属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株在用于产生和/或维持体内稳态状态的儿科学中的应用的制作方法

众所周知，抑制小肠上皮的细菌和免疫系统的细胞之间的相互作用一同在维持小肠的和一般而言的体内的体内稳态方面起到根本性的作用。通过特定受体进行的细菌识别诱导重要免疫介导物的表达和释放，其中所述免疫介导物可以举例而言列出促炎性和抗炎性趋化因子和细胞因子，其有助于调制天然和适应性免疫应答。因此，对于能够在肠粘膜水平和系统水平上调节免疫应答的驻留细菌菌株(具有高粘附能力)进行鉴定、选择和表征在科学领域仍持续得到密切关注并且同时对于在所述领域工作的技术人员而言是急需的。上述的关注是因为事实上对于开发具有显著的对身体有益的性质并且能够用于许多炎性肠疾病的治疗(预防性或疗愈性)的功能性健康产品的需求越来越强烈。得益于深入和长期的研发活动，申请人成功地提供了针对上述需求的适当回应。本发明涉及属于开菲尔乳杆菌(lactobacilluskefiri)种的细菌菌株，其命名为由波比奥泰克股份公司于2015年7月10日保藏于德国dsmz机构的开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079，以及由波比奥泰克股份公司于2015年7月10日保藏于德国dsmz机构的开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080。本发明涉及作为药物使用的属于开菲尔乳杆菌(lactobacilluskefiri)种的细菌菌株，其命名为开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080。本发明涉及属于开菲尔乳杆菌(lactobacilluskefiri)种的细菌菌株，其命名为开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080，所述细菌菌株用于预防性和/或疗愈性治疗优选在成年受试者中且还优选在其慢性期的炎性肠疾病，所述炎性肠疾病选自包括肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、绞痛、婴儿绞痛、结肠炎、溃疡性结肠炎(uc)的组或选自由它们组成的组。本发明涉及属于开菲尔乳杆菌(lactobacilluskefiri)种且具有所附权利要求公开的特征的细菌菌株在儿科学中用于产生和/或维持体内稳态状态以及用于预防性和/或疗愈性治疗在成年受试者以及在慢性期的炎性肠疾病(例如肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(uc))中的应用。本发明涉及属于开菲尔乳杆菌(lactobacilluskefiri)种且具有所附权利要求公开的特征的细菌菌株，其用于在儿科学中产生和/或维持体内稳态状态以及用于预防性和/或疗愈性治疗在成年受试者以及在慢性期的炎性肠疾病(例如肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(uc))。本发明还涉及食物组合物、或用于补充的组合物、或用于医疗器械的组合物、或药物组合物(简言之总称为本发明的组合物)，其包含赋形剂和/或食品或药品级制剂的物质以及包含细菌菌株的混合物或由细菌菌株组成的混合物，所述细菌菌株选自由属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株组成的组；所述组合物用于儿科学中以产生或维持体内稳态状态以及用于预防性和/或疗愈性治疗成年受试者中以及处于慢性期的如肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(uc)等炎性肠疾病，并且具有所附权利要求公开的特征。本发明的优选实施方式涉及细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079lkef和开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080，所述菌株用于儿科学中以产生或维持体内稳态状态以及用于预防性和/或疗愈性治疗成年受试者中以及处于慢性期的如肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(uc)等炎性肠疾病，并且具有所附权利要求公开的特征。本发明的其它优选实施方式在下文的详细描述中公开如下。图1显示了用于评估细胞组织的跨上皮电阻的装置。图2显示了本研究中某些细菌菌株相对于caco-2细胞的粘附百分比。图3显示了相对于未经刺激的caco-2细胞的基础teer值评估的膜完整性百分比(基础值等于100％；促炎性刺激等于40％，在24小时读数)。图4显示了相对于用促炎性因子刺激的caco-2细胞的teer值评估的膜完整性的所谓倍数增加(fi)(用促炎性因子刺激的caco-2细胞的teer值等于1；在24小时读数)。图5(a和b)显示了1950年至2000年的传染病发生率(a)和免疫疾病发生率(b)之间的反比关系。图6显示了在至多3周岁的儿童中的瞬时和永久微生物菌群的变化方面在儿童与成人之间的差距，即隐窝斑、ilf发育、屏障功能(粘膜、amps、siga)、peyer淋巴小结成熟、粘膜和系统t细胞分化以及抗生素治疗后的免疫系统信号传导。此外，在大于3周岁的儿童以及成人中，其显示出直接的免疫效应，即，免疫的瞬时或永久性变化、共生微生物丛耐受受损、免疫启示或异常微生物测试、定殖抗性受损、以及出现潜在病原性生物体(病理生物)和病原体以及临床后果，例如ibd、哮喘、肥胖、1型糖尿病、特应性皮炎、多发性硬化、癌症和自闭症。图7涉及在施用细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)lkef之前以及一个月后的小肠定殖(餐前施用)。图8涉及在施用细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)lkef之前以及一个月后的小肠定殖(餐后施用)。图9涉及在37℃对未重建的细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)lkef的加快的稳定化测试。图10涉及在25℃对重建的细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)lkef的加快的稳定化测试。图11涉及在25℃、30℃和33℃对重建的细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)lkef的加快的稳定化测试。在属于乳杆菌(lactobacillus)属的细菌中，申请人选择了开菲尔乳杆菌种，其证明与其他乳杆菌物种相比具有惊人的粘附能力。随后，在对属于开菲尔乳杆菌种的一大组细菌菌株进行选择之后，申请人鉴定、选择并表征了以下细菌菌株(本发明的菌株)：(i)开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079，由波比奥泰克股份公司于2015年7月10日保藏于德国dsmz机构。(ii)开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080，由波比奥泰克股份公司于2015年7月10日保藏于德国dsmz机构。作为本发明的主题的属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株已显示出具有惊人的粘附至肠粘膜的性质，这使得它们能够有利地表达其具有持久有效的保护效果和对小肠上皮完整性的最优恢复的特定特性(例如保证体内稳态)。高粘附性一方面有助于使保留并持续终生的微生物菌群再生，且另一方面有助于改善保护以及由此而来的细胞抗性；参见图5和6及发表于natureimmunology15,307-310(2014)的科学论文。由以上可以推断，重要的是能够以赋予并发展健康的细菌菌群的方式来干预人的微生物菌群(尤其是在生命的前3年)，以确保将随时间持续的良好体内稳态状态。有利的是，使用具有高粘附能力并且能够在肠粘膜水平和系统水平调节免疫应答的原生的驻留益生菌(体内的细菌群(非瞬时))，诸如本发明的那些细菌，为以下方面提出了有吸引力的解决方案：在儿科学中用以产生和/或维持体内稳态状态，以及在成年受试者且在慢性期预防性或疗愈性治疗如肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(uc)等炎性肠疾病。本发明涉及食物组合物、或用于补充的组合物、或用于医疗器械的组合物、或药物组合物(简言之总称为本发明的组合物)，其包含赋形剂和/或食品或药品级制剂的物质以及包含细菌菌株的混合物或由细菌菌株组成的的混合物，所述细菌菌株选自由属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株组成的组；所述组合物用于儿科学中以产生或维持体内稳态状态以及用于预防性和/或疗愈性治疗成年受试者中以及处于慢性期的如肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(uc)等炎性肠疾病。在优选实施方式中，所述组合物中的所述细菌菌株属于开菲尔乳杆菌种并且选自以下细菌菌株：由波比奥泰克股份公司于2015年7月10日保藏于德国dsmz机构的开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079，和由波比奥泰克股份公司于2015年7月10日保藏于德国dsmz机构的开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080。优选地，所述组合物中的所述细菌菌株为处于具有动物或植物脂质包膜的包膜形式的细菌细胞的形式。作为另选，所述组合物中的所述细菌菌株处于“裸露”，即未包膜的细菌细胞的形式。待包膜或微胶囊化的所述细菌菌株/细胞可以为固体形式，特别是粉末、颗粒或者脱水或冻干粉末的形式。采用包括动物或植物来源的至少一种脂质或由动物或植物来源的至少一种脂质组成的包膜材料，使用本领域技术人员已知的技术和工艺来将细菌包膜或微胶囊化。有利地，脂质为植物来源。采用涉及形成界限清晰的层的多层或微胶囊化或多包膜技术来施加/形成脂质包膜。用于在细菌细胞上涂覆/形成包膜层的工艺的产率大于约80％，但通常大于90％。可以借助流化床技术(例如，顶喷或底喷)来将冻干形式的属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株包膜或微胶囊化，其中在细菌经加热并转化为液态后将以植物来源的脂质为代表的包膜材料在外部涂覆于细菌上。然后利用已知技术将经包膜的属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株添加至其他成分、赋形剂和工艺添加剂从而生成本发明的组合物(食物产品、补充剂产品、医疗器械或药物组合物)。包膜材料包括植物来源的至少一种脂质或由植物来源的至少一种脂质组成。脂质选自包括熔点在35℃至85℃、优选为45℃至70℃、有利的是50℃至60℃的饱和植物脂肪的组或由熔点在35℃至85℃、优选为45℃至70℃、有利的是50℃至60℃的饱和植物脂肪组成的组。在优选实施方式中，可以使用具有某种程度的亲水性和/或疏水性的饱和植物脂肪，其可以选自包括饱和脂肪酸单甘油酯和双甘油酯、以饱和脂肪酸酯化的聚甘油以及游离饱和脂肪酸的组。饱和脂肪酸可以选自包括8至32个碳原子、优选12至28个碳原子、进而更优选16至24个碳原子的组。有利的是，脂质选自包括以下的组或由以下组成的组：(i)二棕榈酸硬脂酸甘油酯e471,inci(pcpc):二硬脂酸甘油酯，cas:85251-77-0(或1323-83-7),einecs:286-490-9(或215-359-0)。商购产品的实例是biogapressvegetalbm297ato–gattefossésas；(ii)棕榈酸硬脂酸聚甘油酯e475,inci:聚甘油基-6-二硬脂酸酯，cas:61725-93-7。商购产品的实例是plurolsteariquewl1009–gattefossésas。包膜层中使用的脂质的类型和化学性质取决于：(i)成品的化学和物理性质，(ii)成品例如其中添加了包膜细菌的植物油中存在的水或水分或游离水的含量，(iii)用于配制成品的成分、赋形剂和添加剂或(iv)成品的物理状态。为了制备粉末或颗粒或冻干药物形式(例如袋剂、胶囊剂、片剂或棒剂)的成品(本发明的组合物)，使用脂质二棕榈酸硬脂酸甘油酯e471,inci(pcpc):二硬脂酸甘油酯,cas:85251-77-0(或1323-83-7),einecs:286-490-9(或215-359-0)(商购产品的实例，biogapressvegetalbm297ato–gattefossésas)来包膜属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株；优选细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080。为了制备含有属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株的粉末或颗粒或冻干形式(其将被添加至植物油以便生成药物形式例如，油性悬浮液或成滴的油)的成品(本发明的组合物)，使用脂质棕榈酸硬脂酸聚甘油酯e475,inci:聚甘油基-6-二硬脂酸酯,cas:61725-93-7(商购产品的实例plurolsteariquewl1009–gattefossésas)来包膜属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株；其优选为细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080。在本发明的上下文中，“包膜层”是指在外部施加于细菌/细胞的表面的包膜层。在本发明的一个实施方式中，所述组合物包括选自橄榄油、大豆油、玉米油、米糠油或葵花油的植物油、麦芽糊精以及所述菌株混合物，所述菌株混合物包括选自由属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株组成的组的细菌菌株或由该细菌菌株组成；有利的是，所述细菌菌株是细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079lkef和/或细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080，优选地其重量比为1:2至2:1、1:0、0:1、1:1。优选的实施方式由包含容器和由盖构成的封闭元件的瓶(优选地提供有单剂量移液管)所代表。所述封闭元件具有表示为内盖(undercap)或胶囊的外壳，其起到容纳本发明的细菌菌株的作用，其中细菌细胞处于包膜形式或裸露形式。包膜的细菌收纳在所述封闭元件的内盖中。在使用时，可以通过旋转或垂直推挤封闭元件打开内盖，且其中所容纳的包膜的细菌落入容器内存在的液体(优选植物油)中。可以简单地通过振摇来将细菌与所述液体混合以生成细菌菌株在油中的悬浮液。容器容纳所述植物油，而封闭元件包括胶囊(隔离的区室)，该胶囊适于以例如与容器的内容物隔离开的方式容纳冻干或粉末或颗粒形式的本发明的细菌菌株。胶囊在使用时被打开且其中所容纳的细菌菌株与所述植物油相接触以生成本发明的组合物。优选地，所述细菌菌株(优选为冻干形式或颗粒或粉末)以1x108cfu/g至1x1012cfu/g细菌的浓度、优选以1x109cfu/g至1x1011cfu/g的细菌的浓度存在。例如，具有滴管和分开的胶囊的一瓶7ml植物油可以含有约300mg细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和/或细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080(优选地其重量比为1:2至2:1、1:0、0:1、1:1)的粉末或冻干物以及麦芽糊精。每瓶(7ml)的值大于或等于25x109cfu，而每剂(5滴)的值大于或等于1x109cfu。优选地，所述细菌菌株(优选为冻干形式或颗粒或粉末)在所述组合物中以1x108cfu/g至1x1012cfu/g组合物的浓度、优选以1x109cfu/g至1x1011cfu/g组合物的浓度存在；进而更优选地，所述组合物包含选自橄榄油、大豆油、玉米油、米糠油和葵花油的植物油、麦芽糊精以及所述菌株混合物；优选地，10ml油包含30x109cfu/g至40x109cfu/g组合物。有利地，声明属于开菲尔乳杆菌种的本发明的细菌菌株(例如细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080)不具有过敏原(不具有在规章regulation(eu)1169/2011号的附录ii中所认定的所有潜在过敏原)，因为它们根据波比奥泰克股份公司novara公司(意大利)获专利授权的技术和生产工艺来制备(wo2007/054989a1和ep1869161b1)。有利地，属于开菲尔乳杆菌种的本发明的细菌菌株(例如细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080)可以在不冒转移性或传递性抗生素抗性的风险的情况下与抗生素组合使用(dragol.等，“antibioticsusceptibilityprofileofanewl.kefiristrain”；jglobalantimicrobresist(2015)。作为另选，在伴有抗生素治疗的情形中，细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和/或细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080(或含有所述菌株的本发明的组合物)可以与抗生素例如相隔2至6小时施用。有利地，细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和/或细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080(或含有所述菌株的本发明的组合物)可以在餐前或餐后于空腹或饱腹施用；参见图7和8。本发明的另一个实施方式是，浓度为1x108cfu/g细菌至1x1012cfu/g细菌(优选浓度为1x109cfu/g细菌至1x1011cfu/g细菌)的冻干形式或颗粒或粉末的细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和/或细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080(例如各200mg至500mg)(优选地其重量比为1:2至2:1、1:0、0:1、1:1)与例如麦芽糊精混合从而形成组合物/混合物。在该实施方式中，所述细菌菌株未经包膜，而是处于裸露细胞形式。将所述未包膜的开菲尔乳杆菌菌株的组合物/混合物引入硬植物胶囊内，所述硬植物胶囊选自市场上已知的那些。然后，转而将容纳所述组合物/混合物的胶囊插入并密封在以可抵抗水、湿度、空气、氧气和光透过的材料制成的袋中。硬植物胶囊所提供的保护结合袋的额外保护为所述胶囊内所容纳的细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和/或细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080的细胞确保了完美隔离的环境和更长的保质期。在使用时，将所述硬植物胶囊的内容物添加至装在瓶中的体积为例如6ml或8ml或10ml的植物油(例如，葵花油)中以产生油性悬浮液。该油性悬浮液可以逐滴施用，例如借助于给药移液管。一剂(例如5滴)可以直接取用或与冷的处于室温(20℃)的或者温热(30℃)的食物或饮料一起混合，条件是其不超过37℃。下文公开了本发明的实施方式frn。第一实施方式涉及食物组合物、或用于补充的组合物、或用于医疗器械的组合物、或药物组合物，其包含赋形剂和/或食品或药品级制剂的物质以及包含细菌菌株的混合物或由细菌菌株组成的混合物，所述细菌菌株选自由属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株组成的组；所述组合物用于(i)在儿科学中产生或维持体内稳态状态，和(ii)预防性和/或疗愈性治疗成年受试者中以及处于慢性期的如肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(uc)等炎性肠疾病。另一个实施方式fr2涉及根据fr1使用的组合物，其中所述属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株选自由波比奥泰克股份公司于2015年7月10日保藏于德国dsmz机构的开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和由波比奥泰克股份公司于2015年7月10日保藏于德国dsmz机构开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080；优选地，所述菌株以1:2至2:1、1:0、0:1、1:1的重量比存在于所述组合物中。另一个实施方式fr3涉及根据fr1或fr2使用的组合物，其中所述细菌菌株的细菌细胞处于包膜或微胶囊化形式，其包膜材料包括动物或植物来源的至少一种脂质或由动物或植物来源的至少一种脂质组成。另一个实施方式fr4涉及根据fr1、fr2或fr3中任一项使用的组合物，其中所述包膜材料包括植物来源的至少一种脂质或由植物来源的至少一种脂质组成，所述植物来源的脂质选自包括熔点在35℃至85℃、优选为45℃至70℃、进而更优选为50℃至60℃的饱和植物脂肪的组或由熔点在35℃至85℃、优选为45℃至70℃、进而更优选为50℃至60℃的饱和植物脂肪组成的组。另一个实施方式fr5涉及根据fr1、fr2、fr3或fr4中任一项使用的组合物，其中所述脂质选自包括以下的组或由以下组成的组：(i)二棕榈酸硬脂酸甘油酯e471,inci(pcpc):二硬脂酸甘油酯，cas:85251-77-0(或1323-83-7),einecs:286-490-9(或215-359-0)；优选biogapressvegetalbm297ato–gattefossésas；(ii)棕榈酸硬脂酸聚甘油酯e475,inci:聚甘油基-6-二硬脂酸酯，cas:61725-93-7；优选plurolsteariquewl1009–gattefossésas。另一个实施方式fr6涉及根据fr1、fr2、fr3、fr4或fr5中任一项使用的组合物，其中所述组合物包括植物油和如fr1-fr5中所述的所述菌株混合物或由植物油和如fr1-fr5中所述的所述菌株混合物组成，所述植物油选自包括橄榄油、大豆油、玉米油、米糠油或葵花油或者由其组成的组，而所述菌株混合物包括选自由属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株组成的组的至少一种细菌菌株或由所述至少一种细菌菌株组成。另一个实施方式fr7涉及根据前述fr1-fr6中任一项使用的组合物，其中，所述细菌菌株(优选为冻干形式或颗粒或粉末)以1x108cfu/g组合物至1x1012cfu/g组合物的浓度、优选以1x109cfu/g组合物至1x1011cfu/g组合物的浓度存在于所述组合物中。另一个实施方式fr8涉及根据fr6或fr7使用的组合物，其中粉末或颗粒或冻干物形式的属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株将被添加至植物油以生成油性悬浮液或成滴的油的药物形式，所述细菌菌株以诸如棕榈酸硬脂酸聚甘油酯e475,inci:聚甘油基-6-二硬脂酸酯,cas:61725-93-7等脂质包膜。另一个实施方式fr9涉及根据fr8使用的组合物，其中细菌菌株为重量比为1:2至2:1、1:0、0:1、1:1的开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080。另一个实施方式fr10涉及细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080，所述菌株用于儿科学中以产生或维持体内稳态状态以及用于预防性和/或疗愈性治疗成年受试者中以及处于慢性期的如肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(uc)等炎性肠疾病。申请人进行了比较研究来突出菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079lkef和开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080在保护和修复肠屏障方面的潜能。所述比较研究相对其他益生菌菌株进行，如下文所描述。材料和方法本研究中使用的所有菌株均在选择培养基mrs中于37℃培养，然后用细胞荧光计技术(bd制造的facscalibur流式细胞计)根据标准程序进行计数。利用bd公司制造的细胞生活力试剂盒(cellviabilitykit)根据标准程序在盐水溶液中的10-3稀释液中对每种菌株进行计数。在该研究中，将由细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079lkef和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080执行的修复性和/或保护性活性与以下细菌菌株进行比较：(i)嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)st10dsm25246,(ii)嗜热链球菌fp4dsm18616,(iii)嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)la02dsm21717,(iv)唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)ls01dsm22775,(v)唾液乳杆菌ls03dsm22776,(vi)唾液乳杆菌ls06dsm26037,(vii)鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)ggatcc53103,(viii)罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lre09dsm25685,(ix)长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)dlbl07(dsm25669)、长双歧杆菌dlbl08(dsm25670)、长双歧杆菌dlbl09(dsm25671)、长双歧杆菌dlbl10(dsm25672)和长双歧杆菌dlbl11(dsm25673)的混合物(1:1:1:1:1),(x)鼠李糖乳杆菌lr06dsm21981,(xi)德氏乳杆菌德氏亚种(lactobacillusdelbrueckiissp.delbrueckii)ldd01id1391dsm22106,(xii)植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)lp01lmgp-21021,(xiii)发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)lf16dsm26956,(xiv)短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)br03dsm16604,(xv)乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bs01lmgp-21384和(xvi)长双歧杆菌w11lmgp-21586。上述菌株(i)至(xvi)的全部均被定义为本研究的细菌菌株。采用了刺激肠屏障的体外模型，对其利用促炎性细胞因子(即，tnf-α和il-1β)诱导损伤。实验规定使用24多孔transwell板，其中使用小肠上皮组织的体外模型(制造商aretainternational,gerenzano–varese(va)，意大利)培养caco-2细胞21天直至形成细胞汇合层。所有实验在具有10％fbs(胎牛血清–gibco)的dmem培养基中进行。平行地执行了两类实验规程。通过所研究的菌株的保护/恢复的评估规程控制经肠腔的外部试剂侵入的能力称为“肠粘膜的屏障功能”(2-3)。该屏障功能的完整性能够通过跨上皮电阻(ω/cm2)或teer来测定。teer是对通过细胞旁路途径的离子通过的体外测定。维持肠完整性对于小肠的基础生理过程至关重要。因此，teer值的减少可以代表细胞损伤的早期表达并表明屏障受损(4-5)。为了评估所述菌株对肠屏障的效率，采用了两个评估规程：用于评估保护的第一规程和涉及膜恢复的第二规程(6)。涉及评估保护的第一规程需要在对每个板孔中的初始电阻读数后将caco-2细胞与本研究的益生菌菌株(浓度3x106细胞/孔)在37℃预温育1小时，随后与促炎性刺激物温育1小时：以终浓度10ng/ml使用的tnf-α和il-1β(由immunotools生产))，刺激对肠上皮屏障的损伤的刺激物。在第一实验规程中，目的在于评估本研究的益生菌菌株(i)-(xvi)在促炎性侵袭抵达后保护膜的完整性方面的能力(保护规程)。涉及评估屏障功能性的恢复的第二规程需要在对每个板孔中的初始电阻读数后将caco-2细胞与诱导上皮损伤的促炎性刺激物(终浓度为10ng/ml的tnf-α和il-1β(由immunotools生产))在37℃预温育1小时，随后与益生菌(3x106细胞/孔)温育。在该第二实验规程中，目的在于在体外模型中评估本研究的益生菌菌株在由促炎性刺激物所诱导的损伤之后恢复膜完整性的能力(恢复规程)。teer评估在两种规程中(6)，在刺激后2小时更换顶室和基底侧室(basolateralchamber)中的培养基。在刺激后24小时采用evom2评估了实验细胞模型中的teer(跨上皮电阻)，evom2是专门设计来测定细胞组织中的跨上皮电阻且能够对顶室和基底侧室之间的电阻进行正确测定的仪器(参见图1)。teer测定呈现为实验开始时的teer值的百分比。此外，作为第一步，为了验证本研究的细菌菌株(i)-(xvi)与上皮的相互作用，使用在刺激2小时结束时收集的transwell上清液，目的在于评估本研究的细菌菌株对上皮层的粘附。粘附评估间接地通过对收集的上清液中残余的细菌菌株的计数的细胞荧光计分析来进行。评估所研究的菌株对caco-2细胞的粘附的规程为了验证细菌菌株与下方的由caco-2细胞形成的上皮之间的相互作用，使用流式细胞仪来对在2小时刺激结束时收集的顶室的上清液中存在的细菌进行计数，且规程经修改以评估对文献中已存在的板的粘附(7)。所得值为未粘附至上皮的细胞数。粘附值是间接值，其作为相对于实验开始时所用的细菌细胞数的百分比来计算。结果：对小肠细胞粘附的评估(开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)和其它细菌菌株对小肠上皮细胞(caco-2)的粘附的比较性评估)将本研究所考虑的所有细菌菌株与汇合的caco-2细胞在37℃静置温育2小时，以便研究细菌与下方细胞的相互作用。图2显示了本研究的一些细菌菌株相对于caco-2细胞的粘附百分比，如该图中可见，与细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079相比，本研究的细菌菌株的整体显示出在对由caco-2细胞形成的上皮层的粘附方面更为低效。如可从图2(对小肠细胞的粘附)中推断，与所测试的细菌菌株相比，细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079lkef出人意料地显示出对于下方上皮的极强的显著粘附。应该注意到，本研究的未显示出任何可检测的粘附的细菌菌株没有被包括在图2中。细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079的这种非常显著的粘附促使申请人还进行了第二部分实验，其需要测定包括在保护规程(用所关注菌株的预刺激+用促炎性因子的刺激)和恢复规程(用促炎性因子的预刺激+用细菌菌株的随后刺激)中的每个板孔中的跨上皮电阻(teer)。涉及针对炎性损伤的小肠细胞保护的规程(益生菌菌株+促炎性刺激物)在保护规程中，所有受测菌株展现出相对于对照(上皮细胞的基础teer值)将膜完整性维持在高于70％的能力。此外，细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079lkef和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080的保护作用显示为与以下细菌菌株相当和/或比其更好：(i)嗜热链球菌st10dsm25246,(iii)嗜酸乳杆菌la02dsm21717(*),(iv)唾液乳杆菌ls01dsm22775(*),(v)唾液乳杆菌ls03dsm22776,(viii)罗伊氏乳杆菌lre09dsm25685,(ix)长双歧杆菌dlbl07(dsm25669)、长双歧杆菌dlbl08(dsm25670)、长双歧杆菌dlbl09(dsm25671)、长双歧杆菌dlbl10(dsm25672)和长双歧杆菌dlbl11(dsm25673)的混合物(1:1:1:1:1),(xi)德氏乳杆菌德氏亚种ldd01id1391dsm22106,(xvi)长双歧杆菌w11lmgp-21586。(*)数据显示在图3中。图3(针对炎性损伤的小肠细胞保护)涉及对小肠细胞(caco-2)的保护程度的评估，所述小肠细胞(caco-2)在促炎性刺激(细胞因子tnf-a和il-1b)之前用细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079lkef和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080以及其它细菌菌株进行预处理。因此，从图3[相对于未经刺激的caco-2的基础teer值，评估的膜完整性百分比(基础值等于100％；促炎性刺激等于40％；在24小时读数)]可以推断，在能够将teer值相对于基础值减少至40％的促炎性刺激之前，采用细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080的预处理有助于保持由caco-2细胞形成的上皮层的完整性，因其保持了86％的完整性百分比。图3显示了采用显示出更大粘附的三种菌株进行预处理后的由上皮所维持的完整性的百分比。在能够将肠屏障的完整性相对于基础值减少至至多40％的促炎性刺激之前，采用细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080的预处理有助于保持由caco-2细胞形成的上皮层的完整性，因其将膜完整性百分比维持在86％。恢复规程(促炎性刺激物+益生菌菌株)发明人然后继续测试了所考虑的菌株是否能够恢复由于与促炎性细胞因子il-1β和tnf-α的预温育所损害的膜完整性。由图4[针对受促炎性因子刺激的caco-2细胞的teer值所测定的膜完整性的倍数增加(fi)(受促炎性刺激物刺激的caco-2细胞的teer值等于1；在24小时读数)]可以推断。炎性侵袭后24小时，所有受测菌株都有助于恢复受炎性刺激损害的膜完整性，且如图4中可见，细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079lkef和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080以及其它菌株能够使teer值回到基础值(未经刺激的caco-2)。这些数据表明，使用所考虑的菌株来处理由caco-2细胞形成且受到促炎性刺激物的存在所损伤的上皮恢复了基础teer值，并且包括细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080在内的几种菌株导致了膜完整性的改善。由前文看出，从开菲尔(kefir)分离的细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080显示出优异且惊人的粘附于上皮的能力。此外，细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080显示出双重作用：(i)保护作用和(ii)在因细胞因子tnf-α和il-1β存在所致的促炎性刺激之后恢复小肠上皮的作用。上文所示的性质支持了将细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079和/或开菲尔乳杆菌lkf02dsm32080用在儿科学中产生和/或维持体内稳态状态以及用于预防性和/或疗愈性治疗成年受试者中且在慢性期的炎性肠疾病，例如肠易激综合征(ibs)、炎性肠病(ibd)、克罗恩病和溃疡性结肠炎(uc)。申请人还进行了从人粪便样品中回收细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079lkef的检测。dna提取使用qiaampdnastoolminikit根据制造商说明书(qiagen,意大利)在施用后1个月从粪便样品提取总dna。规程包括在污物通过的同时使dna与qiamp硅胶膜特异性结合。定量实时pcr为了对粪便样品中的细菌菌株开菲尔乳杆菌lkf01dsm32079进行定量，使用了以下引物：-lk15’caacaatcaaaggggttgttg3’；-lk25’tcactaggagtaattgaacca3’。通过sybr绿染料型荧光检测器使用rotor-generg3000a检测系统进行实时pcr。扩增由以下组成：在95℃维持10分钟，随后进行在95℃60秒、在50℃60秒、在72℃60秒的35次循环，并在72℃最终维持10分钟。对于标准物，对靶细菌的纯培养物连续(10倍)稀释并随后对每个稀释液进行dna提取，从而获得ct和细菌数目之间的线性关系。申请人特别参照对20个受试者(4位男性和16位女性，平均年龄40岁)进行的临床评估进行了关于肠定殖的研究，所述20个受试者分为两组：在1个月中采用餐前施用的10个受试者和餐后施用的10个受试者，每天施用5滴基于植物油的组合物。图7涉及在1个月中10个受试者在早餐前15至30分钟施用5滴剂量的所述基于油的组合物。仅1个受试者因在第21(二十一)天接受抗生素治疗而离开研究。然而，图8涉及在1个月中10个受试者在餐后施用5滴剂量的所述基于油的组合物。两个受试者因摄入剂量的不一致而离开研究。在施用菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)后1个月，在餐前施用和餐后施用的参与研究的所有受试者的粪便中可见所述微生物。这些数据揭示出菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)的高定殖能力，该菌株不仅能在胃环境中存活，而且在人小肠中保持且持续具有生活力。此外还进行了几个稳定性测试，图9-10-11。第一稳定性测试(图9)涉及在至多6个月中经受37℃恒温的无损胶囊包装(未分散于油中)中的菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)的稳定性的评估，图9。图9中所示数据显示，连续暴露于37℃1周不会显著影响组合物/菌株的稳定性。暴露于37℃1个月与在25℃分散于油中1个月的相同微生物基本相同。第二稳定性测试(图10)涉及从胶囊的内容物在容纳在瓶中的油中分散的时刻起到至多1个月以后期间随时间对菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)的评估，图10。参照在25℃接触30天，图10中所示数据揭示了分散在油中的非微胶囊化的微生物(裸露细胞)的优异稳定性。特别是，其证实了近乎完全的膜完整性(细胞荧光计评估)，这意味着所述微生物在结构上不受存在于油中的影响。因此，如待施用的最终产品所宣称的菌株开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)的益生菌细胞含量/浓度在其于植物油中存在1个月后得到保证。第三稳定性测试(图11)涉及从胶囊中的内容物在瓶中所容纳的油中分散的时刻起的开菲尔乳杆菌lkf01(dsm32079)的评估，其在3个不同温度(25℃、30℃、33℃)温育3天，图11。图11所示数据展示出所示微生物即使在经受高于推荐温度的储存温度3天时也具有优异的存活率。菌株表征菌株：开菲尔乳杆菌内部识别号-id:id1927益生菌商业代码:lkf01dsmz国际保藏中心的保藏号:dsm32079菌株表征来源菌株开菲尔乳杆菌(lactobacilluskefiri)分离自开菲尔颗粒。所有分析都在隶属于波比奥泰克股份公司的mofinalcegroup的附属机构biolabresearchsrl的实验室进行。生化表征1)糖发酵谱(api50chl,biomérieux)2)酶谱(apizym,biomérieux)3)蛋白谱(在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳-图12)，其中：1.菌株：开菲尔乳杆菌_lkf01(id1927)–mastercellbank(mcb来源)2.菌株：开菲尔乳杆菌_lkf01(id1927)–mastercellbank(第6代子培养物)3.阳性参照：开菲尔乳杆菌–dsm205874.阴性参照：婴儿双歧杆菌(b.infantis)bi05–dsm28652途径1-2：菌株的mastercellbank培养物的蛋白谱；(见线条)；途径1-2和3：菌株的谱是开菲尔乳杆菌种的特征(见箭头)；途径4和1-2：菌株的蛋白谱不同于由属于不同物种的菌株(婴儿双歧杆菌dsm28652；见十字形)获得的蛋白谱。分子表征物种特异性分类：4)利用引物lk1/lk2的聚合酶链式反应(pcr)(图13)对于开菲尔乳杆菌的阳性反应，其中：1.pcr标记物：sigma50-2000bp2.空白:无dna3.阴性参照：布氏乳杆菌(l.buchneri)dsm200574.阳性参照：开菲尔乳杆菌dsm205875.菌株：开菲尔乳杆菌_lkf01id19276.菌株：开菲尔乳杆菌_lkf01id19275)16srdna基因测序采用blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)获得的结果评分：用于评估识别项的生物相关性的数字。在序列比对中，评分为描述比对的整体品质的数值。更高的数字对应于更大的相似性。e-值(期望值)：在研究者正确解读的情况下，指示表明两个生物序列之间的相关性的分数的可能性的值。e-值越低，则评分越显著。遗传谱6)通过noti的脉冲场凝胶电泳(pfge-图14)，其中：1.标志物：sigma50-1,000kb2.开菲尔乳杆菌lkf01id1927–来源-mastercellbank3.开菲尔乳杆菌lkf01id1927–第6代子培养物-mastercellbank菌株表征菌株：开菲尔乳杆菌内部识别号-id:id1911益生菌商业代码:lkf02dsmz国际保藏中心的保藏号:dsm32080来源菌株开菲尔乳杆菌分离自开菲尔颗粒。所有分析都在隶属于波比奥泰克股份公司的mofinalcegroup的附属机构biolabresearchsrl的实验室进行。生化表征1)糖发酵谱(api50chl,biomérieux)n.糖结果n.糖结果0对照-25柠檬酸秦皮甲素铁+1甘油-26水杨甙-2赤藓糖醇-27d-纤维二糖-3d-阿拉伯糖-28d-麦芽糖+4l-阿拉伯糖+29d-乳糖+5d-核糖+30d-蜜二糖+6d-木糖-31d-蔗糖-7l-木糖-32d-海藻糖-8核糖醇-33菊粉-9甲基-βd-吡喃木糖苷-34d-松三糖-10d-半乳糖+35d-棉子糖+11d-葡萄糖+36淀粉-12d-果糖+37糖原-13d-甘露糖-38木糖醇-14l-山梨糖-39龙胆二糖-15l-鼠李糖-40d-松二糖-16卫矛醇-41d-来苏糖-17肌醇-42d-塔格糖-18d-甘露糖醇-43d-岩藻糖-19d-山梨糖醇-44l-岩藻糖-20甲基-αd-吡喃甘露糖苷-45d-阿糖醇-21甲基-αd-吡喃葡萄糖苷-46l-阿糖醇-22n-乙酰-氨基葡萄糖-47葡萄糖酸钾+23苦杏仁苷-482-酮葡萄糖酸钾-24熊果苷-495-酮葡萄糖酸钾-2)酶谱(apizym,biomérieux)3)蛋白谱(在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳-图15)，其中：1.阳性参照：开菲尔乳杆菌–dsm205872.菌株：开菲尔乳杆菌_lkf02(id1911)–mastercellbank(来源)3.菌株：开菲尔乳杆菌_lkf02(id1911)–mastercellbank(子培养物13#6)4.阴性参照：婴儿双歧杆菌bi05–dsm28652途径2-3：菌株的mastercellbank培养物的蛋白谱；(见线条)；途径1和2-3：菌株的谱是开菲尔乳杆菌种的特征(见箭头)；途径4和2-3：菌株的蛋白谱不同于由属于不同物种的菌株(婴儿双歧杆菌dsm28652；见十字形)获得的蛋白谱。分子表征物种特异性分类：4)利用引物lk1/lk2的聚合酶链式反应(pcr-图16)对于开菲尔乳杆菌的阳性反应1.pcr标记物：sigma50-3000bp2.空白:无dna3.阴性参照：布氏乳杆菌dsm200574.阴性参照：发酵乳杆菌dsm200525.阳性参照：开菲尔乳杆菌dsm205876.菌株：开菲尔乳杆菌_lkf02id19117.菌株：开菲尔乳杆菌_lkf02id19115)16srdna基因测序采用blast程序获得的结果(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)评分：用于评估识别项的生物相关性的数字。在序列比对中，评分为描述比对的整体品质的数值。更高的数字对应于更大的相似性。e-值(期望值)：在研究者正确解读的情况下，指示表明两个生物序列之间的相关性的分数的可能性的值。e-值越低，则评分越显著。遗传谱6)通过noti的脉冲场凝胶电泳(pfge-图17)其中：1.电泳标志物：sigma50-1,000kb2.开菲尔乳杆菌lkf02id1911–来源-mastercellbank3.开菲尔乳杆菌lkf02id1911–第6代子培养物-mastercellbank参考文献1.mognal,delpianom,deiddaf,nicolas,soattinil,debiaggir,sforzaf,strozzig,mognag.assessmentoftheinvitroinhibitoryactivityofspecificprobioticbacteriaagainstdifferentescherichiacolistrains.jclingastroenterol.20122.marchiandoam,grahamwv,turnerjr.epithelialbarriersinhomeostasisanddisease.annurevpathol.2010；5:119-44.3.farhadia,banana,fieldsj,keshavarziana.intestinalbarrier:aninterfacebetweenhealthanddisease.jgastroenterolhepatol.2003may；18(5):479-97.4.ohlandcl1,macnaughtonwk.probioticbacteriaandintestinalepithelialbarrierfunction.amjphysiolgastrointestliverphysiol.2010jun；298(6):g807-19.5.miyauchie,o'callaghanj,buttólf,hurleyg,melgars,tanabes,shanahanf,nallyk,o'toolepw.mechanismofprotectionoftransepithelialbarrierfunctionbylactobacillussalivarius:straindependenceandattenuationbybacteriocinproduction.amjphysiolgastrointestliverphysiol.2012nov1；303(9):g1029-416.vanhemerts,ormelg.influenceofthemultispeciesprobioticecologicbarrieronparametersofintestinalbarrierfunction.foodandnutritionsciences2014,5,1739-17457.kebouchim等，implicationofsortase-dependentproteinsofstreptococcusthermophilusinadhesiontohumanintestinalepithelialcelllinesandbilesalttolerance.applmicrobiolbiotechnol.2016年1月28日。当前第1页12