嵌合犬抗CD20抗体的制作方法

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本发明涉及针对犬蛋白CD20的犬源化嵌合抗CD20抗体和用于治疗狗中的某些病症诸如非霍奇金氏B细胞淋巴瘤的方法。

本发明处于治疗癌症的领域中。

犬淋巴瘤是多样的一组癌症，并且在狗中诊断的最常见的癌症中。它们总共占狗中诊断的所有癌症的大约7-14％。存在超过30种所述类型的犬淋巴瘤，并且这些癌症的行为差别巨大。一些进展迅速，并且在未治疗的情况下严重危及生命，而其他则进展非常缓慢，并且作为慢性、无痛性疾病进行管控。淋巴瘤可以影响体内的任何器官，但最常见起始于淋巴结，然后扩散至其他器官，诸如脾脏、肝脏和骨髓。

CD20是具有四个跨膜区的细胞表面蛋白。CD20分子参与B细胞增殖和分化的调节。CD20抗原仅存在于几乎所有正常和恶性的B细胞的表面上。

利妥昔单抗是针对主要存在于免疫系统B细胞的表面上的人蛋白CD20的嵌合单克隆抗体。利妥昔单抗破坏B细胞，且因此用于治疗人中的疾病，所述疾病特征在于过量的B细胞、过度反应的B细胞或功能失调的B细胞。这包括许多淋巴瘤、白血病、移植排斥和自身免疫病。

利妥昔单抗破坏在其表面具有CD20的正常和恶性人B细胞。该作用导致从身体消除B细胞(包括癌性B细胞)，允许新的健康B细胞群体从淋巴干细胞发育。

不幸的是，犬淋巴瘤的治愈仍然很难，并且存在对于更多且不同的可证明有效治疗它们的疗法的需求。

K9LO-133是一种嵌合抗CD20抗体，其靶向狗中的成熟B淋巴细胞。K9LO-133结合犬B淋巴细胞上的CD20。K9LO-133潜在可用于治疗狗中的非霍奇金氏B细胞淋巴瘤和其他类型的淋巴瘤。

因此，本发明提供了特异性结合犬CD20的抗体。本发明还提供了通过向需要这种治疗的淋巴瘤癌症犬患者施用有效量的特异性结合犬CD20的抗体来治疗犬患者中的淋巴瘤的方法。本发明提供了药物组合物，其包含特异性结合犬CD20的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明还提供了特异性结合犬CD20并且还结合蛋白A的抗体。

附图简述

图1描绘了用K9LO-133抗体治疗的狗中-5至37天的B淋巴细胞CD21+和CD22+以及T淋巴细胞CD4+和CD8+的血清水平。

详述

除非另有指明，术语“抗体”(Ab)是指包含由二硫键互连的两条重链(HC)和两条轻链(LC)的免疫球蛋白分子。每条链的氨基端部分包括约100至约110个氨基酸的可变区，其主要负责经由其中含有的互补决定区(CDRs)的抗原识别。每条链的羧基端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指保留结合其抗原的能力的任何抗体片段。此类“抗原结合片段”可以选自Fv、scFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc片段和双抗体。抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变区。优选地，抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)。更优选地，如本文所用的抗原结合片段包含HCVR和LCVR，其赋予针对犬CD20的抗原结合特异性(即，“犬CD20结合片段”)。

如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体或其抗原结合片段的LC和HC多肽的可变区内发现的非邻接的抗原组合位点。这些特定区域已经由其他人描述，包括Kabat, 等人, Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat等人, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH出版号91-3242 (1991); Chothia, 等人, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); MacCallum, 等人, J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996);和North, 等人, J. Mol. Biol., 406, 228-256 (2011)，其中当与彼此相比时，所述定义包括氨基酸残基的重叠或子集。

如本文所用，术语“轻链可变区”是指抗体分子的LC的一部分，其包括互补决定区(CDRs；即，LCDR1、LCDR2和LCDR3)和轻链构架区(LFRWs)的氨基酸序列。

如本文所用，术语“重链可变区(HCVR)”是指抗体分子的HC的一部分，其包括互补决定区(CDRs；即，HCDR1、HCDR2和HCDR3)和重链构架区(HFRWs)的氨基酸序列。

CDR散布在被称为构架区("FRW")的更保守的区域中。每个LCVR和HCVR均由三个CDR和四个FRW构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FRW1、CDR1、FRW2、CDR2、FRW3、CDR3、FRW4。轻链的三个CDR被称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”，且HC的三个CDR被称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。所述CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。LCVR和HCVR区内的CDR氨基酸残基的编号和定位是根据已知的惯例(例如，Kabat (1991)、Chothia (1987)和/或North (2011))。在本发明的不同实施方案中，抗体的FRW可以与种系序列相同，或可以是天然或人工修饰的。

在某些实施方案中，将用于本发明的方法和/或用途的抗CD20 Ab改变以提高或降低所述抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列、使得生成或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现向抗体的糖基化位点的添加或缺失。

除非另有指明，当通过数字指抗体中的氨基酸残基时，本文中如本领域中常用地使用EU编号系统(参见，例如，Kabat, 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH出版号91-3242 (1991))。

如本文所用，术语“药剂盒”是指包含至少两个单独容器的包装，其中第一容器含有K9LO-133 Ab，且第二容器含有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。如本文所用，术语“药剂盒”还指包含至少两个单独容器的包装，其中第一容器含有K9LO-133 Ab和优选用于治疗除了淋巴瘤以外的癌症的另一种抗体。“药剂盒”还可以包括将这些第一和第二容器的全部或部分内容物施用于癌症患者的说明书。任选地，这些药剂盒还包括含有包含已知化学治疗剂的组合物的第三容器。

如本文所用，术语“治疗(treating、to treat或treatment)”是指抑制、减缓、阻止、减少或逆转现有症状、病症、病况或疾病的进程或严重程度。

如本文所用，术语“有效量”是指犬源化抗CD20 Ab的量或剂量，向患者施用单个或多个剂量后，所述量或剂量在诊断或治疗的患者中提供有效响应。

如本文所用，术语患者的“有效响应”或患者对用药剂组合的治疗的“响应性”或“治疗效果”是指，在施用犬源化抗CD20 Ab后，赋予患者的临床或治疗益处。此类益处包括以下中的任何一种或多种：延长存活期(包括总体存活期和无进展存活期)；导致客观响应(包括完全响应或部分响应)；减少B细胞的量，降低患者血液或其他组织和体液中的B细胞的浓度，肿瘤消退，肿瘤重量或尺寸缩小，更长的疾病进展时间，增加的存活持续时间，更长的无进展存活期，改善的总体响应率，增加的响应持续时间，和改善的生活质量和/或改善癌症的体征或症状，等。

有效量可以由主治诊断专家，作为本领域技术人员，通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果而容易地确定。在确定用于患者的有效量时，主治诊断专家考虑许多因素，包括但不限于：患者的物种或品种；其大小、年龄和总体健康；所涉及的具体疾病或病症；疾病或病症的程度或涉及或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；施用模式；施用的制备物的生物利用度特征；选择的剂量方案；合并用药的使用；和其他相关情况。

K9LO-133

AME-133V是第二代人源化IgG1单克隆抗体。K9LO-133是特异性结合狗中的CD20蛋白的AME-133V的部分犬源化(具有犬恒定区的人可变区)同种型C单克隆抗体形式。

在一个实施方案中，K9LO-133含有重链和轻链的工程改造的可变区、CDR和构架。在一个实施方案中，引入K9LO-133的LCDR1中的残基变体。在一个实施方案中，K9LO-133的LCDR1中的残基变体是V165G。在一个实施方案中，引入变体铰链区。在一个实施方案中，添加铰链下游的变体区。在一个实施方案中，铰链下游的变体区允许K9LO-133结合蛋白A。

K9LO-133具有对应于SEQ ID NO:1的重链氨基酸序列和编码SEQ ID NO:1的氨基酸的相应核苷酸序列SEQ ID NO:2。K9LO-133具有SEQ ID NO:3的重链可变区序列。重链可变序列区还由HFWK 1 (SEQ ID NO:4)、HCDR1 (SEQ ID NO:5)、HFWK 2 (SEQ ID NO:6)、HCDR2 (SEQ ID NO:7)、HFWK3 (SEQ ID NO:8)和HCDR3 (SEQ ID NO:9)组成。

K9LO-133具有对应于SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列和编码SEQ ID NO:10的氨基酸的相应核苷酸序列SEQ ID NO:11。K9LO-133具有SEQ ID NO:12的轻链可变区序列。轻链可变序列区还由LFWK 1 (SEQ ID NO:13)、LCDR1 (SEQ ID NO:14)、LFWK 2 (SEQ ID NO:15)、LCDR2 (SEQ ID NO:16)、LFWK 3 (SEQ ID NO:17)、LCDR3 (SEQ ID NO:18)和J区(SEQ ID NO:19)组成。

犬淋巴瘤组织中的CD20表达

可以使用用AME-133V和K9LO-133的免疫组织化学(IHC)评估犬淋巴瘤组织中的CD20表达。为了检测结合，AME-133V和K9LO-133可以以一种浓度(例如10μg/mL)应用于犬淋巴瘤样品的冷冻切片。此外，AME-133V和K9LO-133可以被适当的物种和同种型匹配的阴性对照抗体取代，所述阴性对照抗体具有与检测抗体不同的抗原特异性，例如人IgG1，命名为HuIgG1，(对于AME-133V)和狗IgG，命名为DgIgG(对于K9LO-133)。通过从测定省略检测抗体或阴性对照抗体可以产生其他对照(测定对照)。

当基本上如上所述测试时，AME-133V和K9LO-133产生>75％的阳性对照单核白细胞的3+染色。对于K9LO-133，在犬脾脏中的白髓中的淋巴细胞中观察到3+染色。AME-133V和K9LO-133没有与犬脾脏中的阴性对照平滑肌细胞(特别是K9LO-133的细胞核)特异性反应。阴性对照抗体HuIgG1和DgIgG不与犬脾脏中的阳性或阴性对照组织要素特异性反应。测定对照载片也没有染色。AME-133V和K9LO-133与阳性对照组织要素的特异性反应和与阴性对照组织要素的特异性反应的缺乏，以及阴性对照抗体的反应性的缺乏，表明该测定是灵敏的、特异性的且可重复的。

在检查的10个犬淋巴瘤样品中的8个中，在> 75％的肿瘤细胞中检测到CD20。在其他样品中，1-5％的肿瘤细胞对CD20染色阳性。

K9LO-133治疗的狗

利妥昔单抗用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的人剂量为375 mg/m²。通常，犬化学治疗剂量是人剂量的40％，与癌症类型无关。因此，并且不受理论束缚，用于犬非霍奇金氏淋巴瘤的抗CD20抗体的适当起始剂量为约150 mg/m²。为了调整7 kg狗的体表面积，通过乘以0.37来校正150 mg/m²数量。向狗施用的K9LO-133的所得剂量为约57 mg/狗。

在一个实施方案中，向狗施用的K9LO-133的剂量为约140 mg至约160 mg/平方米体表面积。在一个实施方案中，向狗施用的K9LO-133的剂量为约130 mg至约170 mg/平方米体表面积。在一个实施方案中，向狗施用的K9LO-133的剂量为约110 mg至约190 mg/平方米体表面积。在一个实施方案中，向狗施用的K9LO-133的剂量为约50 mg至约250 mg/平方米体表面积。

在一个实施方案中，向狗施用的K9LO-133的剂量为约50 mg/狗至约60 mg/狗。在另一个实施方案中，向狗施用的K9LO-133的剂量为约40 mg/狗至约70 mg/狗。在一个实施方案中，向狗施用的K9LO-133的剂量为约30 mg/狗至约100 mg/狗。在一个实施方案中，向狗施用的K9LO-133的剂量为约10 mg/狗至约1000 mg/狗。

在第0、7和35天在狗中通过以约150 mg/m²向它们静脉内(IV)给药来测定K9LO-133的效力。使三只雌性比格犬适应研究条件7天，在此期间它们经受身体检查；体重测量；和日常临床观察。在给药日，经由以0.5至1mL/min的速率缓慢IV输注来向狗给药57mg K9LO-133。

在第-5天、第2天、第9天、第16天、第23天、第30天和第37天收集血液用于测定淋巴细胞比例和血清保留。

如图1中所描绘，在用K9LO-133处理后血液B淋巴细胞的比例下降。B淋巴细胞(CD21+和CD22+)的比例在第2天降低，在第2天和第30天之间显示恢复，但到第37天尚未恢复至基线水平。CD8+ T淋巴细胞显示在第16天减少，但到第23天已恢复至基线水平。CD4+ T淋巴细胞的比例保持相对恒定。

因此，IV施用K9LO-133减少循环中的B淋巴细胞计数，其中治疗的狗中的CD8+ T淋巴细胞瞬时减少。

在一个方面，本文公开了抗体，所述抗体具有其氨基酸序列为SEQ ID NO:12中给出的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)和其氨基酸序列为SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合犬CD20。

在另一个方面，本文公开了抗体，所述抗体具有其氨基酸序列为SEQ ID NO:10中给出的氨基酸序列的轻链(LC)和其氨基酸序列为SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列的重链(HC)。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合犬CD20。

在一个方面，本文公开了抗体，所述抗体具有各自具有SEQ ID NO:10中给出的氨基酸序列的两条轻链(LC)和各自具有SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列的两条重链(HC)。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合犬CD20。

在另一个方面，公开了治疗犬患者中的淋巴瘤的方法，其包括向需要这种治疗的淋巴瘤癌症犬患者施用有效量的抗体，所述抗体具有其氨基酸序列为SEQ ID NO:12中给出的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)和其氨基酸序列为SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)，且所述抗体特异性结合犬CD20。在一个实施方案中，所述抗体具有其氨基酸序列为SEQ ID NO:10中给出的氨基酸序列的轻链(LC)和其氨基酸序列为SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列的重链(HC)。在一个实施方案中，所述抗体是K9LO-133。

在一个方面，公开了药剂盒，其具有含有K9LO-133与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

在另一个方面，公开了抗体，所述抗体具有其氨基酸序列为SEQ ID NO:10中给出的氨基酸序列的轻链(LC)和其氨基酸序列为SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列的重链(HC)，且所述抗体特异性结合犬CD20且所述抗体结合蛋白A。

实施例

K9LO-133

K9LO-133可以在10 mM柠檬酸盐、150 mM NaCl (pH 6.5)中以26.3 mg/mL提供。媒介物可以是0.9％ NaCl的生理盐水。

K9LO-133的给药可以基于体表面积，其在本研究中对于狗被估计为0.37 m²。每只狗在每个剂量下接受150 mg/m² (57 mg)的K9LO-133。通过吸取57 mg (2.2 mL)的K9LO-133并在27.8 mL生理盐水中稀释以使总体积达到30 mL用于输注来制备剂量。

流式细胞术

T淋巴细胞(CD4+和CD8+)和B淋巴细胞(CD21+和CD22+)的量可以通过流式细胞术测定。在进食之前进行血液收集用于流式细胞术。在基线(第-5天)和在第2天、第9天、第16天、第23天、第30天和第37天从3只狗提供近似1 mL EDTA抗凝血。用氯化铵低渗缓冲液裂解红细胞，并用与犬CD4、CD8、CD21和CD22反应的抗体染色白细胞。然后，除去未结合的抗体，并获得FACScan或FACSAria流式细胞仪中10,000个白细胞事件的获取。

淋巴瘤样品

将10个冷冻犬淋巴瘤样品修整并包埋在Tissue-Tek® OCT(最佳切割温度)化合物中并储存在设置为保持-80℃的冰箱中直至切片。以近似5μm切割切片以生成适当数量的载片用于随后的IHC染色。

免疫组织化学染色

使用AME-133V(针对人CD20的人IgG1单克隆抗体)和K9LO-133(针对犬CD20的嵌合犬同种型C单克隆抗体)使用IHC如下详述将来自每个淋巴瘤样品的切片进行染色。AME-133V在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中的19.5 mg/mL溶液中。K9LO-133在PBS (pH 7.4)中的2.5 mg/mL溶液中。

进行IHC染色，在每次染色运行中包括使用阳性和阴性对照材料，并使用阴性对照抗体和测定对照的额外载片以确保染色特异性。染色程序、一抗和二抗稀释液以及AME-133V的对照在初步染色运行中是合格的。染色程序、一抗和二抗稀释液以及K9LO-133的对照在方法开发染色运行中是合格的。

AME-133V染色

间接免疫过氧化物酶程序可用于用AME-133V染色犬淋巴瘤组织以检测CD20。在切片时，将载片在室温下在丙酮中固定10分钟。将丙酮固定的冷冻切片在磷酸盐缓冲盐水、0.15 M NaCl、pH 7.2 PBS中冲洗两次。然后通过将载片与Biocare PeroxAbolish在室温下孵育5分钟来淬灭内源过氧化物酶。接下来，将载片用PBS冲洗两次，与抗生物素蛋白溶液孵育15分钟，用PBS冲洗一次，与生物素溶液孵育15分钟，并用PBS冲洗一次。然后将载片用设计用于减少非特异性结合的蛋白封闭物处理20分钟。蛋白封闭物如下制备：PBS + 1%牛血清白蛋白(BSA)；0.5％酪蛋白；和3％驴血清。

在蛋白封闭物之后，将一抗AME-133V、人IgG1或无抗体以10μg/mL的浓度应用于载片1小时。然后，将载片用PBS冲洗两次，并将生物素化的二抗(驴抗人IgG)应用于载片30分钟。接下来，将载片用PBS冲洗两次，与ABC Elite试剂反应30分钟，并用PBS冲洗两次。接下来，应用DAB（作为过氧化物酶反应的底物） 4分钟。所有载片都用自来水冲洗，复染，脱水并封固。PBS + 1% BSA充当一抗和ABC Elite试剂的稀释剂。(PBS + 1% BSA) + 犬IgG (1:25稀释)充当二抗的稀释剂。

K9LO-133染色

间接免疫过氧化物酶程序可用于用K9LO-133染色犬淋巴瘤组织以检测CD20。可以根据以下方法消除对标记(例如生物素、过氧化物酶或荧光素)K9LO-133和排除二级标记的抗犬IgG和检查的组织内源的IgG之间的非特异性反应性的要求。通过在应用于组织冷冻切片之前过夜孵育一抗/二抗混合物，使标记的二抗特异性附着至未标记的一抗(K9LO-133、DgIgG或无抗体)。将检测试剂或阴性对照抗体(浓度为10μg/mL)与生物素化的兔抗狗IgG、Fc片段特异性抗体(RbαDgIgG)以15μg/mL的浓度混合，以便在染色前一天实现1:1.5的一抗：二抗比率。

将预复合的抗体在设置为保持4℃的冰箱中的摇动机构上孵育过夜。在第二天使用抗体前，将狗γ球蛋白添加至每个小瓶中以达到3 mg/mL的最终浓度，且然后在设置为保持4℃的冰箱中的摇动机构上孵育至少2小时。在切片时，将载片在室温下在丙酮中固定10分钟。在染色当天，将载片用Tris缓冲盐水、0.15M NaCl、pH 7.6 TBS冲洗两次。然后通过将载片与适当的试剂诸如Biocare PeroxAbolish试剂在室温下孵育5分钟来淬灭内源过氧化物酶。接下来，将载片用TBS冲洗两次，与抗生物素蛋白溶液孵育15分钟，用TBS冲洗一次，与生物素溶液孵育15分钟，并用TBS冲洗一次。然后将载片用设计用于减少非特异性结合的蛋白封闭物处理20分钟。

蛋白封闭物如下制备：TBS + 1%牛血清白蛋白(BSA)；0.5％酪蛋白；和3％正常兔血清。在蛋白封闭物之后，将预复合的一抗和二抗应用于载片两小时。接下来，将载片用TBS冲洗两次，用ABC Elite试剂处理30分钟，用TBS冲洗两次，且然后用DAB（作为过氧化物酶反应的底物）处理4分钟。所有载片都用自来水冲洗，复染，脱水并封固。TBS + 1% BSA充当所有抗体和ABC试剂的稀释剂。每次染色运行都包括犬脾脏的冷冻切片的阳性对照(单核白细胞)和阴性对照(平滑肌细胞)。

序列表

<110> Eli Lilly and Company

<120> 嵌合犬抗CD20抗体

<130> P20914

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 456

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser

50 55 60

Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Gln Ser Gly Ser Thr Val

130 135 140

Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His

195 200 205

Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn

210 215 220

Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Ser

275 280 285

Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser Asn

290 295 300

Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly Gln Ala His Gln

340 345 350

Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys Asn

355 360 365

Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile

370 375 380

Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr

385 390 395 400

Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe

420 425 430

Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Ile

435 440 445

Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 2

<211> 1377

<212> DNA

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 2

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggccg tacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatgggggct atttatccct tgacgggtga tacttcctac 180

aatcagaagt cgaaactcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgact 300

tacgtgggcg gtgactggca gttcgatgtc tggggcaagg ggaccacggt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccacggcccc ctcggttttc ccgctagcgc ccagctgtgg gtcccaatcc 420

ggctccacgg tggccctggc ctgcctggtg tcaggctaca tccccgagcc tgtaactgtg 480

tcctggaatt ccggctcctt gaccagcggt gtgcacacct tcccgtccgt cctgcagtcc 540

tcagggctct actccctcag cagcatggtg acagtgccct ccagcaggtg gcccagcgag 600

accttcacct gcaatgtggc ccacccggcc accaacacta aagtagacaa gccagtgccc 660

aaaagagaaa atggaagagt tcctcgccca cctgattgtc ccaaatgccc agcccctgaa 720

ctgctgggag ggccttcggt cttcatcttt cccccaaaac ccaaggacac cctcttgatt 780

gcccgaacac ctgaggtcac atgtgtggtg gtggatctgg acccagaaaa ccctgaggtg 840

cagatcagct ggttcgtgga tagtaagcag gtgcaaacag ccaacacgca gcctcgtgag 900

gagcagtcca atggcaccta ccgtgtggtc agtgtcctcc ccattgggca ccaggactgg 960

ctttcaggga agcagttcaa gtgcaaagtc aacaacaaag ccctcccatc ccccattgag 1020

gagatcatct ccaagacccc agggcaggcc catcagccta atgtgtatgt cctgccgcca 1080

tcgcgggatg agatgagcaa gaatacggtc accctgacct gtctggtcaa agacttcttc 1140

ccacctgaga ttgatgtgga gtggcagagc aatggacagc aggagcctga gagcaagtac 1200

cgcatgaccc cgccccagct ggatgaagat gggtcctact tcctatacag caagctctcc 1260

gtggacaaga gccgctggca gcggggagac accttcatat gtgcggtgat gcatgaagct 1320

ctacacaacc actacacaca gatatccctc tcccattctc cgggtaaatg atgatag 1377

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser

50 55 60

Lys Leu Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys

20

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 5

Lys Gly Ser Gly Arg Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 6

Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 7

Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Ser Lys

1 5 10 15

Leu

<210> 8

<211> 30

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 8

Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 9

Ala Arg Ser Thr Tyr Val Gly Gly Asp Trp Gln Phe Asp Val

1 5 10

<210> 10

<211> 216

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 10

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Pro Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Asn Asp Ala Gln Pro

100 105 110

Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp Gln Leu His Thr Gly Ser

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

130 135 140

Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln Asp Thr Gly Ile Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr

165 170 175

Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser His Glu Leu Tyr Ser Cys

180 185 190

Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ser Phe Gln

195 200 205

Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val Asp

210 215

<210> 11

<211> 648

<212> DNA

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 11

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ctctcctgca gggccagccg gagtgtaccg tacatccact ggtaccagca gaaacctggc 120

caggctccca ggctcctcat ctatgccaca tccgctctgg cttctggcat cccagacagg 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggagcctgaa 240

gattttgcag tgtattactg tcagcagtgg ctgagtaacc cacccacttt tggccagggg 300

accaagctgg agatcaaacg aaatgatgcc cagccagccg tctatttgtt ccaaccatct 360

ccagaccagt tacacacagg aagtgcctct gttgtgtgct tgctgaatag cttctacccc 420

aaagacatca atgtcaagtg gaaagtggat ggtgtcatcc aagacacagg catccaggaa 480

agtgtcacag agcaggacaa ggacagtacc tacagcctca gcagcaccct gacgatgtcc 540

agtactgagt acctaagtca tgagttgtac tcctgtgaga tcactcacaa gagcctgccc 600

tccaccctca tcaagagctt ccaaaggagc gagtgtcaga gagtggac 648

<210> 12

<211> 106

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Pro Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 23

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

20

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 14

Arg Ala Ser Arg Ser Val Pro Tyr Ile His

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 15

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10

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<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 16

Tyr Ala Thr Ser Ala Leu Ala Ser

1 5

<210> 17

<211> 32

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 17

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 18

Gln Gln Trp Leu Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

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<211> 10

<212> PRT

<213> 嵌合人/狗抗CD20抗体

<400> 19

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10