基因组dna包含至少一个cpg二核苷酸，优选至少2、3、4、5或6个cpg二核苷酸。通常，检测基因组dna中所包含的至少一个cpg二核苷酸，优选至少2、3、4、5或6个cpg二核苷酸的甲基化。
此外，优选地具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna具有seqidno：6、优选seqidno：11和/或16并且更优选seqidno：21中所包含序列。此外，优选地具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna具有seqidno：31和/或36、优选seqidno：41、更优选seqidno：46并且最优选seqidno：51中所包含序列。
在下文，特别是在标题“本发明的定义和另一些实施方案”下描述的定义和实施方案适用于第一方面的方法。
在第二方面，本发明涉及用于在对象中检测癌症的存在或不存在或其风险的方法，其包括根据第一方面来检测dna甲基化。
优选地，癌症选自胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌和前列腺癌(当针对seqidno：1检测dna甲基化时)和/或选自肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和食管癌(当针对seqidno：26检测dna甲基化时)。癌症可以是如下限定的任何亚型和阶段，即可以检测任何亚型和/或阶段的存在或不存在。
在一个优选实施方案中，
(i)存在显著量的具有seqidno：1中所包含序列的甲基化基因组dna指示存在胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌或前列腺癌或其风险，不存在显著量的具有seqidno：1中所包含序列的甲基化基因组dna指示不存在胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌和前列腺癌或其风险；
(ii)存在显著量的具有seqidno：26中所包含序列的甲基化基因组dna指示存在肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌或食管癌或其风险，不存在显著量的具有seqidno：26中所包含序列的甲基化基因组dna指示不存在肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和食管癌或其风险；
(iii)存在显著量的具有seqidno：1中所包含序列的甲基化基因组dna和显著量的具有seqidno：26中所包含序列的甲基化基因组dna指示存在胃癌、结肠癌或食管癌或其风险；以及
(iv)存在显著量的具有seqidno：1或seqidno：26中所包含序列的甲基化基因组dna并且不存在显著量的具有另一个中所包含序列的甲基化基因组dna指示存在根据(i)和(ii)组合指示的癌症或其风险。
优选地，在(iv)中，
(iv.a)存在显著量的具有seqidno：1中所包含序列的甲基化基因组dna，并且不存在显著量的具有seqidno：26中所包含序列的甲基化基因组dna指示存在肝癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌或其风险；以及
(iv.b)不存在显著量的具有seqidno：1中所包含序列的甲基化基因组dna，并且存在显著量的具有seqidno：26中所包含序列的甲基化基因组dna指示存在肺癌或乳腺癌或其风险。
本文使用的术语“显著量的甲基化基因组dna”是指每ml所使用样品，优选每ml血液、血清或血浆至少x个甲基化靶dna分子的量。x可以为低至1并且通常为1至50(包括1和50)的值，特别是2、3、4、5、10、15、20、25、30或40。为了确定是否存在这样的显著量，可以但不一定必须对甲基化靶dna进行定量。如果不进行定量的话，也可以通过与标准品进行比较来进行测定，所述标准品例如包含基因组dna和其中一定量的完全甲基化dna(例如x个基因组的等同物)的标准品，其中x如上所述。该术语还可以是指样品中至少y％的甲基化靶dna的量(其中甲基化和未甲基化靶dna的总和为100％)，其中y可以为低至0.05并且通常为0.05至5(包括0.05和5)，优选0.05至1(包括0.05和1)，并且更优选0.05至0.5(包括0.05和0.5)的值。例如，y可以是0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0或5.0。
实施第一方面或第二方面的方法的一种优选方式包括以下步骤：
(a)将基因组dna中在5-位未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基；
(b)甲基化特异性地扩增经转化dna中的区域；
(c)检测步骤(b)中扩增的dna的存在或不存在；
其中扩增的dna的存在或不存在分别指示甲基化基因组dna的存在或不存在。
扩增优选地通过使用引物进行甲基化特异性pcr(即，依赖于一个或更多个cpg位点是否被转化来产生扩增子)来进行，所述引物是甲基化特异性的(并且对经重亚硫酸盐转化的dna具有特异性)或更优选地是甲基化非特异性的但对于经重亚硫酸盐转化的dna具有特异性的引物(即通过覆盖至少一个经转化c而仅与经转化dna杂交)。在后者的情况下，通过使用特异性地与经转化或未经转化cpg位点杂交从而终止pcr聚合的甲基化特异性阻断剂寡核苷酸来实现甲基化特异性。在一个最优选的实施方案中，扩增步骤包括pcr，优选实时pcr，特别是heavymethyltm或heavymethyltm-methylighttm。
换句话说，通过使用至少一种甲基化特异性寡核苷酸来甲基化特异性地扩增经转化dna中的区域。优选地，至少一种甲基化特异性寡核苷酸是引物或阻断剂。在一些具体实施方案中，通过使用一种或两种(即成对)甲基化特异性引物或通过使用两种(即成对)甲基化非特异性引物和一种或两种(即成对)甲基化特异性阻断剂来甲基化特异性地扩增经转化dna中的区域。
此外，至少一种甲基化特异性寡核苷酸(例如本文所述的引物、阻断剂或探针)优选地与seqidno2至5中的一段连续核苷酸基本上相同或互补以用于扩增由具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna，或者与seqidno27至30中的一段连续核苷酸基本上相同或互补以用于扩增由具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna。
可以如下所述，特别是通过实时pcr或通过下一代测序来检测扩增的dna的存在或不存在。
在一个优选实施方案中，检测步骤(b)中扩增的dna的存在或不存在包括确定步骤(b)中扩增的dna的量。该量可以用下面描述的检测手段，特别是通过实时pcr或通过下一代测序来确定。
此外，优选地通过使用至少一种甲基化特异性寡核苷酸来甲基化特异性地扩增经转化dna，所述至少一种甲基化特异性寡核苷酸与以下中的一段连续核苷酸基本上相同或互补：
-seqidno7至10，用于扩增由具有seqidno：6中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna；
-seqidno12至15，用于扩增由具有seqidno：11中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna；
-seqidno17至20，用于扩增由具有seqidno：16中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna；以及
-seqidno22至25，用于扩增由具有seqidno：21中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna。
此外，优选地通过使用至少一种甲基化特异性寡核苷酸来甲基化特异性地扩增经转化dna，所述至少一种甲基化特异性寡核苷酸与以下中的一段连续核苷酸基本上互补：
-seqidno32至35，用于扩增由具有seqidno：31中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna；
-seqidno37至40，用于扩增由具有seqidno：36中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna；
-seqidno42至45，用于扩增由具有seqidno：41中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna；
-seqidno47至50，用于扩增由具有seqidno：46中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna；以及
-seqidno52至55，用于扩增由具有seqidno：51中所包含序列的基因组dna获得的经转化dna。
在一个具体实施方案中，第二方面的方法还包括通过使用用于检测所指示癌症的一种或更多种其他手段来确认所指示癌症和/或缩小所指示癌症的范围。所述其他手段可以是癌症标志物(或“生物标志物”)或常规(非标志物)检测手段。癌症标志物可以是例如dna甲基化标志物、突变标志物(例如snp)、抗原标志物、蛋白质标志物、mirna标志物、癌症特异性代谢物或表达标志物(例如rna或蛋白质表达)。常规手段可以是例如活检(例如，具有或没有针对例如蛋白质或表达标志物的染色方法的可视活检检查)、成像技术(例如x射线成像、ct扫描、核成像如pet和spect、超声、磁共振成像(magneticresonanceimaging，mri)、温度记录法(thermography)、内窥镜检查、数字乳房x线照相术、结肠镜检查或虚拟结肠镜检查、腹腔镜检查、血管造影、骨扫描或乳腺癌的前哨淋巴结定位(sentinelnodemapping))或身体检查如触觉检查。如果所述其他手段用于确定指示的单一癌症，则优选地其是活检或对于指示癌症的组织移出对象的实体组织样品(即，不是例如血液的液体组织)并进行检查的其他手段。如果所述其他手段用于缩小所指示癌症的组的范围，则优选地其是非侵入性或最低侵入性手段。这样的手段可以是另外的标志物或例如成像技术或身体检查的常规手段。通常，所述其他手段适用于检测以下癌症，其存在通过具有seqidno：1和/或seqidno：26中所包含序列的基因组dna的dna甲基化的存在来指示。特别地，优选的是：
·对于胃癌，用于癌症检测的其他手段选自活检、内窥镜检查、超声、x射线、ct扫描、mri、pet扫描和腹腔镜检查；
·对于肝癌，用于癌症检测的其他手段选自身体检查、甲胎蛋白(alphafetoprotein，afp)血液检查、超声、ct扫描、mri、血管造影、活检和腹腔镜检查；
·对于结肠癌，用于癌症检测的其他手段选自结肠镜检查、贫血和/或癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cea)血液检查、cr扫描、mri、超声、x射线和pet扫描；
·对于卵巢癌，用于癌症检测的其他手段选自身体检查，超声，ct扫描，x射线，mri，pet扫描，腹腔镜检查，活检，ca-125、人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，hcg)、甲胎蛋白(afp)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，ldh)、抑制素、雌激素和/或睾酮的血液检查，以及结肠镜检查；
·对于食管癌，用于癌症检测的其他手段选自x射线、上部内窥镜检查、超声内镜、支气管镜检查、活检、ct扫描、mri和pet扫描；
·对于膀胱癌，用于癌症检测的其他手段选自细胞检查、肿瘤细胞尿检、活检(特别是膀胱肿瘤的经尿道切除)、ct扫描、mri和pet扫描；
·对于前列腺癌，用于癌症检测的其他手段选自psa测试、dre测试、pca3测试、超声(特别是经直肠超声)、活检、mri、mri融合活检和ct扫描；
·对于肺癌，用于癌症检测的其他手段选自活检，检测egfr、alk、kras、braf、her2、ros1和/或ret基因中一个或更多个(特别是egfr和/或alk)中的突变，痰细胞学、支气管镜检查、针吸活检或芯活检(corebiopsy)、胸腔穿刺术、胸腔镜检查、纵隔镜检查、胸廓切开术、支气管内超声、内镜食管超声、ct扫描、pet扫描和mri扫描；
·对于乳腺癌，用于癌症检测的其他手段选自乳房x线照相术、超声、mri、活检、全血细胞计数、血清化学和身体检查。
在一个优选实施方案中，所述其他手段适合于检测：
(i)胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌和/或优选地或前列腺癌或其风险以用于确认使用具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna对癌症存在的确定和/或缩小其范围，优选地如果在其中检测出dna甲基化的话；
(ii)肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和/或优选地或食管癌或其风险，以用于确认使用具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna对癌症存在的确定和/或缩小其范围，优选地如果在其中检测出dna甲基化的话；
(iii)-胃癌、结肠癌和/或优选地或食管癌或其风险，使用具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna和具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna，优选地如果在二者中都检测出dna甲基化的话，
-肝癌、卵巢癌、膀胱癌或前列腺癌或其风险，使用具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna和具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna，优选地如果在前者中检测出但在后者中未检测出dna甲基化的话，
-肺癌或乳腺癌或其风险，使用具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna和具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna，优选地如果在前者中未检测出但在后者中检测出dna甲基化的话，
以用于确认使用具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna和具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna对癌症存在的确定和/或缩小其范围。
关于第一方面给出的定义和描述的实施方案也适用于第二方面，只要其是适用的即可。此外，在下文，特别是在标题“本发明的定义和另一些实施方案”下描述的定义和实施方案适用于第二方面的方法。
在第三方面，本发明涉及选自引物、阻断剂或探针的寡核苷酸，其具有与seqidno2至5或seqidno27至30中的一段连续核苷酸基本上相同或互补的序列。
优选地，寡核苷酸具有与选自seqidno7至10、12至15、17至20和22至25或者选自seqidno32至35、37至40、42至45、47至50和52至55的seqidno中的一段连续核苷酸基本上相同或互补的序列。
通常，寡核苷酸至少包含1、2或3个二核苷酸，所述二核苷酸来自将seqidno：1(或seqidno：26或上述任一者的子序列)或其互补序列中cpg二核苷酸的c转化成t。在这种情况下，寡核苷酸是甲基化特异性寡核苷酸。该甲基化特异性寡核苷酸还对经重亚硫酸盐转化的dna具有特异性，因为其包含至少一个以下核苷酸，所述核苷酸来自将seqidno：1(或seqidno：26或上述任一者的子序列)或其互补序列中不在cpg背景下的c(例如，cpc、cpa或cpt二核苷酸中的c)转化成t。
或者，寡核苷酸也可以不包含来自将seqidno：1(或seqidno：26或上述任一者的子序列)或其互补序列中cpg二核苷酸的c转化成t的二核苷酸。在这种情况下，其是甲基化非特异性寡核苷酸，但对于经重亚硫酸盐转化的dna是特异性的，因为其包含至少一个来自将seqidno：1(或seqidno：26或上述任一者的子序列)或其互补序列中不在cpg背景下的c(例如，cpc、cpa或cpt二核苷酸中的c)转化成t的核苷酸。然而，甲基化非特异性寡核苷酸可以用不能区分经转化c与未经转化c的错配或者用如本文限定的间隔物覆盖一个或更多个来自将seqidno：1(或seqidno：26或上述任一者的子序列)或其互补序列中cpg二核苷酸的c转化成t的二核苷酸。
探针优选地具有选自可检测标签和猝灭剂的一种或更多种修饰，和/或长度为5至40个核苷酸。此外，探针优选地是甲基化特异性寡核苷酸。阻断剂优选地具有选自不可延伸的3′末端和对聚合酶的5′核酸酶活性具有抗性的骨架的一种或更多种修饰，和/或长度为15至50个核苷酸。此外，阻断剂优选地是甲基化特异性寡核苷酸。引物的长度优选为10至40个核苷酸。特别地，引物可以是甲基化特异性寡核苷酸或甲基化非特异性寡核苷酸。
在一个具体实施方案中，阻断剂具有缺失3′和/或5′或添加多至5个核苷酸的根据seqidno：58的序列，和/或探针具有缺失3′和/或5′或添加多至5个核苷酸的根据seqidno：59的序列，其中添加优选地根据seqidno：1(即是阻断剂在seqidno：1中的延伸)。在另一个具体实施方案中，阻断剂具有缺失3′和/或5′或添加多至5个核苷酸的根据seqidno：62的序列，和/或探针具有缺失3′和/或5′或添加多至5个核苷酸的根据seqidno：63的序列，其中添加优选地根据seqidno：26(即是阻断剂在seqidno：26中的延伸)。
关于第一方面和第二方面给出的定义和描述的实施方案也适用于第三方面，只要其是适用的即可。此外，在下文，特别是在标题“本发明的定义和另一些实施方案”下描述的定义和实施方案适用于第三方面的寡核苷酸。
在第四方面，本发明涉及至少包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸是第三方面的寡核苷酸。
在其中寡核苷酸适合于实时pcr的试剂盒中，优选地第一寡核苷酸是根据第三方面的甲基化特异性探针，并且第二寡核苷酸是根据第三方面的甲基化特异性阻断剂或甲基化特异性引物。在一个优选实施方案中，第二寡核苷酸是甲基化特异性阻断剂。在该实施方案中，优选地试剂盒还包含根据第三方面的甲基化非特异性引物。
在其中寡核苷酸适合于pcr随后测序的试剂盒中，第一寡核苷酸是根据第三方面的引物，并且第二寡核苷酸也是根据第三方面的引物或根据第三方面的甲基化特异性阻断剂。在一个实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸是甲基化非特异性引物。优选地，这些引物是引物对，即正向引物和反向引物。该试剂盒用于甲基化和未甲基化靶dna(后者例如是非肿瘤背景dna)二者的同时扩增和测序，其中确定未甲基化靶dna的量以定量甲基化靶dna，如本文所述。在另一个实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸是甲基化特异性引物。优选地，这些引物是引物对，即正向引物和反向引物。在另一个实施方案中，第一寡核苷酸是甲基化非特异性引物，并且第二寡核苷酸是甲基化特异性阻断剂。这些试剂盒仅用于甲基化靶dna的扩增和测序。通常，优选的是，如果试剂盒包含引物和/或阻断剂，则引物和/或阻断剂成对出现，即作为正向与反向引物(或反之亦然)和/或正向与反向阻断剂(或反之亦然)出现。正向阻断剂是阻断从正向引物延伸的阻断剂，并且反向阻断剂是阻断从反向引物延伸的阻断剂。
关于第一方面、第二方面和第三方面给出的定义和描述的实施方案也适用于第四方面，只要其是适用的即可。此外，在下文，特别是在标题“本发明的定义和另一些实施方案”下描述的定义和实施方案适用于第四方面的试剂盒。
在第五方面，本发明涉及第一方面或第二方面的方法、第三方面的寡核苷酸或第四方面的试剂盒用于诊断癌症、用于癌症预后、用于预测癌症治疗效果、用于评估针对癌症治疗的响应、用于监测癌症、用于筛选对象以检测提高的癌症可能性、或用于对癌症或对象进行分类的用途。
关于第一方面、第二方面、第三方面和第四方面给出的定义和描述的实施方案也适用于第五方面，只要其是适用的即可。此外，在下文，特别是在标题“本发明的定义和另一些实施方案”下描述的定义和实施方案适用于第五方面的用途。
在第六方面，本发明涉及用适于治疗癌症的癌症治疗方案在对象中治疗癌症的方法，其中已经根据第二方面的方法检测出癌症的存在。换句话说，本发明涉及适于治疗癌症的癌症治疗在其中已经根据第二方面的方法检测出癌症存在的对象中的用途。本发明还涉及以下方法，其包括第二方面的方法并且随后将对象转至进行这样的癌症治疗。以下给出了癌症治疗方案的定义和另一些实施方案。
关于第一方面、第二方面、第三方面、第四方面和第五方面给出的定义和描述的实施方案也适用于第六方面，只要其是适用的即可。此外，在下文，特别是在标题“本发明的定义和另一些实施方案”下描述的定义和实施方案适用于第六方面的方法。
本发明的定义和另一些实施方案
本说明书使用多个术语和短语，其具有如下定义的某些含义。优选的含义应解释为本文所述的本发明各方面的优选实施方案。因此，其以及下文所述的另一些实施方案可以与本发明各方面的任何实施方案，特别是上文所述的本发明各方面的任何优选实施方案组合。
本文使用的术语“检测dna甲基化”是指至少定性地分析甲基化靶dna的存在或不存在。甲基化优选地在靶dna的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、10个或更多个、15个或更多个或者30个或更多个cpg位点处确定。通常来说，所分析的cpg位点在癌症中是共同甲基化的，使得相邻dna的cpg位点也被甲基化，并且可另外地或替代地进行分析。“至少定性地”意指也可以进行甲基化靶dna(如果存在的话)的定量测定。这种“确定....的量”可以如本文所述进行。
扩增的dna的存在或不存在可以通过本领域已知的任何手段进行检测，例如放射自显影术、银染或溴化乙锭染色。优选地，通过实时pcr或通过对扩增的dna进行测序来检测步骤(b)中扩增的dna的存在或不存在。特别地，如果并行地检测3种或更多种(例如4种或更多种，或者5种或更多种)不同的靶dna(即标志物)(例如根据seqidno1的dna内的靶dna、根据seqidno26的dna内的靶dna以及一种或更多种另外的靶dna)，则优选地通过测序来检测扩增的dna的存在或不存在。
在实时pcr中，优选地通过使用作为探针的甲基化特异性寡核苷酸来检测步骤(b)中扩增的dna的存在。优选地使用甲基化特异性引物或甲基化特异性阻断剂与甲基化非特异性引物来甲基化特异性地扩增dna。
通过测序的检测优选地是通过下一代测序的检测。其中，样品中经转化的(例如经重亚硫酸盐转化的)甲基化靶dna可以被甲基化特异性地扩增。然后，对扩增的序列进行测序，并且由来源于扩增的经转化靶dna的序列或序列读出的存在推断出甲基化模板的存在。
通常，定量(例如确定甲基化靶dna的量)可以是绝对的，例如以pg/ml或ng/ml样品、每ml样品的拷贝数、pcr循环数等计，或者定量可以是相对的，例如，比对照样品中的高10倍或作为参照对照的甲基化的百分比。确定样品中甲基化靶dna的量可以包括对样品中总dna的量归一化。受试样品中总dna的量的归一化优选地包括计算甲基化靶dna的量与(i)参照位点的dna的量或(ii)靶标的总dna的量(例如，甲基化靶dna的量加上未甲基化靶dna的量，后者优选地对反向链测量)的比。参照位点可以是任何基因组位点而不必是基因。优选地参照位点序列的出现次数在大群体中是稳定的或预期是稳定的(即恒定的)(例如，不是在重复片段中，即重复dna中)。参照位点可以是例如管家基因，例如β-肌动蛋白。
样品中甲基化靶dna的量可以表示为甲基化靶dna的量相对于包含基本上完全甲基化的基因组dna的参照样品中甲基化靶dna的量的比例。优选地，确定甲基化靶dna的比例包括确定参照样品中相同靶标的甲基化dna的量，优选通过使用参照位点的甲基化非特异性测量对总甲基化dna进行样品间归一化，并用由受试样品获得的比除以由参照样品获得的相应比。该比例可以通过将除法的结果乘以100来表示为百分比或以下定义的pmr。
术语“pmr”、“甲基化参照的百分比”或“完全甲基化参照的百分比”描述了甲基化的程度，并且通常通过用基因与参照之比除以基因与完全甲基化参照之比(例如通过cpg甲基转移酶，例如正常未甲基化参照的sssi处理获得的)并乘以100来计算。pmr的测定在ogino等(jmd2006年5月，第8卷，第2期)中详细描述，其通过引用并入。
甲基化靶dna的量也可以用δδct方法通过使用来自对象样品和校准物(cal)样品(在靶基因座甲基化)的靶标和参照位点(ref)的实时pcr循环阈值(ct)值如下来计算：δδct＝((ct靶标-ctref)-(ct靶标cal-ctrefcal))；pmr＝100*x-δδct，其中x是假定的pcr效率。通常，pcr效率假定为1至3，优选地其为2或约2(例如1.9至2.1)。
此外，甲基化靶dna的量可以通过测序，优选下一代测序来确定。其中，经转化的(例如经重亚硫酸盐转化的)靶dna可以被甲基化非特异性地扩增，即靶dna无论其是否甲基化(换句话说无论cpg位点的胞嘧啶是否被转化)都被扩增。这可以通过不是甲基化特异性的重亚硫酸盐特异性引物来实现。然后，对扩增的序列进行测序并随后计数。计算来自经转化甲基化dna的序列(通过cpg位点在序列中鉴定)与来自经转化未甲基化dna的序列的比，得到甲基化靶dna的(相对)量。
优选地，甲基化靶dna的量通过测序而不是通过实时pcr来确定，特别是如果并行检测的标志物(即靶dna)的数目是3或更大，优选4或更大，并且更优选5或更大的话。优选地，甲基化dna的量是至少3个、更优选4至8个、最优选6个实验重复或平行实验的量。
术语“下一代测序”(ngs，也称为第二代或第三代测序)是指以下测序：由随着从dna模板链重新合成每个片段发出的信号顺序鉴定小dna片段的碱基。ngs以大规模并行的方式将这一过程延伸到数百万个反应中，而不是局限于单个或几个dna片段。这一进步使得能够对扩增的dna进行快速测序，最新的仪器能够在单次测序运行中产生数百个千兆碱基(gigabase)的数据。参见，例如，shendure和ji，naturebiotechnology26，1135-1145(2008)或mardis，annurevgenomicshumgenet.2008；9：387-402。合适的ngs平台可商购获得，例如roche454平台、roche454junior平台、illuminahiseq或miseq平台，或lifetechnologiessolid5500或iontorrent平台。
术语“校准物样品”是指包含具有已知dna浓度和已知靶标甲基化状态的对照dna的样品。对照dna优选但不一定是人工甲基化的、优选基本上完全甲基化的人dna。在一个优选实施方案中，人工甲基化通过使用dna-甲基转移酶来实现。dna本身可以是例如细胞系dna、质粒dna、人工dna、或其组合/混合物。
在靶基因座甲基化的dna优选是来自一个或更多个细胞系的细胞系dna，优选已经充分表征并且基因组靶标甲基化状态已知和/或已知靶标基本上完全甲基化的那些。基本上完全甲基化的基因组dna优选是全部或基本上全部cpg位点均甲基化的dna，特别是基因组dna。在这方面“基本上全部”意指至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。在一个优选实施方案中，全部或基本上全部cpg位点的甲基化通过以提供全部或基本上全部cpg位点的甲基化的方式用cpg甲基转移酶处理dna来实现。
本文使用的术语“甲基化”或“高甲基化”是指涉及向胞嘧啶或腺嘌呤dna核苷酸添加甲基的生化过程。在胞嘧啶(尤其是启动子区中的胞嘧啶)5位的dna甲基化可以具有降低基因表达的效应，并且已经在检测的每种脊椎动物中发现。在成体非配子细胞中，dna甲基化通常发生在cpg位点中。本文使用的术语“cpg位点”或“cpg二核苷酸”是指这样的dna区域，其中在沿其长度的线性碱基序列中胞嘧啶核苷酸紧接鸟嘌呤核苷酸出现。“cpg”是“c-磷酸-g”的简写，即胞嘧啶和鸟嘌呤通过仅一个磷酸隔开；在dna中磷酸将任意两个核苷连接在一起。使用“cpg”符号来将这种线性序列与胞嘧啶和鸟嘌呤的cg碱基配对区分开。cpg二核苷酸中的胞嘧啶可以被甲基化以形成5-甲基胞嘧啶。术语“cpg位点”或“基因组dna的cpg位点”还用于dna中前(未甲基化的)cpg位点的其中该cpg位点的未甲基化c被转化成如本文所述的另一种(例如，通过重亚硫酸盐转化成尿嘧啶)的位点。本申请提供了每个相关dna区域的基因组序列以及每个经转化链的重亚硫酸盐转化序列。提及的cpg位点始终是基因组序列的cpg位点，即使经转化的序列由于转化而不再包含这些cpg位点。特别地，在本发明背景下的甲基化意指高甲基化。术语“高甲基化”是指异常的甲基化模式或状态(即，一个或更多个核苷酸的甲基化的存在或不存在)，其中与来自对象之非癌细胞或者来自未患或未曾患过对该对象治疗之癌症(优选任何癌症)的对象(健康对照)的相同基因组dna相比，一个或更多个核苷酸(优选cpg位点的c)被甲基化。特别地，其是指相对于见于健康对照dna样品中相应cpg二核苷酸的5-mcyt的量，受试dna样品的dna序列内一个或复数个cpg二核苷酸处5-mcyt的存在提高。作为一种甲基化状态/模式的高甲基化可以在一个或更多个cpg位点处确定。如果使用多于一个cpg位点，可以单独地在每个位点处或一起考虑作为cpg位点的平均值来确定高甲基化。或者，所有评估的cpg位点都必须被甲基化，以使得满足高甲基化要求。
特别是在根据所提及seqidno的dna(“靶dna”)的区域中检测甲基化。本文使用的术语“靶dna”是指在特定染色体位置处的基因组核苷酸序列。在本发明的上下文中，其通常是已知在疾病状态下(例如在癌细胞中相对于在非癌细胞中)甲基化的遗传标志物。遗传标志物可以是基因组dna的编码区或非编码区。
本文使用的术语“靶dna的区域”或“经转化dna中的区域”是指待分析的靶dna的一部分。一般来说，该区域的长度为至少40、50、60、70、80、90、100、150或200或300个碱基对(bp)和/或不长于500、600、700、800、900或1000bp(例如40至500或80至500bp)。特别地，其是包含基因组dna的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个cpg位点的区域。优选地，这些位点不被用于扩增该区域的引物覆盖。优选地，这些cpg位点中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个(但未必全部，特别是被例如引物中的间隔物或甲基化非特异性错配覆盖的cpg位点)在靶dna中是甲基化的。
本发明的靶dna在图1和表1中给出。
本文使用的术语“样品”是指从对象获得的生物材料并且包含来自全部染色体的基因组dna，优选覆盖整个基因组的基因组dna。如果对象患有癌症，则样品包含来自癌细胞的无细胞基因组dna(包括靶dna)，优选来自癌细胞的循环基因组dna。
本文使用的术语“包含来自血液的无细胞dna的样品”是指包含来自血液的无细胞dna的体液样品。虽然在一个优选实施方案中该样品是血液，但该术语还包括其他体液。例如，尿液包含来自血液的无细胞dna。本文使用的术语“由包含来自血液的无细胞dna的样品获得的样品”是指通过体外处理获得的任何样品。例如，如果样品是血液，则优选的是，由其获得的样品是血浆或血清。
本文使用的术语“无细胞dna”或其同义词“cfdna”、“细胞外dna”，“循环dna”和“游离循环dna”是指未包含在作为样品或从中得到样品的相应体液中的完整细胞内而是在体液样品中自由循环的dna。无细胞dna通常是片段化的基因组dna，如下所述。
通常来说，在包含来自癌细胞的靶dna，尤其是细胞外靶dna的样品中，还存在来自非癌细胞的与来自癌细胞的靶dna相反未甲基化的靶dna。通常来说，来自非癌细胞的所述靶dna超过来自患病细胞的量至少10倍、至少100倍、至少1,000倍或至少10,000倍。一般来说，样品中所包含的基因组dna是至少部分片段化的。“至少部分片段化的”意指来自癌细胞的至少细胞外dna，特别是至少细胞外靶dna是片段化的。术语“片段化基因组dna”是指细胞(特别是癌细胞)的基因组dna的碎片，其是长dna的部分物理、化学和/或生物破碎形成较短长度的离散片段的结果。特别地，“片段化的”意指基因组dna(优选靶dna)的至少一些被片段化为短于1,500bp、1,300bp、1,100bp、1,000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp或100bp的片段。在该方面，“至少一些”意指至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或75％。
本文使用的术语“基因组dna”是指染色体dna，并且用于与编码dna区分开。因此，其包括属于基因的外显子、内含子以及调控序列，特别是启动子。
本文使用的短语“将dna中5位未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基”是指以这样的方式化学处理dna的过程：将全部或基本上全部的未甲基化胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶碱基或在碱基配对表现方面与胞嘧啶不相似的另一碱基，而使5-甲基胞嘧啶碱基保持不变。dna样品内未甲基化而不是甲基化的胞嘧啶碱基的转化用转化剂来进行。本文使用的术语“转化剂”涉及能够将未甲基化胞嘧啶转化成尿嘧啶或在杂交性质方面与胞嘧啶可检测地不相似的另一碱基的试剂。转化剂优选为重亚硫酸盐，例如焦亚硫酸盐(disulfite)或亚硫酸氢盐(hydrogensulfite)。根据标准程序(frommer等，1992，procnatlacadsciusa89：1827-31；olek，1996，nucleicacidsres24：5064-6；ep1394172)进行反应。也可酶促地，例如通过使用甲基化特异性胞苷脱氨酶来进行转化。最优选地，转化剂是重亚硫酸钠或重亚硫酸盐。
本文使用的术语“扩增”或“产生扩增子”是指靶核酸及其互补序列或者特别是它们区域的拷贝数的提高。扩增可以通过使用本领域已知的任何方法来进行。核酸的扩增包括在扩增过程期间需要多个循环的方法或在单一温度下进行的方法。循环技术的实例是需要热循环的方法。需要热循环的方法包括本领域中众所周知的聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)。pcr包括通过热变性将双链dna变性为单链dna，使引物与单链dna退火，并由引物合成互补链。等温扩增是在单一温度下进行的或者其中扩增过程的主要方面在单一温度下进行的扩增。在pcr过程中，反应产物被加热以使两条链分离，使得另一个引物可以与模板结合。相反，等温技术依赖于链置换聚合酶来使双链的两条链分离并重新拷贝模板。等温技术可以分为依赖于引物替代来引发反复模板拷贝的方法，以及依赖于单引物分子的继续重复使用或新合成的那些。依赖于引物替代的方法包括解旋酶依赖性扩增(helicasedependantamplifcation，hda)、核酸外切酶依赖性扩增、重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)和环介导扩增(loopmediatedamplification，lamp)。依赖于单引物分子的继续重复使用或新合成的方法包括链置换扩增(stranddisplacementamplification，sda)或基于核酸的扩增(nasba和tma)。
优选地使用甲基化非特异性但对经重亚硫酸盐转化的dna具有特异性(即，通过覆盖至少一个经转化的c而仅与经转化dna杂交)的引物通过甲基化特异性pcr(即，根据一个或更多个cpg位点是否被转化来产生扩增子)来进行扩增。甲基化特异性通过使用甲基化特异性阻断剂寡核苷酸来实现，其与经转化或未经转化的cpg位点特异性杂交，并且由此终止pcr聚合。在一个最优选的实施方案中，扩增步骤包括实时pcr，特别是heavymethyltm或heavymethyltm-methylighttm。或者，甲基化特异性pcr可以使用甲基化特异性引物并且不使用阻断剂。
本文使用的术语heavymethyltm是指这样的测定，其中覆盖扩增引物之间或被扩增引物覆盖的cpg位置的甲基化特异性阻断探针(在本文也称为阻断剂)使得靶dna或其区域的甲基化特异性选择性扩增成为可能。
术语“methylighttm”是指利用基于荧光的实时pcr技术的高通量定量甲基化测定，其在pcr步骤后不需要进一步的操作(eads等，cancerres.59：2302-2306，1999，其通过引用并入本文)。简言之，methylighttm方法以在例如重亚硫酸钠反应中根据标准程序被转化成具有甲基化依赖性序列差异的混合合并物(该重亚硫酸盐过程将未甲基化胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)的基因组dna的混合样品开始。随后，在“有偏”(采用与已知cpg二核苷酸重叠的pcr引物)反应中进行基于荧光的pcr。序列区分可以发生在扩增过程的水平和荧光检测过程的水平二者。其可以用作基因组dna样品中甲基化模式的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交的水平。在该定量形式中，pcr反应实现在与特定的推定甲基化位点重叠的荧光探针存在下进行甲基化特异性扩增。输入dna的量的无偏对照由其中引物和探针都不与任何cpg二核苷酸重叠的反应来提供。术语“heavymethyltmmethylighttm”测定是指为methylighttm测定的变化形式的heavymethyltmmethylighttm测定，其中methylighttm测定与覆盖扩增引物之间的cpg位置的甲基化特异性阻断探针组合。
当用于寡核苷酸时，术语“退火”应理解为在中等或严格杂交条件下，样品dna中寡核苷酸沿watson-crick碱基配对的线路与至少基本上互补的序列键合，从而形成双链体结构。当用于单个核苷酸或碱基时，其是指根据watson-crick碱基配对的结合，例如c-g、a-t和a-u。严格杂交条件包括在68℃下在5×ssc/5×denhardt溶液/1.0％sds中杂交，并在室温下在0.2×ssc/0.1％sds中洗涤，或者包括其本领域公认的等同条件(例如这样的条件：其中在60℃下在2.5×ssc缓冲液中进行杂交，随后在37℃下在低缓冲液浓度下进行数个洗涤步骤，并保持稳定)。中等条件包括在42℃下在3×ssc中洗涤，或其本领域公认的等同条件。可改变盐浓度和温度的参数以获得探针与靶核酸之间的识别的最佳水平。在本领域可获得关于这些条件的指南，例如，sambrook等，1989，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborpress，n.y；和ausubel等(编辑)，1995，currentprotocolsinmolecularbiology，(johnwiley&sons，n.y.)，单元2.10。
“基本上互补的”意指寡核苷酸不需要反映模板的确切序列，并且可以包含如本文所限定的错配和/或间隔物。“基本上相同的”意指寡核苷酸不需要与参照序列100％相同，而可以包含如本文所限定的错配和/或间隔物。优选地，基本上互补或相同的寡核苷酸包含1至3个，即1、2或3个错配和/或间隔物，优选每个寡核苷酸一个错配或间隔物，使得预期的退火不会由于错配和/或间隔物而失败。为了尽管存在错配和/或间隔物仍能够进行退火，优选地寡核苷酸每该寡核苷酸的10个核苷酸包含不多于1个错配(如果第一个小数是5或更高，则进位，否则舍去)。
本文使用的术语“寡核苷酸”是指5至50个核糖核苷酸或优选脱氧核糖核苷酸的线性寡聚物。优选地，其具有单链dna片段的结构。
本文使用的术语“引物寡核苷酸”是指与试图拷贝的核酸序列(模板)基本上互补的单链寡核苷酸序列，并且用作合成引物延伸产物的起始点。优选地，引物寡核苷酸的长度为10至40个核苷酸，更优选15至30个核苷酸，并且最优选19至25个核苷酸。
本文使用的术语“阻断剂”是指这样的分子，其以甲基化特异性方式与dna的单链结合(即，其对经转化的甲基化dna或优选经转化的未甲基化dna或者由其获得的扩增dna具有特异性)并且通过与该单链结合，例如通过在其结合处阻止引物结合或阻止引物延伸来阻止dna的扩增。阻断剂的非限制性实例是序列和/或甲基化特异性抗体(阻断例如引物结合或聚合酶)，特别是阻断剂寡核苷酸。
“阻断剂寡核苷酸”可以是阻止位于阻断剂寡核苷酸上游的引物延伸的阻断剂。其包含具有对聚合酶的5’核酸酶活性有抗性的骨架的核苷/核苷酸。这可以通过例如包含以下来实现：肽核酸(peptidenucleicacid，pna)、锁核酸(lockednucleicacid，lna)、吗啉代、二醇核酸(glycolnucleicacid，gna)、苏糖核酸(threosenucleicacid，tna)、桥连核酸(bridgednucleicacid，bna)、n3’-p5’氨基磷酸酯(n3’-p5’phosphoramidate，np)寡聚物、小沟结合剂连接的寡核苷酸(mgb-连接的寡核苷酸)、硫代磷酸酯(ps)寡聚物、crc4烷基膦酸酯寡聚物、氨基磷酸酯、β-磷酸二酯寡核苷酸、a-磷酸二酯寡核苷酸、或其组合。或者，其可以是在dna单链上具有与引物寡核苷酸的结合位点重叠的结合位点的不可延伸的寡核苷酸。当阻断剂结合时，引物无法结合，并且因此不产生扩增子。当阻断剂不结合时，引物结合位点是可及的并且产生扩增子。对于这样的重叠阻断剂，优选地，阻断剂对dna的亲和力高于引物对dna的亲和力。阻断剂寡核苷酸的长度通常为15至50、优选20至40并且更优选25至35个核苷酸。“至少一种阻断剂”特别地是指1、2、3、4或5种阻断剂，更特别地是指1至2或1至3种阻断剂的数量。此外，由于不可延伸的3’端，阻断剂寡核苷酸本身不能作为引物(即，不能通过聚合酶延伸)。
本文使用的术语“探针寡核苷酸”或“探针”是指用于通过与扩增子的一条链退火来检测扩增子的寡核苷酸，其通常不在任何引物寡核苷酸结合处(即，不与该条链中与引物寡核苷酸所退火的序列区段重叠的序列区段结合)。优选地，其退火没有错配或间隔物，换言之，其优选地与扩增子的一条链互补。探针寡核苷酸的长度优选为5至40个核苷酸，更优选10至25个并且最优选25至20个核苷酸。通常来说，探针与允许检测扩增子的至少一个可检测标签和/或允许猝灭(优选地)可检测标签的信号的至少一个猝灭剂连接，优选共价连接。本文使用的术语“可检测标签”不表现出任何特别的限制。可检测标签可选自放射性标签、发光标签、荧光染料、具有酶活性的化合物、磁性标签、抗原、以及对可检测标签具有高结合亲和力的化合物。例如，与探针连接的荧光染料可以用作检测标签，例如在实时pcr中。合适的放射性标记是p-32、s-35、i-125和h-3；合适的发光标记是化学发光化合物，优选鲁米诺；以及合适的荧光标记优选为丹酰氯、5-异硫氰酸荧光素和4-氟-7-硝基苯-2-氮杂-1，3-二唑，特别是6-羧基荧光素(fam)、6-六氯荧光素(hex)、5(6)-羧基四甲基罗丹明(tamra)、5(6)-羧基-x-罗丹明(rox)、花青-5-荧光体(cy5)、及其衍生物；合适的酶标记是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶或生物素。探针也可以与猝灭剂连接。本文使用的术语“猝灭剂”是指使对应的可检测标签的信号失效或调节，例如通过能量转移、电子转移或通过化学机制进行的分子，如由iupac限定的(参见化学术语纲要第2版，1997)。特别地，猝灭剂调节作为荧光染料的可检测标签的光发射。在一些情况下，猝灭剂本身可以是在与其猝灭荧光的标签不同的特征性波长下发出荧光的荧光分子。在另一些情况下，猝灭剂本身不发荧光(即猝灭剂是“暗受体”)。这样的猝灭剂包括例如dabcyl、甲基红、qsy二芳基罗丹明染料等。
本文关于寡核苷酸使用的术语“覆盖cpg位点”是指该寡核苷酸与包含该cpg位点的dna区域退火，在cpg位点的c转化之前或之后(即，当提及经重亚硫酸盐转化的序列时，则为对应基因组dna的cpg位点)。对于cpg位点(或如果c被转化，则为前cpg位点)，退火可以如下文所述是甲基化特异性的或甲基化-非特异性的。
本文使用的术语“甲基化特异性的”通常是指依赖于cpg甲基化的存在或不存在。
本文关于寡核苷酸使用的术语“甲基化特异性的”意指基于至少一个cpg位点的c在转化之前是未甲基化的还是甲基化的，即基于c是否已被转化，寡核苷酸与或不与dna单链(其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基，并且其中其在转化之前包含至少一个cpg位点)退火，且没有与该至少一个cpg位点中c的位置相关的错配。甲基化特异性可以是阳性的(如果c未被转化，则寡核苷酸退火而没有所述错配)或者是阴性的(如果c被转化，则寡核苷酸退火而没有所述错配)。为了防止寡核苷酸与其特异性相反的退火，其优选地在转化前覆盖至少2、3、4、5或6，并且优选3至6个cpg位点。
本文使用的术语“甲基化非特异性的”通常是指不依赖于cpg甲基化的存在或不存在。
本文关于寡核苷酸使用的术语“甲基化非特异性的”意指不管至少一个cpg位点的c在转化之前是未甲基化的还是甲基化的，即不管c是否已经被转化，寡核苷酸均与dna单链(其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交的另一碱基，并且其中其在转化前可包含或可不包含至少一个cpg位点)退火。在一种情况下，与寡核苷酸退火的dna单链的区域不包含任何cpg位点(在转化之前和之后)，并且仅仅为此，该寡核苷酸是甲基化非特异性的。当甲基化非特异性寡核苷酸可以覆盖一个或更多个cpg二核苷酸时，其用错配和/或间隔物这样做。本文使用的术语“错配”是指dna中的碱基对错配，更具体地，不能形成正常碱基配对相互作用的碱基对(即，除“a”与“t”或“u”，或“g”与“c”之外)。
根据第三方面的寡核苷酸，即探针、阻断剂或引物，也可以用snp非特异性错配或用间隔物覆盖snp位点。
本文使用的术语“snp位点”是指“snp”的位点，即在个体群中变化的(优选人)基因组中特定位置的单核苷酸多态性。本申请涉及的基因组dna的snp是本领域已知的，并且可见于在线数据库，例如ncbi的dbsnp(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)。
本文使用的术语“snp非特异性错配”是指由于以下核苷酸替换的错配，所述核苷酸替换不是用对应于见于同一群体中另一个体的基因组中相同位置之核苷酸的核苷酸替换核苷酸。
本文使用的术语“间隔物”是指非核苷酸间隔物分子，其在连接两个核苷酸时将两个核苷酸之间的距离提高至约一个核苷酸的距离(即，这两个核苷酸相隔的距离，如果其通过第三个核苷酸连接的话)。间隔物的非限制性实例是肌苷、d-尿嘧啶、卤代碱基、氨基-dt、c3、c12、间隔物9、间隔物18和dspacer)。
本文使用的术语“反映”应理解为意指“是...的结果”或“显示”。
本文使用的短语“用于在对象中检测癌症的存在或不存在的方法”是指确定对象是否患有癌症。如本领域技术人员理解的，这样的评估通常可能不是对100％的对象都是准确的，但其优选地是准确的。然而，该术语要求，可以对对象的统计学显著部分做出准确指示。某一部分是否是统计学显著的可以容易地由本领域技术人员使用几种公知的统计学评价工具来确定，所述工具例如置信区间的确定、p值的确定、studentt检验、mann-whitney检验等。详细信息在dowdy和wearden，statisticsforresearch，johnwiley&sons，newyork1983中提供。优选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％。p值优选为0.05、0.01或0.005。
关于用于在对象中检测癌症的存在或不存在的方法的术语“其风险”是指发生癌症的提高的风险或患有癌症的提高的可能性的检测。如果根据可归于其的一个或更多个风险因子(如本文所限定)对象已经具有提高的风险，则“其风险”是指进一步提高的风险，即作为由于那些风险因子的风险的补充。
本文使用的术语“癌症”是指涉及异常细胞生长并具有侵入或扩散到身体其他部位的潜力的一大家族的疾病。细胞形成赘生物(neoplasm)或肿瘤的子集。赘生物或肿瘤是这样的细胞组，其经历不受调控的生长，并且通常会形成团或块，但可扩散分布。优选地，术语“癌症”由以下一个或更多个特征来限定：
-生长信号传导的自给自足，
-对抗生长信号不敏感，
-逃避凋亡，
-实现无限的复制潜力，
-血管生成的诱导和持续，和/或
-转移活化和组织侵袭。
关于本发明的癌症优选地选自肝癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、颈癌、肾癌、甲状腺癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌和卵巢癌。
术语“胃癌”以最广泛的含义使用，并且是指在胃中开始的所有癌症。其包括在胃中开始的以下亚型：腺癌、淋巴瘤、胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromaltumor，gist)、类癌瘤和鳞状细胞癌、小细胞癌和平滑肌肉瘤。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：0期(tis，n0，m0)、ia期(t1，n0，m0)、ib期(t1，n1，m0；或t2，n0，m0)、iia期(t1，n2，m0；t2，n1，m0；或t2，n0，m0)、iib期(t1，n3，m0；t2，n2，m0；t3，n1，m0；或t4a，n0，m0)、iiia期(t1，n2，m0；t2，n1，m0；或t2，n0，m0)、iiib期(t3，n3，m0；t4a，n2，m0；或t4b，n0或n1，m0)、iiic期(t4a，n3，m0；或t4b，n2或n3，m0)和iv期(任意其他t，n和m)。
术语“肝癌”以最广泛的含义使用，并且是指在肝中开始的所有癌症。其包括以下亚型：肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)、胆管癌(胆管癌症)、血管肉瘤和肝母细胞瘤。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：i期(t1，n0，m0)、ii期(t2，n0，m0)、iiia期(t3a，n0，m0)、iiib期(t3b，n0，m0)、iiic期(t4，n0，m0)、iva期(任意t，n1，m0)、ivb期(任意t，任意n和m1)。
术语“食管癌”或“食道癌”以最广泛的含义使用，并且是指在食管中开始的所有癌症。其包括以下亚型：食管鳞状细胞癌和食管腺癌。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：对于鳞状细胞癌：0期(tis，n0，m0，gx或g1)、ia期(t1，n0，m0，gx或g1)、ib期(t1，n0，m0，g2或g3；或t2或t3，n0，m0，gx或g1)、iia期(t2或t3，n0，m0，gx或g1，位置上部或中部；或t2或t3，n0，m0，g2或g3，位置下部)、iib期(t2或t3，n0，m0，g2或g3，位置上部或中部；或t1或t2，n1，m0)、iiia期(t1或t2，n2，m0；t3，n1，m0；或t4a，n0，m0)、iiic期(t4a，n1或n2，m0；t4b，任意n，m0；或任意t，n3，m0)和iv期(任意t，任意n，m1)；对于腺癌：0期(tis，n0，m0，gx或g1)、ia期(t1，n0，m0，gx，g1或g2)，ib期(t1，n0，m0，g3；或t2，n0，m0，gx，g1或g2)、iia期(t2，n0，m0，g3)、iib期(t3，n0，m0；或t1或t2，n1，m0)、iiia期(t1或t2，n2，m0；t3，n1，m0；或t3，n2，m0)、iiic期(t4a，n1或n2，m0；t4b，任意n，m0；或任意t，n3，m0)和iv期(任意t，任意n，m1)。
术语“胰腺癌”以最广泛的含义使用，并且是指在胰中开始的所有癌症。其包括以下亚型：外分泌癌、内分泌癌、胰母细胞瘤(pancreatoblastoma)、胰腺肉瘤和淋巴瘤。外分泌癌包括腺癌，特别是导管腺癌，以及囊性肿瘤和腺泡细胞癌。内分泌癌包括胃泌素瘤、胰岛素瘤、生长抑素瘤、vipomas和高血糖素瘤。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：0期(tis，n0，m0)、ia期(t1，n0，m0)、ib期(t2，n0，m0)、iia期(t3，n0，m0)，iib期(t1-3，n1，m0)、iii期(t4，任意n，m0)和iv期(任意t，任意n，m1)。
术语“乳腺癌”以最广泛的含义使用并且是指在乳房中开始的所有癌症。其包括以下亚型：原位导管癌、侵入性导管癌(包括乳腺小管癌、乳腺髓样癌、乳腺黏液癌、乳腺乳头状癌和乳腺筛状癌)、侵入性小叶癌、炎性乳腺癌、原位小叶癌、男性乳腺癌、乳头佩吉特病(paget′sdiseaseofthenipple)和乳腺叶状肿瘤。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：0期(tis，n0，m0)、ia期(t1，n0，m0)、ib期(t0或t1，n1mi，m0)、iia期(t0或t1，n1(但不是n1mi)，m0；或t2，n0，m0)、iib期(t2，n1，m0；或t3，n0，m0)、iiia期(t0至t2，n2，m0；或t3，n1或n2，m0)、iiib期(t4，n0至n2，m0)、iiic期(任意t，n3，m0)和iv期(任意t，任意n，m1)。
术语“颈癌”或“头颈癌”以最广泛的含义使用并且是指在颈中或在头中开始的所有癌症。其包括以下亚型：喉癌、下咽癌、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、唾液腺癌以及口腔癌和口咽癌。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：0期(tis，n0，m0)、i期(t1，n0，m0)、ii期(t2，n0，m0)、iii期(t3，n0，m0；或t1至t3，n1，m0)、iva期(t4a，n0或n1，m0；或t1至t4a，n2，m0)、ivb期(t4b，任意n，m0，或任意t，n3，m0)和ivc期(任意t，任意n，m1)。
术语“肾癌”以最广泛的含义使用，并且是指在肾中开始的所有癌症。其包括以下亚型：肾细胞癌或rcc(包括透明细胞rcc、乳头状rcc、嫌色细胞rcc和集合管rcc)、移行细胞癌、维尔姆斯瘤(wilmstumor)和肾肉瘤。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：i期(t1，n0，m0)、ii期(t2，n0，m0)、iii期(t3，n0，m0；或t1至t3，n1，m0)和iv期(t4，任意n，m0；或任意t，任意n，m1)。
术语“甲状腺癌”以最广泛的含义使用，并且是指在甲状腺中开始的所有癌症。其包括以下亚型：分化型甲状腺癌(包括乳头状癌、滤泡癌和胡尔特尔细胞癌(hürthlecellcarcinoma))、甲状腺髓样癌、间变性癌(anaplasticcarcinoma)、甲状腺淋巴瘤和甲状腺肉瘤。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：对于小于45岁的患者中的乳头状或滤泡性(分化型)甲状腺癌：i期(任意t，任意n，m0)和ii期(任意t，任意n，m1)；对于45岁及更年长患者中的乳头状或滤泡性(分化型)甲状腺癌：i期(t1，n0，m0)、ii期(t2，n0，m0)、iii期(t3，n0，m0；或t1至t3，n1a，m0)、iva期(t4a，任意n，m0；或t1至t3，n1b，m0)、ivb期(t4b，任意n，m0)和ivc期(任意t，任意n，m1)；对于甲状腺髓样癌：i期(t1，n0，m0)、ii期(t2，n0，m0；或t3，n0，m0)、iii期(t1至t3，n1a，m0)、iva期(t4a，任意n，m0；或t1至t3，n1b，m0)、ivb期(t4b，任意n，m0)和ivc期(任意t，任意n，m1)；对于间变性(未分化型)甲状腺癌：iva期(t4a，任意n，m0)、ivb期(t4b，任意n，m0)和ivc期(任意t，任意n，m1)。
术语“前列腺癌”以最广泛的含义使用，并且是指在前列腺中开始的所有癌症。其包括以下亚型：腺癌、肉瘤、小细胞癌、神经内分泌肿瘤(除小细胞癌之外)和移行细胞癌。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：i期(t1，n0，m0，gleason评分为6或更低，psa小于10；或t2a，n0，m0，gleason评分为6或更低，psa小于10)、iia期(t1，n0，m0，gleason评分为7，psa小于20；t1，n0，m0，gleason评分为6或更低，psa为至少10但小于20；或t2a或t2b，n0，m0，gleason评分为7或更低，psa小于20)、iib期(t2c，n0，m0，任意gleason评分，任意psa；t1或t2，n0，m0，任意gleason评分，psa为20或更大；或t1或t2，n0，m0，gleason评分为8或更高，任意psa)、iii期(t3，n0，m0，任意gleason评分，任意psa)和iv期(t4，n0，m0，任意gleason评分，任意psa；任意t，n1，m0，任意gleason评分，任意psa；或任意t，任意n，m1，任意gleason评分，任意psa)。
术语“膀胱癌”以最广泛的含义使用，并且是指在膀胱中开始的所有癌症。其包括以下亚型：移行细胞(尿路上皮)癌(包括乳头状癌和扁平癌)、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌和肉瘤。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：0a期(ta，n0，m0)、0is期(tis，n0，m0)、i期(t1，n0，m0)、ii期(t2a或t2b，n0，m0)、iii期(t3a，t3b或t4a，n0，m0)和iv期(t4b，n0，m0；任意t，n1至n3，m0；或任意t，任意n，m1)。
术语“卵巢癌”以最广泛的含义使用并且是指在卵巢中开始的所有癌症。其包括以下亚型：良性上皮卵巢肿瘤、低恶性潜能肿瘤和恶性上皮卵巢肿瘤。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：ia期(t1a，n0，m0)、ib期(t1b，n0，m0)、ic期(t1c，n0，m0)、iia期(t2a，n0，m0)、iib期(t2b，n0，m0)、iiia1期(t1或t2，n1，m0)，iiia2期(t3a2，n0或n1，m0)、iiib期(t3b，n0或n1，m0)，iiic期(t3c，n0或n1，m0)和iv期(任意t，任意n，m1)。
术语“结肠癌”或“结直肠癌”以最广泛的含义使用，并且是指(1)由大肠和/或直肠的上皮细胞产生的所有阶段和所有形式的癌症，和/或(2)影响大肠和/或直肠的内衬(lining)的所有阶段和所有形式的癌症。其包括各自起源于结肠(结肠癌)或直肠(直肠癌)的以下亚型：腺癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质瘤、原发性结直肠淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤或鳞状细胞癌。在用于结直肠癌分类的分期系统中，结肠和直肠被视为一个器官。其还包括以下阶段(如由括号中对应的tnm分类所限定)：0期(tis，n0，m0)、i期(t1-t2，n0，m0)、iia期(t3，n0，m0)，iib期(t4a，n0，m0)、iic期(t4b，n0，m0)、iiia期(t1-t2，n1，m0；或t1，n2a，m0)、iiib期(t3-t4a，n1，m0；t2-t3，n2a，m0；或t1-t2，n2b，m0)、iiic期(t4a，n2a，m0；t3-t4a，n2b，m0；或t4bn1-n2m0)和iva期(任意t，任意n，m1a)、iva期(任意t，任意n，m1b)。
术语“肺癌”以最广泛的含义使用并且是指在肺中开始的所有癌症。其包括亚型小细胞肺癌(smallcelllungcancer，sclc)和非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)。本文使用的术语“sclc”或“小细胞肺癌”是指未分化的赘生物，优选由早期或胚胎期出现的细胞构成的未分化的赘生物。顾名思义，小细胞癌中的细胞比正常细胞更小，并且几乎没有任何细胞质的空间。本文使用的术语“nsclc”或“非小细胞肺癌”是指由于其预后和管理大致相同而分组在一起的一组异质性疾病，并且根据世界卫生组织/国际肺癌研究协会的组织学分类(traviswd等，histologicaltypingoflungandpleuraltumors.第3版.berlin：springer-verlag，1999)包括以下：
(i)占nsclc的30％至40％的鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma，scc)起始于较大的呼吸管，但生长较慢，意味着这些肿瘤的大小因诊断而异。
(ii)腺癌是nsclc中最常见的亚型，占nsclc的50％至60％，其起始于肺的气体交换表面附近，并且其包括可对治疗具有不同响应的亚型支气管肺泡癌。
(iii)大细胞癌是在肺表面附近生长的快速生长形式。其主要是排除诊断，当进行更多的研究时，通常将其重新分类为鳞状细胞癌或腺癌。
(iv)腺鳞癌(adenosquamouscarcinoma)是一种包含以下两种类型的细胞的癌症：鳞状细胞(内衬于某些器官的细小的扁平细胞)和腺样细胞。
(v)具有多形性、肉瘤样或肉瘤要素的癌。这是一组罕见的肿瘤，其反映了组织学异质性以及上皮和间充质分化的连续体(continuum)。
(vi)类癌肿瘤是一种缓慢生长的神经内分泌性肺肿瘤，并且起始于能够响应于神经系统提供的刺激释放激素的细胞。
(vii)唾液腺型癌起始于位于肺的大气道内的唾液腺细胞。
(viii)未分类的癌包括不纳入上述任何肺癌类别的癌症。
nsclc可以是鳞状细胞癌、腺癌、大细胞(未分化型)癌、腺鳞癌和肉瘤样癌。
肺癌可以是0、ia、ib、iia、iib、iiia、iiib或iv期肺癌，如由括号中对应的tnm分类所限定：0期(tisn0m0)、ia期(t1，n0，m0)、ib期(t2，m0，n0)、iia期(t1，n1，m0；或t2，n1，m0)、iib期(t3，n0，m0)、iiia期(t1，n2m0；t2，n2，m0；t3，n1，m0；t3，n2，m0；t4，n0，m0；或t4，n1，m0)、iiib期(t1，n3，m0；t2，n3，m0；t3，n3，m0；t4，n2，m0；或t4，n3，m0)和iv期(任意t或任意n与m1)。
tnm分类是恶性癌症的分期系统。本文使用的术语“tnm分类”是指如sobin等(internationalunionagainstcancer(uicc)，tnmclassificationofmalignanttumors，第6版，newyork；springer，2002，第191-203页)所限定的tnm分期的第6版。
本文使用的术语“癌细胞”是指在其发育期间获得一组特征性功能能力，特别是以下一项或更多项的细胞：逃避凋亡的能力、生长信号的自给自足、对抗生长信号的不敏感、组织侵入/转移、显著的生长潜力和/或持续的血管生成。该术语意在涵盖恶性前和恶性癌细胞二者。
本文使用的术语“肿瘤dna”或“癌细胞的肿瘤dna”简单地是指癌细胞的dna。其仅用于将癌细胞的dna与本文提及的其他dna更清楚地区分开。因此，除非引入歧义，否则可作为替代使用术语“癌细胞的dna”。
本文使用的术语“对象”是指个体，例如人、非人灵长类(例如黑猩猩以及其他猿和猴物种)；农场动物，例如鸟、鱼、牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠。该术语不指示特定的年龄或性别。在一个具体含义中，对象是哺乳动物。在一个优选含义中，对象是人。原则上，对象可以是以下任何对象，其具有seqidno：1中所包含序列的基因组dna内和/或具有seqidno：26中所包含序列的基因组dna内的甲基化状态是未知的，所述基因组dna特别地来自对象的包含来自血液的无细胞dna的样品或由其获得的样品。根据使用第一方面的方法的目的，术语“对象”可以具有不同的限制。例如，如果该方法将被用于检测癌症或筛选癌症对象，则该对象是否患有癌症是未知的，即其可以患有或可以未患癌症。在该实例中，对象优选地处于患有癌症风险之中或患有癌症的风险提高或被怀疑患有癌症。“处于风险之中或风险提高”意指一个或更多个风险因子可归于对象，优选地如由美国癌症协会一般性或针对相应癌症限定的。
本文使用的术语“是......的指示”或“指示”是指识别或指定要待指示的事物的行为。如本领域技术人员理解的，这样的评估通常可能不是对100％的对象都是准确的，但其优选地是准确的。然而，该术语要求，可对对象的统计学显著部分作出准确指示。有关统计学显著性和合适的置信区间以及p值的描述，参见上文。
本文使用的术语“扩增”或“产生扩增子”是指扩增、通常用聚合酶链式反应(pcr)来扩增双链或单链dna模板的限定区域。“扩增子”是根据所述限定区域的双链dna片段。
本文使用的术语“引物对”是指这样的两个寡核苷酸，即正向和反向引物，其相对于双链核酸分子各自具有与一条链(至少基本上)相同的序列，使得其各自退火于与其(至少基本上)相同的链的互补链。术语“正向引物”是指与双链核酸分子的正向链(由基因组参照序列的方向所限定)(至少基本上)相同的引物，术语“反向引物”是指与双链核酸分子中正向链的反向互补链(至少基本上)相同的引物。正向引物和反向引物与其模板退火的位点之间的距离取决于期望引物产生的扩增子的长度。通常来说，对于本发明，其为40至1000bp。本文规定了优选的扩增子大小。在使用引物对扩增单链dna模板的情况下，在第一扩增循环中只有一种引物与单链退火。随后，另一种引物与新产生的互补链结合，使得扩增的结果是双链dna片段。短语“适于由其中5位未甲基化的胞嘧啶已被转化成尿嘧啶或不与鸟嘌呤杂交之另一碱基的基因组dna的单链产生扩增子的引物对”是指将从未甲基化胞嘧啶到尿嘧啶的碱基变化考虑在内的引物对，尿嘧啶与腺嘌呤碱基配对并且因此在扩增子中被胸腺嘧啶替代。
本文使用的术语“诊断”是指确定对象是否患有癌症，并且还优选地是哪种癌症。通过本文所述的靶dna的甲基化分析的诊断可以用本文所述的其他手段补充以和/或缩小用甲基化分析检测出的癌症的范围。如本领域技术人员理解的，诊断通常可能不是对100％的对象都是准确的，但其优选地是准确的。然而，该术语要求，可对对象的统计学显著部分作出准确诊断。有关统计学显著性和合适的置信区间以及p值的描述，参见上文。
本文使用的术语“预后”意指从疾病恢复的可能性或者疾病的可能发展或结局的预测，包括但不限于预测总体存活期(os)的长度、1年存活率(1ys)、针对治疗的响应(rt)、无疾病存活、无进展存活和无事件存活。根据可能的发展或结局是阳性还是阴性，预后分别是良好或不良的。如本领域技术人员理解的，预后通常可能不是对100％的对象都是准确的，但其优选地是准确的。然而，该术语要求，可对对象的统计学显著部分作出准确的预后。有关统计学显著性和合适的置信区间以及p值的描述，参见上文。
本文使用的术语“预测癌症治疗效果”是指响应于治疗的癌症疾病的预期结局，并且涉及评估癌症疾病的发展状态、进展、或其消退，和/或对未来癌症进程的预后。特别地，设想在癌症治疗之前和在治疗开始后即刻如本文所述检测dna甲基化的存在或不存在，其中即刻意指在0.5至7天内，优选在1、2或3天内。在治疗开始后即刻样品中的甲基化dna增加预示癌症治疗具有治疗效果。认为，有效的治疗由于例如破坏癌细胞而导致样品中的无细胞dna增加。如本领域技术人员理解的，预测通常可能不是对100％的对象都是准确的，但其优选地是准确的。然而，该术语要求，可对对象的统计学显著部分作出准确的预测。有关统计学显著性和合适的置信区间以及p值的描述，参见上文。
本文使用的术语“分类”是指将癌症或对象分配到组中。优选地，该组可以是根据第五方面的其他方法的组，例如，“被诊断患有癌症的对象”、“预后良好/不良的对象”、“具有癌症治疗的预测效果或不具有癌症治疗的预测效果的对象”、“对癌症治疗作出响应或不对癌症治疗作出响应的对象”、或“提高的癌症可能性的对象”。此外，分类可以简单地是“在根据相应seqidno的基因组dna中具有dna甲基化的对象”。如本领域技术人员理解的，分类通常可能不是对100％的对象都是准确的，但其优选地是准确的。然而，该术语要求，可对对象的统计学显著部分作出准确分类。有关统计学显著性和合适的置信区间以及p值的描述，参见上文。
本文使用的短语“对治疗的响应”、“针对治疗的响应”是指患有癌症的对象针对治疗所述疾病的治疗的响应。可以对此使用标准准则(miller，等，cancer，1981；47(1)：207-14)来评价针对治疗的响应，包括响应、稳定化和进展。本文使用的术语“响应”可以是完全响应(或完全缓解)，其是所有可检测的恶性疾病的消失，或者是部分响应，其被限定为一个或更多个病变(肿瘤病变)的最大垂直直径之乘积的总和减小约＞50％，没有新的病变和没有任何病变的进展。实现完全或部分响应的对象被认为是“响应者”，并且所有其他对象被认为是“非响应者”。本文使用的术语“稳定化”限定为肿瘤尺寸减小＜50％或增大＜25％。本文使用的术语“进展”限定为肿瘤病变的尺寸增大＞25％或出现新病变。
本文使用的术语“监测”是指在治疗过程期间或在一定时间段期间，通常在至少1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年、5年、10年或任何其他时间段期间诊断的癌症的伴随。术语“伴随”意指癌症状态并且特别是这些癌症状态的变化可以基于甲基化靶dna的量，特别是基于在任何类型的周期性时间段内的量变化来检测，其在治疗过程内确定，例如每天确定或每月确定1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次(不超过每日一次确定)，所述治疗过程可达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15或24个月。也可以在治疗特定事件时，例如在每个治疗周期或药物/治疗施用之前和/或之后确定量或量的变化。一个周期是一个治疗循环直到下一个循环开始之间的时间。癌症治疗通常不是单治疗，而是治疗过程。一个过程通常花费3至6个月，但可以比此更长或更短。在治疗过程期间，通常有4至8个治疗周期。通常，治疗周期包括治疗中断以使身体恢复。如本领域技术人员理解的，监测的结果通常可能不是对100％的对象都是准确的，但其优选地是准确的。然而，该术语要求，可对对象的统计学显著部分实现准确的监测结果。有关统计学显著性和合适的置信区间以及p值的描述，参见上文。
短语“筛选对象以检测提高的癌症可能性”是指对对象群体的样品使用第一方面的方法。优选地，对象患有癌症的风险提高或被怀疑患有癌症，所述癌症选自本文针对某些seqidno列举的组。特别地，本文列举的以下风险因子中的一个或更多个可归于群体的对象。在一个具体实施方案中，相同的一个或更多个风险因子可归于群体的所有对象。例如，群体可以以特定最小年龄(例如50岁或更年长)为特征。应理解，术语“筛选”不一定表示明确的诊断，而是旨在指示存在或不存在某种癌症或癌症组的可能性提高。指示的提高可能性优选地使用如本文所述的其他手段来确认和/或缩小范围。如本领域技术人员理解的，筛选结果通常可能不是对100％的对象都是准确的，但其优选地是准确的。然而，该术语要求，可对对象的统计学显著部分实现准确的筛选结果。有关统计学显著性和合适的置信区间以及p值的描述，参见上文。
本文关于癌症使用的术语“治疗”是指其中目的是降低癌症的进展的治疗性处理。有益或期望的临床结局包括但不限于症状的缓解、疾病时长的缩短、稳定化的病理状态(特别是不恶化)、减慢疾病进展、改善病理状态和/或减轻(部分减轻和全部减轻两种情况)，其优选是可检测的。成功的治疗并不一定意味着治愈，但是与如果不施加治疗的预期存活相比，其仍可意味着延长的存活。在一个优选实施方案中，治疗是一线治疗，即，癌症先前未被治疗。癌症治疗涉及治疗方案。
本文使用的术语“治疗方案”是指如何根据疾病以及可利用的方法和用药来治疗对象。癌症治疗方案的非限制性实例是化学治疗、手术和/或辐照、或其组合。本发明实现的早期癌症检测特别地允许手术治疗，尤其是允许治愈性切除。特别地，术语“治疗方案”是指施用如下限定的一种或更多种抗癌剂或治疗。本文使用的术语“抗癌剂或治疗”是指具有抗增殖、抗致癌和/或制癌特性的化学、物理或生物药剂或治疗、或者手术，包括其组合。
化学抗癌剂或治疗可以选自烷化剂、抗代谢物、植物生物碱和萜类化合物以及拓扑异构酶抑制剂。优选地，烷化剂是基于铂的化合物。在一个实施方案中，基于铂的化合物选自顺铂、奥沙利铂、依铂、洛铂、奈达铂、卡铂、异丙铂、四铂、洛铂、dcp、pld-147、jm118、jm216、jm335和赛特铂。
物理抗癌剂或治疗可以选自放射治疗(例如治愈性放射治疗、辅助性放射治疗、姑息性放射治疗、远距离放射治疗、近距离放射治疗或代谢性放射治疗)、光疗(使用例如血卟啉(hematoporphoryn)或光敏素ii(photofrinii))和热疗。
手术可以是治愈性切除术、姑息性手术、预防性手术或细胞减灭术(cytoreductivesurgery)。通常来说，手术涉及切除，例如囊内切除、边缘性切除、广泛性切除或根治性切除，如baron和valin(rec.med.vet，specialcanc.1990；11(166)：999-1007)中所描述的。
生物抗癌剂或治疗可以选自抗体(例如，刺激破坏癌细胞的免疫应答的抗体，例如利妥昔单抗(retuximab)或阿仑单抗(alemtuzubab)；通过与免疫细胞的受体结合并抑制阻止免疫细胞攻击“本身”细胞的信号来刺激免疫应答的抗体，例如伊匹单抗；干扰肿瘤生长所必需的蛋白质作用的抗体，例如贝伐单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗；或者与药物(优选细胞杀伤物质例如毒素、化学治疗性或放射性分子)缀合的抗体，例如y-替伊莫单抗、i-托西莫单抗或阿多曲妥珠单抗依酯(ado-trastuzumabemtansine))；细胞因子(例如，干扰素或白介素例如inf-α和il-2)；疫苗(例如包含癌症相关抗原的疫苗，例如sipuleucel-t)；溶瘤病毒(例如，天然溶瘤病毒例如呼肠孤病毒、新城疫病毒或腮腺炎病毒；或基因工程化病毒例如麻疹病毒、腺病毒、痘苗病毒或疱疹病毒，其优先靶向携带癌症相关抗原例如egfr或her-2的细胞)；基因治疗剂(例如，这样的dna或rna，其替代改变的肿瘤抑制因子，阻断致癌基因的表达，改善对象的免疫系统，使癌细胞对化学治疗、放射治疗或其他治疗更敏感，诱导细胞自杀或赋予抗血管生成作用)；以及过继性t细胞(例如，针对抗肿瘤活性选择的对象收获的肿瘤侵入性t细胞，或经遗传修饰以识别癌症相关抗原的对象收获的t细胞)。
在一个实施方案中，一种或更多种抗癌药物选自：乙酸阿比特龙、abvd、abve、abve-pc、ac、ac-t、ade、阿多曲妥珠单抗依酯、双马来酸阿法替尼、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑单抗、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、阿瑞匹、三氧化二砷、菊欧文菌天冬酰胺酶(asparaginaseerwiniachrysanthemi)、阿西替尼、阿扎胞苷、beacopp、贝利司他(belinostat)、盐酸苯达莫司汀、bep、贝伐单抗、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼(bosutinib)、brentuximabvedotin、白消安、卡巴他赛(cabazitaxel)、卡博替尼-s-苹果酸盐(cabozantinib-s-malate)、caf卡培他滨、capox、卡铂、卡铂-紫杉酚(carboplatin-taxol)、卡非佐米(carfilzomib)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、色瑞替尼(ceritinib)、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松(chlorambucil-prednisone)、chop、顺铂、氯法拉滨(clofarabine)、cmf、copp、copp-abv、克唑替尼(crizotinib)、cvp、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷、脂质体、达拉非尼、达卡巴嗪、放线菌素、达沙替尼、盐酸柔红霉素、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素(denileukindiftitox)、地诺单抗(denosumab)、盐酸右雷佐生(dexrazoxanehydrochloride)、多西他赛、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、艾曲波帕(eltrombopagolamine)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、盐酸表柔比星、epoch、甲磺酸艾日布林、盐酸埃罗替尼、磷酸依托泊苷、依维莫司、依西美坦、fec、非格司亭、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、fu-lv、氟维司群、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)、谷卡匹酶(glucarpidase)、乙酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、hpv二价疫苗、重组hpv四价疫苗、hyper-cvad、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、依鲁替尼(ibrutinib)、ice、艾代拉利司(idelalisib)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、甲磺酸盐、咪喹莫特(imiquimod)、碘131托西莫单抗和托美单抗、伊匹单抗、盐酸伊立替康、伊沙匹隆、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、亚叶酸钙、乙酸亮丙瑞林、脂质体阿糖胞苷、洛莫司汀、盐酸氮芥(mechlorethaminehydrochloride)、乙酸甲地孕酮、巯嘌呤、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤、丝裂霉素c、盐酸米托蒽醌、mopp、奈拉滨、尼洛替尼、奥比妥珠单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、高三尖杉酯碱(omacetaxinemepesuccinate)、oepa、off、oppa、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂、pad、帕利夫明(palifermin)、盐酸帕洛诺司琼、帕米膦酸二钠、帕尼单抗(panitumumab)、盐酸帕唑帕尼、培门冬酶(pegaspargase)、聚乙二醇干扰素α-2b、帕母单抗(pembrolizumab)、培美曲塞二钠、帕妥珠单抗(pertuzumab)、普乐沙福(plerixafor)、泊马度胺(pomalidomide)、盐酸帕纳替尼(ponatinibhydrochloride)、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、镭223二氯化物、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗(ramucirumab)、拉布立酶(rasburicase)、r-chop、r-cvp、重组hpv二价疫苗、重组hpv四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼(regorafenib)、利妥昔单抗、罗米地辛(romidepsin)、罗米司亭(romiplostim)、磷酸鲁索利替尼(ruxolitinibphosphate)、siltuximab、sipuleucel-t、甲苯磺酸索拉非尼、stanfordv、苹果酸舒尼替尼、tac、滑石、柠檬酸他莫昔芬、替莫唑胺、西司他莫司、沙利度胺、盐酸托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗和i131碘托西莫单抗、tpf、曲美替尼(trametinib)、曲妥珠单抗、凡德他尼、vamp、veip、维罗非尼(vemurafenib)、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨(vinorelbinetartrate)、维莫德吉(vismodegib)、伏立诺他(vorinostat)、xelox、ziv-阿柏西普(ziv-aflibercept)和唑来膦酸。
本申请中涉及的seqid
本申请涉及seqidno：1至63。对这些sedid的概述和解释提供在下表1中：
表1：本说明书的seqid。rc意指反向互补物，c至t或g至a意指通过cpg背景以外的胞嘧啶的重亚硫酸盐转化被转化成尿嘧啶，并且在后续扩增中被胸苷替代。bis1是指经重亚硫酸盐转化的正向链(如各基因组dna的seqid中所列举的)和bis2是指正向链的经重亚硫酸盐转化的反向互补链(各基因组dna的seqid的反向互补序列)，在此该链的方向如例如从基因组构建体(hcgr38)获得的由基因组参照序列的方向限定。对于序列的作图，参见图1。
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通过以下实施例描述本发明，这些实施例将被解释为仅是说明性的而非限制本发明的范围。
实施例1
样品制备：
将用于评估测定的技术样品制备为经重亚硫酸盐处理的已知在测定区域中未甲基化的pbl(外周血)dna(人基因组dna：男性，promegagmbh)和甲基化dna(经dna-甲基转移酶处理的dna-通用甲基化dna，merckchemicalsgmbh)的总共10ng/ml的混合物。作为未甲基化dna的第二技术参照对照，使用全基因组随机扩增的dna(phi)。从不同癌组织分离的dna商购自biocatgmbh。使用epitect重亚硫酸盐试剂盒(qiagengmbh)按照制造商的方案对对照dna和组织dna进行重亚硫酸盐处理。
如epiprocolon2.0试剂盒(epigenomicsag)的使用说明书(ifu)中规定的，收集来自结直肠癌患者和健康个体的血浆样品。简言之，通过两个离心步骤制备edta血浆。在使用前，在相同条件下将大体积血浆(来自健康个体的血浆样品的合并物；血浆，正常edta，cliniqaco.)离心。在处理之前，将血浆样品储存在-70℃下。
样品/dna处理：
直接使用技术样品/dna混合物。以与epiprocolon2.0试剂盒(epigenomicsag)的使用说明书(ifu)中规定的分析前工作流程类似的方式进行血浆样品处理。
pcr反应对于技术样品在每个反应中使用10ng总dna，或者对于血浆样品使用约1ml血浆的经处理等同物。除包含设计用于本申请中测定的相关寡聚物的pcr混合物外，均根据epiprocolon2.0pcr试剂盒(epigenomicsag)的pcr方案，在lightcycler480(rocheappliedsciences)上进行实时pcr。
除所研究的标志物ankrd13b和foxf2的甲基化状态之外，还测量了甲基化和未甲基化septin9的水平以确定单独pcr反应中的总dna产量。使用技术dna作为校准物(例如50％甲基化dna：5ng未甲基化的重亚硫酸盐pbldna加5ng甲基化dna)进行dna量的计算。通过所研究标志物的dna量与dna总量(甲基化和未甲基化septin9标志物的总和)的比来确定甲基化程度。
结果：
使用本文所述的重甲基pcr测定可成功检测所研究标志物ankrd13b和foxf2的甲基化(图2)。仅含有50pg甲基化dna(在10ng未甲基化dna的总背景下)的技术样品在实时pcr中显示出强信号。相反，由大体积血浆(健康个体的合并物)处理的样品在pcr中未显示出或显示出非常微弱的信号(图6和图7)。
接下来，对来源于不同癌组织的dna测试所研究标志物的甲基化状态。如图3b中所示，与正常结肠组织(仅0.5％甲基化dna)相比，来自胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌和前列腺癌的dna中ankrd13b的甲基化程度大于10％。预期，组织中甲基化的这种强差异也可以在液体活检中测量。作为概念验证，检查来自健康个体和crc患者的血浆样品。虽然crc血浆中的平均甲基化程度仅为8％，但样品可以清楚地与健康个体(根本没有检测到-来自健康供体的血浆中甲基化为0％)区分开。在个体crc患者的血浆样品中检测甲基化ankrd13b的实时pcr扩增图的一个实例示于图8中。除甲基化ankrd13的检测之外，还观察到作为已知crc标志物的甲基化septin9和用于检测未甲基化背景dna的未甲基化septin9的信号。
图4b示出了肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和食管癌中foxf2的超过10％甲基化dna的量。正常结肠组织显示出低的甲基化foxf2信号(仅0.2％甲基化dna)。再次，作为在液体活检中检测甲基化的概念验证，检查来自健康个体和crc患者的血浆样品(图4a)。在crc血浆中甲基化dna的平均量为10％，并且可以清楚地与健康供体(仅在单个样品中检测出，其仅具有0.03％甲基化靶dna)区分开。在个体crc患者的血浆样品中检测甲基化foxf2的实时pcr扩增图的一个实例示于图9中。除甲基化ankrd13的检测之外，还观察到作为已知crc标志物的甲基化septin9和用于检测未甲基化背景dna的未甲基化septin9的信号。
在图5中所示的矩阵中比较个体癌组织的这两种所研究标志物的甲基化程度。以此方式，相同种类的癌组织中通过不同标志物的甲基化程度的直接比较变得明显。可以观察到不同的聚类：a)所研究的标志物未被甲基化的癌组织，例如胰腺癌或肾癌组织；b)仅显示出一种标志物的显著量甲基化的癌组织，例如，前列腺癌组织中的甲基化ankrd13或肺癌组织中的甲基化foxf2；和c)通过这两种所研究标志物检测出的癌组织，例如结肠癌或食管癌组织。如果在测量中观察到b)提及的聚类，则可以给出明确诊断。对于其他聚类(a)和(c)，需要增加另外的标志物或常规诊断以允许区分不同形式的癌症。
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