用于治疗显性视网膜色素变性的AAV载体的制作方法

本申请要求于2016年3月1日提交的美国临时专利申请no.62/302,122和于2016年9月22日提交的美国临时专利申请no.62/398,451的权益，其各自的内容通过引用整体并入本文。政府支持本发明是在由国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的基金号r24-ey022012的政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。
背景技术：
：常染色体显性视网膜色素变性(autosomaldominantretinitispigmentosa，adrp)是致盲性疾病，其影响1/12,000的人。这些个体中的相当大部分在视网膜中感光细胞的集光色素蛋白(lightharvestingpigmentprotein)视紫红质的基因(rho)中携带突变。该疾病是显性的，因为从任一亲本遗传该突变基因均导致视网膜变性和最终失明。在rho中鉴定的超过100种不同的突变导致失明。目前还没有批准的用于adrp的药物或基因治疗性治疗。因此，需要适合adrp和相关病症的任何和所有原因的有效治疗选择。发明概述本申请的一些方面涉及用于在对象中(例如，在人中)治疗视网膜色素变性(例如，显性视网膜色素变性)的组合物和方法。在一些实施方案中，通过向对象(例如，向患有视网膜色素变性的对象，例如向患有显性视网膜色素变性的人)施用干扰rna分子使对象的视紫红质基因(rho基因)的一个或两个等位基因沉默。在一些实施方案中，还向对象施用替代rho基因(replacementrhogene)以提供功能性rho蛋白以恢复对象的光感受器功能。在一些实施方案中，替代rho基因相对于内源性基因等位基因具有一个或更多个核苷酸替换，其使替代基因对干扰rna的作用具有抗性。在一些实施方案中，替代rho基因是人rho基因(例如，野生型人rho基因)，其包含使该基因对由干扰rna分子介导的降解具有抗性(也称为“硬化”)的一个或更多个(例如，1、2、3、4、5个或更多个)替换。在一些实施方案中，该一个或更多个核苷酸替换在rho基因的编码序列中。在一些实施方案中，该一个或更多个核苷酸替换是沉默的(例如，其不改变rho蛋白的氨基酸序列)。在一些实施方案中，该一个或更多个替换引入氨基酸变化，但所得rho蛋白仍具有足够的功能以在治疗上有效(以恢复或维持至少部分视力或正常视力)。在一些实施方案中，可使用任何合适的技术来向对象递送干扰rna和/或替代基因。在一些实施方案中，以编码干扰rna的基因的形式向对象提供干扰rna。在一些实施方案中，编码干扰rna的基因以重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus，raav)向对象提供。在一些实施方案中，替代基因以raav向对象提供。在一些实施方案中，编码干扰rna的基因和替代基因以同一raav提供(例如其均在以aav末端反向重复(invertedterminalrepeat，itr)为侧翼的同一重组基因组上编码)。在一些实施方案中，这两种基因在同一启动子的控制之下。在一些实施方案中，基因在两种不同启动子的控制之下。在一些实施方案中，编码干扰rna的基因和替代基因以不同的raav提供。在一些实施方案中，干扰rna是合成核糖核酸(rna)分子，其包含：a)序列cugccuacauguuucugcu(seqidno：1)的有义链和序列agcagaaacauguaggcag(seqidno：2)的反义链；b)序列ccuacauguuucugcugau(seqidno：3)的有义链和序列aucagcagaaacauguagg(seqidno：4)的反义链；c)序列gcauggucaucaucauggu(seqidno：5)的有义链和序列accaugaugaugaccaugc(seqidno：6)的反义链；或d)序列guggcauucuacaucuuca(seqidno：7)的有义链和序列ugaagauguagaaugccac(seqidno：8)的反义链。在一些实施方案中，合成rna分子是小干扰rna(smallinterferingrna，sirna)。在一些实施方案中，干扰rna是小发夹rna(smallhairpinrna，shrna)。在一些实施方案中，shrna包含具有序列ucaagag(seqidno：9)的rna或序列ugugcuu(seqidno：10)的rna的环。在一些实施方案中，合成rna分子是人工微rna(microrna，mirna)。在一些实施方案中，人工mirna具有以下rna序列：ugcuguugacagugagcga(x)nuagugaagccacagaugua(y)ncugccuacugccucgga(seqidno：19)，其中：a)(x)n包含seqidno：1且(y)n包含seqidno：2；b)(x)n包含seqidno：3且(y)n包含seqidno：4；c)(x)n包含seqidno：5且(y)n包含seqidno：6；或d)(x)n包含seqidno：7且(y)n包含seqidno：8。在一些实施方案中，在上文或本申请其他部分描述的合成rna还在5′和/或3′端包含未配对的突出端序列(overhangsequence)。在一些实施方案中，未配对的突出端序列包含重复碱基的序列。在一些实施方案中，重复碱基的序列包含重复尿嘧啶(u)碱基。在一些实施方案中，未配对的突出端序列是uu。在一些实施方案中，组合物(例如，用于施用于对象的组合物)包含一种或更多种(例如，2、3或4种)在上文或本申请其他部分描述的干扰rna(例如，合成rna分子)。在一些实施方案中，组合物(例如，用于施用于对象的组合物)包含编码一种或更多种(例如，2、3或4种)在上文或本申请其他部分描述的干扰rna(例如，合成rna分子)的核酸(例如，dna)。在一些实施方案中，组合物还包含一种或更多种生理学上可接受的载体和/或一种或更多种生理学上可接受的辅料。在一些实施方案中，载体编码一种或更多种(1、2、3或4种或者更多种)shrna和/或人工mirna(例如，在上文或本文其他部分描述的)。在一些实施方案中，shrna具有seqidno：11至18中一种或更多种的序列。在一些实施方案中，载体编码替代rho基因。在一些实施方案中，载体编码替代rho基因和/或一种或更多种shrna和/或人工mirna(例如，在上文或本文其他部分描述的)。在一些实施方案中，载体是表达质粒。在一些实施方案中，载体是重组病毒基因组(例如，raav基因组)。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体包含raav基因组。在一些实施方案中，在对象中降低rho表达的方法包括向该对象施用包含一种或更多种干扰rna和/或一种或更多种载体的组合物，所述载体各自编码(例如，能够表达)在上文或本文其他部分描述的一种或更多种干扰rna。在一些实施方案中，在对象中治疗视网膜色素变性(retinitispigmentosa，rp)的方法包括向该对象施用包含干扰rna或表达干扰rna的载体的组合物和包含重组rho基因(例如编码重组rho基因的载体)的组合物二者，其中所述rho基因对干扰rna的靶向具有抗性。在一些实施方案中，重组rho基因使用raav递送。在一些实施方案中，干扰rna和重组rho基因使用同一raav递送。在一些实施方案中，干扰rna和重组rho基因二者在单启动子序列的表达控制之下。在一些实施方案中，干扰rna和重组rho基因各自在独立启动子序列(例如，组成型或诱导型启动子)的表达控制之下。在一些实施方案中，干扰rna和/或经修饰rho基因在人启动子或不同物种的启动子(例如，病毒启动子、原核生物启动子或真核生物启动子，例如来自非人灵长类、啮齿动物、狗、猫、猪或其他物种的启动子)的表达控制之下(例如，与其有效连接)。在一些实施方案中，启动子是rna聚合酶iii启动子(例如，h1rna聚合酶iii启动子)或rna聚合酶ii启动子、或rna聚合酶i启动子。在一些实施方案中，干扰rna是shrna，并且该shrna在rna聚合酶iii启动子(例如，h1rna聚合酶iii启动子)的表达控制之下。在一些实施方案中，干扰rna是人工mirna，并且该人工mirna在rna聚合酶ii启动子的表达控制之下。在一些实施方案中，重组rho基因在组成型或诱导型启动子(例如，人启动子、眼特异性启动子)的表达控制之下。在一些实施方案中，组成型或诱导型启动子是小鼠启动子(例如，小鼠视蛋白(mouseopsin，mops)启动子)。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物或狗。在一些实施方案中，哺乳动物是人(例如，患有或已知患有(例如被诊断为患有)视网膜色素变性(例如显性视网膜色素变性)的人)。这些和其他方面在以下附图、实例和权利要求书中进行描述。附图简述附图和以下简述提供了本文中所述组合物和方法的一些方面的非限制性实例。图1a-c示出了通过facs(荧光激活细胞分选(fluorescence-activatedcellsorting))测量的gfp标记的人视紫红质的敲减。该实验以三个生物学重复在293t细胞中进行。将500nggfp标记的人rhocdna与不同的sirna共转染。转染使用2000转染试剂进行。对照是购自dharmacon的非靶向sirna。将样品孵育72小时，然后通过流式细胞术分析，首先针对前向和侧向散射设门以排除非活颗粒，然后针对高于自发荧光的gfp表达设门。经对照sirna处理的gfp阳性细胞的数目设定为100％。图2示出了通过shrna的rho敲减。该实验以三个生物学重复在293t细胞中进行。将200nggfp标记的人视紫红质与包含由h1启动子驱动的shrna131、765或820的puc57共转染。将样品孵育72小时，并且如图1中通过流式细胞术测量rho敲减。图3显示，shrna切割突变和野生型rhorna二者。该实验以两个生物学重复和三个qrt-pcr重复在293t细胞中进行。使用2000将200nggfp标记的人视紫红质(wt、t17m或p23h)与raav-h1-shrna质粒(131(seqidno：11)、765(seqidno：15)或820(seqidno：17))共转染。非靶向shrna被设计成用于降解不相关的光转导蛋白(视杆(rod)环gmp门控离子通道的亚基)。将样品孵育48小时，然后进行处理用于qrt-pcr分析。图4示出了在mir30(seqidno：28)的序列环境中的sirna131有义链(seqidno：1)和反义链(seqidno：2)。在从rna聚合酶ii启动子表达之后，sirna将通过酶(细胞核中的drosha和细胞质中的dicer)从前体切除。图5a-5c示出了(图5a)取自犬视网膜的泡(bleb)区域和非泡(non-bleb)区域的活检钻取物(biopsypunch)的视紫红质免疫印迹。图5b示出了相对于组蛋白归一化的视紫红质单体量的定量。图5c是显示经归一化量的表。图6a-6b示出了犬rhorna的绝对数。图6a是犬rhorna的绝对数的图。图6b是显示绝对rna数的表。图7a-7c示出了(图7a)取自犬视网膜的泡区域和非泡区域的活检钻取物的视紫红质免疫印迹。图7b示出了相对于组蛋白归一化的视紫红质单体量的定量。图7c是显示经归一化量的表。图8a-8b示出了犬rhorna的绝对数。图8a是犬rhorna的绝对数的图。图8b是显示绝对rna数的表。图9描绘了在shrna与内源性人或硬化(hardened)rhomrna的靶序列之间发生的示例性碱基配对。所有shrna均与狗的rhomrna的靶序列完美地碱基配对。白框：shrna与内源性狗以及硬化rhomrna之间的错配。深灰色框：在rna中鸟苷与尿嘧啶之间发生的弱摆动碱基配对。浅灰色框：仅shrna与硬化rhomrna之间的错配。从上到下，序列分别对应于seqidno：29至37。图10描绘了在shrna134与内源性人或硬化rho131mrna的靶序列之间发生的示例性碱基配对。shrna131和134的靶序列接近度使得能够使用相同的硬化rho131。深灰色框：在rna中鸟苷与尿嘧啶之间发生的弱摆动碱基配对。浅灰色框：仅shrna与硬化rhomrna之间的错配。从上到下，序列分别对应于seqidno：38至40。图11描绘了编码gfp标记的人rho的质粒的示例性图谱。图12a-12c示出了编码sirna(图12a和12b)和人rho(图12c)的质粒的图谱的非限制性实例。图13a-13e示出了在wtrho+/+狗中视网膜下注射不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820下视紫红质敲减的rna和蛋白质分析。图13a示出了视网膜图谱，其显示用于western印迹分析和rna定量的活检钻取物的位置。成对的深灰色、灰色和有点圆圈(dottedcircle)表示用于每个western印迹重复的泡/经处理和非泡/未经处理区域中活检钻取物的位置，而黑色圆圈表示用于rna定量的活检钻取物的位置。图13b示出了条形图，其显示作为在同一视网膜的未经处理区域中测量的水平的百分比的经处理区域中剩余的犬视紫红质rna。图13c示出了免疫印迹，其显示取自犬视网膜的经处理(tx)和未经处理(untx)区域的活检钻取物中视紫红质的量。组蛋白h3用于归一化。条形图示出了作为在同一视网膜的未经处理区域中测量的水平的百分比的剩余犬视紫红质蛋白。图13d是显示报道为剩余rna或蛋白质的百分比的来自每个实验的数值的表。图13e是显示报道为rna或蛋白质的敲减百分比的来自每个实验的数值的另一个表。图14a-14d示出了在wt狗中视网膜下注射不同滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820之后onl和elm/is/os完整性的评估。图14a示出了onl厚度图；图14b示出了经归一化强度的elm/is/os图；图14c示出了onl厚度值；并且图14d示出了elm/is/os层的经归一化强度的值。图15a-15e示出了在突变体rhot4r/+狗中视网膜下注射不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820下视紫红质敲减的rna和蛋白质分析。图15a示出了视网膜图谱，其显示用于western印迹分析和rna定量的活检钻取物的位置。成对的深灰色、灰色和有点圆圈表示用于每个western印迹重复的泡区域和非泡区域中活检钻取物的位置，而黑色圆圈表示用于rna定量的活检钻取物的位置。图15b是显示作为在同一视网膜的未经处理区域中测量的水平的百分比的剩余犬视紫红质rna的量的条形图。图15c是免疫印迹，其显示取自犬视网膜的经处理(tx)和未经处理(untx)区域的活检钻取物中犬视紫红质的量。组蛋白h3用于归一化。条形图示出了作为在同一视网膜的未经处理区域中测量的水平的百分比的剩余犬视紫红质蛋白的量。图15d是显示报道为剩余rna或蛋白质的百分比的来自每个实验的数值的表。图15e是显示报道为rna或蛋白质的敲减百分比的来自每个实验的数值的另一个表。图16a-16d示出了octb扫描，其涵盖在暴露于引起突变体rhot4r/+狗中急性视网膜变性的短暂光剂量之后2周rhot4r/+狗的经处理(经不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820处理)和未经处理的视网膜区域。(图16a)经1×1012vg/ml处理的狗的oct扫描。(图16b)经5×1011vg/ml处理的狗的oct扫描。(图16c)经2.5×1011vg/ml处理的狗的oct扫描。(图16d)经1×1011vg/ml处理的狗的oct扫描。图17a-17b示出了来自经aav2/5-sc-h1-shrna820处理的rhot4r/+的onl厚度地形图，其显示针对光诱导的视网膜变性的保护。(图17a)未经处理的wt对照狗的onl厚度图(左图)和经5e+11vg/ml的aav2/5-sc-h1-shrna820处理的em411-os的onl厚度图，并且示出了在光诱导的损伤之后数周经处理/泡区域中保持的onl厚度。黑色和白色曲线显示如在视网膜下注射之后立即看到的泡的界限。下面的图示出了具有颜色为较深灰色(中间带)的onl的octb扫描用于可视化目的。(图17b)选择在泡外部和内部的位点用于onl厚度测量。图18示出了视网膜下不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820的突变体rhot4r/+视网膜的经处理(tx)和未经处理(untx)区域的组织学(h&e染色)和免疫组织化学(视紫红质染色为绿色并且在图18的下图中显示为浅染色；人视锥拘留蛋白(humanconearrestin)染色为红色并且在图18的下图中显示为灰色染色)。图19a-19f示出了在突变体rhot4r/+狗中视网膜下注射5×1011vg/ml滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820下视紫红质敲减和替代的rna和蛋白质分析。图19a示出了视网膜图谱，其显示用于western印迹分析和rna定量的活检钻取物的位置。成对的深灰色、灰色和有点圆圈表示用于每个western印迹重复的经处理(tx)和未经处理(untx)区域中活检钻取物的位置，而黑色圆圈表示用于rna定量的活检钻取物的位置。图19b示出了免疫印迹，其显示取自犬视网膜的经处理(tx)和未经处理(untx)区域的活检钻取物中总视紫红质(犬+人rho820)的量。组蛋白h3用于归一化。条形图示出了经处理和未经处理区域中剩余视紫红质蛋白的百分比。注意em424-od和em425-od的经处理区域中较低mw条带(对应于突变体t4rrho蛋白)的损失。图19c是显示用于蛋白质定量的每对钻取物的数值的表。图19d是显示作为在未经处理区域中测量的犬rhorna水平的百分比的经处理区域中剩余犬视紫红质rna的条形图。图19e是显示作为在未经处理区域中测量的犬rhorna水平的百分比的经处理区域中人rho820的水平的条形图。图19f是显示用于rna定量的每对钻取物的数值的表。图20a-20c示出了体内视网膜成像，其显示在经5×1011/vg/ml滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820处理的突变体rhot4r/+视网膜区域中针对光诱导的视网膜变性的保护。图20a示出了enfacecslo复合图，其显示在光暴露之后2周被保护免受变性的视网膜区域(边界由白色箭头界定)。浅灰色箭头表示图20b中所示的octb扫描在经处理区域中的位置，深灰色箭头表示图20c中所示的octb扫描在未经处理区域中的位置。图20b示出了注射之前、注射之后11周和注射之后13周/光暴露之后2周经处理区域中的octb扫描。在注射病毒载体之后的这两个时间点在整个经处理区域均保持onl厚度。图20b和30v示出了注射之前、注射之后11周和注射之后13周/光暴露之后2周未经处理区域中的octb扫描。onl被保持直至注射之后11周，但在光暴露之后2周完全丧失。图21示出了来自经5×1011/vg/ml滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820处理的两个rhot4r/+的onl厚度的地形图，其显示针对光诱导的视网膜变性的保护。图22示出了视网膜下注射有5×1011/vg/ml滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820的突变体rhot4r/+视网膜的经处理区域、过渡区和未经处理区域的免疫组织化学(视紫红质染色为绿色并且在图22的图中显示为浅染色；人视锥拘留蛋白染色为红色并且在图22的图中显示为灰色染色)。发明详述本申请的一些方面提供了可用于在对象中(例如，在患有显性视网膜色素变性的对象中)治疗视网膜色素变性的方法和组合物。在一些实施方案中，使用rna干扰来降低或抑制内源性视紫红质(例如，突变和正常视紫红质)的表达，并且通过递送被改造以移除rna抑制剂的靶位点的正常蛋白的基因来替代丢失的蛋白质。在一些实施方案中，单腺相关病毒(aav)载体用于递送rna剂(例如，小发夹rna或人工微rna)和重组rho基因二者。在一些实施方案中，小发夹rna、人工微rna(a-mir)和/或rna酶(核酶)可设计成通过靶向小鼠、人和狗中共有的序列来降解视紫红质mrna。这样的分子可用于在细胞培养物、小鼠和/或狗中测试抑制，以开发可在人患者中起作用的抑制剂。在一些实施方案中，提供了靶向人和狗视紫红质mrna二者的小干扰核酸(例如，rna)。在一些实施方案中，提供了四种消化人和犬视紫红质(rho)mrna的小干扰rna，用于耗尽人和动物中内源性产生的视紫红质的目的。在一些实施方案中，这些干扰rna靶向患有由rho中突变引起的显性遗传形式的视网膜色素变性的对象中的视紫红质表达。这些突变中的一些导致蛋白质的毒性形式，其合成必须被沉默以防止视网膜变性。在一些实施方案中，干扰核酸(例如，rna)被设计成靶向对突变rho基因具有特异性的序列(例如，其与存在于突变rho基因中而不存在于野生型rho基因中的序列互补)。然而，在一些实施方案中，干扰核酸被设计成靶向突变内源性rho基因中的野生型序列(例如，在不被干扰核酸靶向的其他位置具有一个或更多个突变)。在另一些实施方案中，提供对干扰核酸具有抗性的功能性(例如，野生型)rho基因以恢复对象中的rho活性，并且从而治疗与被干扰核酸靶向的突变内源性rho等位基因相关的疾病或病症的一种或更多种症状。在一些实施方案中，一种或更多种干扰rna可作为由启动子(例如，rna聚合酶iii启动子或其他合适的组成型或诱导型启动子)驱动的短发夹rna(shrna)或作为由启动子(例如，使用rna聚合酶ii启动子或其他合适的组成型或诱导型启动子)驱动的人工微rna(mirna)使用腺相关病毒(aav)载体递送。在一些实施方案中，同一载体表达编码正常视紫红质但对由病毒表达的sirna的作用具有抗性的基因(cdna)。表1至4中提供了干扰rna的一些非限制性实例。表1：小干扰rna(sirna)seqidno：名称rna序列1rho131-scugccuacauguuucugcu2rho131-aagcagaaacauguaggcag3rho134-sccuacauguuucugcugau4rho134-aaucagcagaaacauguagg5rho765-sgcauggucaucaucauggu6rho765-aaccaugaugaugaccaugc7rho820-sguggcauucuacaucuuca8rho820-augaagauguagaaugccac表2：发夹环rnaseqidno：rna序列9ucaagag10ugugcuu表3：小发夹rna(shrna)表4：微rna(mirna)在一些实施方案中，硬化的正常(例如，野生型)视紫红质(rho)基因可具有以下序列，其基于人rho基因(例如，具有登录号ng_009115.1所示的序列；所述序列也示于seqidno：41中)或者mrna或其蛋白质编码部分(例如，由seqidno：41的核苷酸5001-5456连接至7238-7406连接至8613-8778连接至8895-9134连接至9970-11706编码的mrna或其蛋白质编码部分，例如由seqidno：41的核苷酸5096-5456连接至7238-7406连接至8613-8778连接至8895-9134连接至9970-10080组成的编码序列)。在一些实施方案中，正常rho基因的序列被修饰成包含一个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)突变，所述突变使替代rho基因对用作敲减剂以降低治疗对象中突变内源性rho基因表达的一种或更多种干扰rna具有抗性。然而，在一些实施方案中，如果具有未修饰的正常(例如，野生型)序列的重组rho基因与在所治疗对象中靶向的内源性rho基因或等位基因具有不同的序列和如果所使用的敲减剂被设计成靶向内源性rho基因或等位基因而不是所提供的重组rho基因，则可使用具有未修饰的正常(例如，野生型)序列的重组rho基因。在一些实施方案中，可使用来自与治疗对象不同的物种的rho基因。然而，在一些实施方案中，rho基因(例如，经修饰的rho基因)可来自与所治疗对象相同的物种。在一些实施方案中，重组rho基因中的一个或更多个修饰改变编码序列的核酸序列，但不改变编码的蛋白质(例如，其是沉默突变，例如在密码子的第三位，其可包含两种或更多种不同核苷酸中的一种而不改变编码的氨基酸)。在一些实施方案中，重组rho基因不包含野生型rho基因的内含子序列。在一些实施方案中，重组rho基因编码已被修饰成对干扰rna具有抗性的rho基因的mrna(或其蛋白质编码部分)。在一些实施方案中，重组rho基因包含已被修饰成对干扰rna具有抗性的野生型编码序列。在一些实施方案中，经修饰的野生型编码序列与不是来源于野生型rhomrna的上游和/或下游mrna序列一起提供。在一些实施方案中，重组替代rho基因包含seqidno：42。seqidno：42(示于下文)编码对被称为820的干扰rna的一个实例(例如，如本文中所述的sirna820或shrna820)具有抗性的mrna序列的一部分。如图9中所示，本文中所述的820干扰rna序列靶向内源性人rhomrna中的对应序列，但是seqidno：42包含使其对820干扰rna的靶向具有抗性的四个替换(在下文中加有下划线且粗体，其对应于seqidno：41的第9014、9017、9020和9023位)。seqidno：42中的编码序列开始于seqidno：42的第88位。在一些实施方案中，所递送的重组rho基因可包含seqidno：42的编码序列(例如，开始于seqidno：42的第88位)，但具有不同的上游mrna序列。在一些实施方案中，重组rho基因可具有一个或更多个其他序列修饰(作为补充或替代)以使其对另外或替代的干扰rna(例如，本文中提供了其序列的其他干扰rna)具有抗性。在一些实施方案中，可使用靶向对象中内源性rho编码序列的不同区域的一种或更多种干扰rna。seqidno：42(经修饰的“硬化”重组人rho基因的一个非限制性实例)：因此，本文中的组合物可施用于需要治疗的对象。在一些实施方案中，所述对象患有或被怀疑患有脑和/或眼的一种或更多种病症、疾病或障碍。在一些实施方案中，所述对象患有或被怀疑患有本文中所公开的病症、疾病和障碍中的一种或更多种。在一些实施方案中，所述对象具有一个或更多个内源性突变rho等位基因(例如，与眼或视网膜的疾病或病症相关或者引起眼或视网膜的疾病或病症)。在一些实施方案中，所述对象具有至少一个显性突变rho等位基因(例如，其引起显性视网膜色素变性)。在一些实施方案中，所述对象是人。在一些实施方案中，所述对象是非人灵长类。非人灵长类对象的一些非限制性实例包括猕猴(例如，食蟹猕猴或恒河猕猴)、狨猴(marmoset)、绢毛猴(tamarin)、蜘蛛猴(spidermonkey)、枭猴(owlmonkey)、长尾猴(vervetmonkey)、松鼠猴(squirrelmonkey)、狒狒、大猩猩、黑猩猩和猩猩。另一些示例性对象包括家养动物，例如狗和猫；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。在一些实施方案中，施用于细胞或对象的raav颗粒的剂量可以在以下数量级上：106至1014个颗粒/ml或103至1015个颗粒/ml，或者其任一范围之间的任何值，例如，约106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个颗粒/ml。在一个实施方案中，施用高于1013个颗粒/ml的raav颗粒。在一些实施方案中，施用于对象的raav颗粒的剂量可以在以下数量级上：106至1014个载体基因组(vg)/ml或103至1015vg/ml，或者其任一范围之间的任何值，例如，约106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014vg/ml。在一个实施方案中，施用高于1013vg/ml的raav颗粒。raav颗粒可作为单剂量施用，或者可根据需要分成两次或更多次施用，以实现对所治疗特定疾病或病症的治疗。在一些实施方案中，以一定剂量向对象递送0.0001ml至10ml(例如，0.0001ml、0.001ml、0.01ml、0.1ml、1ml、10ml)。在一些实施方案中，raav病毒滴度为1×1010vg/ml至5×1013vg/ml。在一些实施方案中，raav病毒滴度可以是1×1010、2.5×1010、5×1010、1×1011、2.5×1011、5×1011、1×1012、2.5×1012、5×1012、1×1013、2.5×1013或5×1013vg/ml。在一些实施方案中，病毒滴度小于1×1010vg/ml。在一些实施方案中，raav病毒滴度大于1×1015vg/ml。在一个实施方案中，raav颗粒大于5×1013vg/ml。在一些实施方案中，raav病毒滴度通过本文中进一步描述的方法(例如，视网膜下或玻璃体内)施用。raav颗粒可作为单剂量施用，或者可根据需要分成两次或更多次施用，以实现对所治疗特定疾病或病症的治疗。在一些实施方案中，向对象的一只或两只眼施用1至500微升本申请中描述的组合物。例如，在一些实施方案中，可向每只眼施用约1、约10、约50、约100、约200、约300、约400或约500微升。然而，应当理解，在一些实施方案中可施用更小或更大的体积。在一些实施方案中，本公开内容提供了在可药用溶液中的本文中公开的一种或更多种基于raav的组合物的制剂，其用于单独或与一种或更多种其他治疗方式组合施用于细胞或动物并且特别地用于治疗影响人的人细胞、组织和疾病。如果期望的话，raav颗粒或核酸载体也可与其他药剂(例如蛋白质或多肽或多种药物活性剂)组合施用，包括治疗性多肽、生物活性片段、或其变体的一次或更多次全身或局部施用。事实上，对也可包含在内的其他组分几乎没有限制，只要另外的药剂在与靶细胞或宿主组织接触之后不引起显著的不利影响即可。因此，raav颗粒可根据特定情况的需要与多种其他药剂一起递送。这样的组合物可从宿主细胞或其他生物来源中纯化，或者作为替代地可如本文中所述化学合成。可药用赋形剂和载体溶液的配制对于本领域技术人员来说是公知的，用于在多种治疗方案中使用本文中所描述的特定组合物的合适给药和治疗方案的开发也如此，所述治疗方案包括例如经口、肠胃外、静脉内、鼻内、关节内和肌内施用和配制。通常来说，这些制剂可包含至少约0.1％或更多的治疗剂(例如，raav颗粒或宿主细胞)，但是活性成分的百分比当然可变化并且可方便地介于总制剂的重量或体积的约1％或2％和约70％或80％或更多之间。当然，每种治疗上可用的组合物中治疗剂(例如，raav颗粒)的量可以以这样的方式制备使得在任何给定单位剂量的化合物中获得合适的剂量。制备这样的药物制剂领域的技术人员将考虑例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素的因素，并且这样，多种剂量和治疗方案可以是期望的。在某些情况下，将期望如下递送在本文中公开的适当配制药物组合物中的raav颗粒或宿主细胞：皮下、眼内、玻璃体内、肠胃外、皮下、静脉内、脑室内、肌内、鞘内、经口、腹膜内、通过经口或经鼻吸入、或通过经由直接注射来直接注射至一种或更多种细胞、组织或器官。适于可注射使用的raav颗粒或宿主细胞组合物的药物形式包括无菌水溶液或分散体。在一些实施方案中，所述形式是无菌的并且在存在易注射性的程度上是流体。在一些实施方案中，所述形式在制备和储存条件下是稳定的，并且被保护以免于微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是包含以下的溶剂或分散介质：例如水、盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等)、其合适混合物、和/或植物油。可维持适当的流动性，例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来维持。术语“载体”是指与raav颗粒或宿主细胞一起施用的稀释剂、辅料、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括以下那些：石油，例如矿物油；植物油，例如花生油、豆油和芝麻油；动物油；或合成来源的油。盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体。本公开内容的组合物可通过标准途径施用于所治疗对象，所述标准途径包括但不限于经肺、鼻内、经口、吸入、肠胃外(例如静脉内)、局部、经皮、皮内、经黏膜、腹膜内、肌内、囊内、眶内(intraorbital)、玻璃体内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射。本公开内容的组合物可通过多种途径递送至眼。其可眼内递送，通过局部施用于眼来递送或者通过眼内注射到例如玻璃体(玻璃体内注射)或视网膜下(视网膜下注射)光感受器间空间(inter-photoreceptorspace)来递送。在一些实施方案中，将其递送至视杆感光细胞(rodphotoreceptorcell)。或者，其可通过插入或注射到眼周围的组织中而局部递送。其可通过经口途径或通过皮下、静脉内或肌内注射而全身递送。或者，其可通过导管或通过植入物递送，其中这样的植入物由多孔、无孔或凝胶材料(包括膜例如硅橡胶膜或纤维、生物可降解聚合物或蛋白质材料)制成。其可在病症发作之前施用以防止其发生，例如在对眼进行手术期间施用；或者在病理状况发作之后立即施用或者在急性或拖延性病症发生期间施用。对于可注射水溶液的施用，例如，如果需要的话，溶液可适当地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖使其等张。这些特定的水溶液尤其适于静脉内、肌内、玻璃体内、皮下和腹膜内施用。就此而言，可使用的无菌水性介质将是本领域技术人员根据本公开内容已知的。例如，可将一个剂量溶解在1ml等张nacl溶液中，并且将其添加至1000ml的皮下灌注流体中或者注射在建议的输注部位(参见例如，“remington′spharmaceuticalsciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据被治疗对象的病症，必然将发生一定的剂量变化。无论如何，负责施用的人员将确定个体对象的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应符合例如fda生物制品标准办公室(fdaofficeofbiologicsstandards)所要求的无菌性、致热原性以及一般安全性和纯度标准。无菌可注射溶液如下制备：将所需量的raav颗粒或宿主细胞与上文中列举的数种其他成分(如有需要的话)一起并入合适的溶剂中，然后无菌过滤。通常来说，分散体通过将多种经灭菌活性成分并入到包含基础分散介质和来自上文中列举的那些的所需其他成分的无菌载剂中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这由其经预先无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外期望成分的粉末。raav颗粒、核酸载体或宿主细胞组合物的量和这样的组合物的施用时间将在受益于本教导的技术人员的范围内。然而，可能的是，治疗有效量的所公开组合物的施用可通过单次施用(例如单次注射足够数量的感染性颗粒)来实现以向进行这样的治疗的患者提供治疗益处。或者，在一些情况下，可期望在相对短或相对延长的时间段内提供raav颗粒或宿主细胞组合物的多次或连续施用，如可由监督此类组合物之施用的医疗从业人员确定。在一些实施方案中，视杆细胞(rodcell)在使细胞视紫红质基因表达沉默之后保持结构完整和/或存活。在一些实施方案中，其中细胞视紫红质基因表达被沉默的视杆细胞具有在正常情况下包含视紫红质的缩短外段。在一些实施方案中，外段的长度可使用外源添加的(硬化)视紫红质基因来维持或恢复(例如，部分地或完全地)，所述视紫红质基因的表达对使用本申请中描述的组合物的沉默具有抗性。所述组合物可单独或者与一种或更多种另外的活性成分组合包含raav颗粒或宿主细胞，所述活性成分可从天然或重组来源获得或者化学合成。在一些实施方案中，raav颗粒与蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)或羟基脲在同一组合物中或作为同一治疗方案的一部分施用而组合施用。“治疗”疾病如该术语在本文中使用的意指降低对象经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。上述组合物通常以有效量(即能够产生期望结果的量)施用于对象。所述期望结果将取决于所施用的活性剂。例如，raav颗粒的有效量可以是能够将异源核酸转移至宿主器官、组织或细胞的颗粒的量。用于本公开内容方法的组合物的毒性和效力可通过使用培养物或实验动物中的细胞通过标准药学操作确定ld50(对群体中50％致死的剂量)来确定。毒性和效力之间的剂量比是治疗指数并且其可表示为ld50/ed50比。显示出大治疗指数的那些组合物是优选的。虽然可使用表现出毒性副作用的那些，但应注意设计使这些副作用的潜在损害最小化的递送系统。如本文中所述的组合物的剂量通常在包括ed50且具有很小毒性或无毒性的范围内。剂量可在该范围内变化，这取决于所采用的剂量形式和所使用的施用途径。本公开内容的一些方面涉及用于将包含目的基因的一种或更多种核酸载体递送到多种组织、器官和/或细胞中的重组腺相关病毒(raav)颗粒。在一些实施方案中，raav颗粒包含如本文中所述的raav衣壳蛋白，其例如包含一个或更多个氨基酸替换。在一些实施方案中，目的基因编码目的多肽或目的蛋白质(例如治疗性多肽或蛋白质)。在一些实施方案中，目的基因编码目的rna(例如，治疗性mrna、sirna、shrna、微rna、反义rna、trna、rrna或核酶)。在一些实施方案中，目的基因是替代基因(例如，眼特异性基因、功能性基因、功能性rho基因)。在一些实施方案中，目的基因包含或编码目的rna(例如，微rna、sirna、shrna)和目的替代基因(例如，眼特异性基因、功能性基因、功能性rho基因)。在一些实施方案中，功能性rho基因包含含有沉默核苷酸替换的rho基因，所述沉默核苷酸替换使其不能够被目的rna(例如，微rna、sirna、shrna)降解。在一些实施方案中，目的rna和目的替代基因在同一启动子的控制之下。在一些实施方案中，目的rna和目的替代基因在单独启动子的控制之下。可使用任何合适的启动子，例如但不限于病毒启动子(例如，cmv或其他病毒启动子)、微生物(例如酵母或细菌)启动子或真核生物(例如，哺乳动物)启动子。重组aav(raav)颗粒可至少包含：(a)一个或更多个异源核酸区，其包含编码目的基因(例如，目的rna和/或目的替代基因)的序列；以及(b)一个或更多个包含末端反向重复(itr)序列(例如，野生型itr序列或经改造itr序列)的区域，其在一个或更多个异源核酸区侧翼。在一些实施方案中，核酸载体的尺寸为4kb至5kb(例如，尺寸为4.2kb至4.7kb)。该核酸载体可被病毒衣壳(例如aav1、aav2、aav3、aav4或aav5衣壳)衣壳化，所述衣壳可包含如本文中所述的经修饰衣壳蛋白。在一些实施方案中，核酸载体是环状的。在一些实施方案中，核酸载体是单链的。在一些实施方案中，核酸载体是双链的。在一些实施方案中，双链核酸载体可以是例如自身互补载体，其包含与核酸载体另一区域互补开始形成核酸载体的双链的核酸载体区域。raav颗粒可以是任何aav血清型的，包括任何衍生物或假型(pseudotype)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、2/1、2/5、2/8、或2/9)。如本文中所用，raav病毒载体(例如，raav颗粒)的血清型是指重组病毒的衣壳蛋白的血清型。在一些实施方案中，raav颗粒不是aav2。在一些实施方案中，raav颗粒是aav2。在一些实施方案中，raav颗粒是aav6。在一些实施方案中，raav颗粒是包含如本文中所述的raav衣壳蛋白的aav6血清型。衍生物和假型的一些非限制性实例包括raav2/1、raav2/5、raav2/8、raav2/9、aav2-aav3杂合体、aavrh.10、aavhu.14、aav3a/3b、aavrh32.33、aav-hsc15、aav-hsc17、aavhu.37、aavrh.8、cht-p6、aav2.5、aav6.2、aav2i8、aav-hsc15/17、aavm41、aav9.45、aav6(y445f/y731f)、aav2.5t、aav-hae1/2、aav克隆32/83、aavshh10、aav2(y-＞f)、aav8(y733f)、aav2.15、aav2.4、aavm41和aavr3.45。这样的aav血清型和衍生物/假型以及产生这样的衍生物/假型的方法是本领域中已知的(参见例如，molther.2012年4月；20(4)：699-708.doi：10.1038/mt.2011.287.电子出版于2012年01月24日.theaavvectortoolkit：poisedattheclinicalcrossroads.asokana1，schafferdv，samulskirj.)。在一些实施方案中，raav颗粒是假型化raav颗粒，其包含：(a)包含来自一种血清型(例如，aav2)的itr的核酸载体和(b)包含来源于另一种血清型(例如，aav1、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10)的衣壳蛋白的衣壳。用于产生和使用假型化raav载体的方法是本领域中已知的(参见例如，duan等，j.virol.，75：7662-7671，2001；halbert等，j.virol.，74：1524-1532，2000；zolotukhin等，methods，28：158-167，2002；和auricchio等，hum.molec.genet.，10：3075-3081，2001)。产生raav颗粒和核酸载体的方法也是本领域中已知的并且可商购获得(参见例如，zolotukhin等.productionandpurificationofserotype1，2，and5recombinantadeno-associatedvitalvectors.methods28(2002)158-167；以及美国专利公布号us20070015238和us20120322861，其通过引用并入本文；以及可从atcc和cellbiolabs，inc.获得的质粒和试剂盒)。例如，包含核酸载体的质粒可与例如包含rep基因(例如，其编码rep78、rep68、rep52和rep40)和cap基因(例如，其编码vp1、vp2和vp3，包括如本文中所述的经修饰vp3区)的一种或更多种辅助质粒组合，并且转染到生产细胞系中，使得raav颗粒可被包装并随后纯化。在一些实施方案中，一种或更多种辅助质粒包括包含rep基因和cap基因(例如，其编码如本文中所述的raav衣壳蛋白)的第一辅助质粒，以及包含e1a基因、e1b基因、e4基因、e2a基因和va基因的第二辅助质粒。在一些实施方案中，rep基因是来源于aav2或aav6的rep基因，并且cap基因来源于aav2或aav6且可包括对该基因的修饰以产生本文中所述的经修饰衣壳蛋白。辅助质粒和制备这样的质粒的方法是本领域中已知的并且可商购获得(参见例如来自plasmidfactory，bielefeld，germany的pdm、pdg、pdp1rs、pdp2rs、pdp3rs、pdp4rs、pdp5rs、pdp6rs、pdg(r484e/r585e)和pdp8.ape质粒；可从以下获得的其他产品和服务：vectorbiolabs，philadelphia，pa；cellbiolabs，sandiego，ca；agilenttechnologies，santaclara，ca；和addgene，cambridge，ma；pxx6；grimm等.(1998)，noveltoolsforproductionandpurificationofrecombinantadenoassociatedvirusvectors，humangenetherapy，第9卷，2745-2760；kern，a.等.(2003)，identificationofaheparin-bindingmotifonadeno-associatedvirustype2capsids，journalofvirology，第77卷，11072-11081；grimm等(2003)，helpervirus-free，opticallycontrollable，andtwo-plasmid-basedproductionofadeno-associatedvirusvectorsofserotypes1to6，moleculartherapy，第7卷，839-850；kronenberg等.(2005)，aconformationalchangeintheadeno-associatedvirustype2capsidleadstotheexposureofhiddenvp1ntermini，journalofvirology，第79卷，5296-5303；以及moullier，p.和snyder，r.o.(2008)，internationaleffortsforrecombinantadeno-associatedviralvectorreferencestandards，moleculartherapy，第16卷，1185-1188)。接下来描述一种示例性的非限制性raav颗粒产生方法。产生或获得一种或更多种辅助质粒，其包含所期望aav血清型的rep和caporf以及在其天然启动子的转录控制之下的腺病毒va、e2a(dbp)和e4基因。caporf还可包含一个或更多个修饰以产生如本文中所述的经修饰衣壳蛋白。通过capo4介导的转染、脂质或聚合物分子(例如聚乙烯亚胺(pei))用辅助质粒和包含本文中所述核酸载体的质粒转染hek293细胞(可从获得)。然后，将hek293细胞孵育至少60小时以允许raav颗粒产生。或者，在另一个实例中，用包含核酸载体的单重组杆状病毒感染基于sf9的生产稳定细胞系。作为另一个替选方案，在另一个实例中，用包含核酸载体的hsv和任选地一种或更多种辅助hsv感染hek293或bhk细胞系，所述辅助hsv包含如本文中所述的rep和caporf以及在其天然启动子的转录控制之下的腺病毒va、e2a(dbp)和e4基因。然后，将hek293、bhk或sf9细胞孵育至少60小时以允许raav颗粒产生。然后，可使用本领域中已知或本文中描述的任何方法，例如通过碘克沙醇分步梯度、cscl梯度、色谱或聚乙二醇(peg)沉淀来纯化raav颗粒。本公开内容还考虑包含至少一种所公开的raav颗粒或核酸载体的宿主细胞。这样的宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞，其中优选人宿主细胞，并且可以是分离的、在细胞或组织培养物中的。在经遗传修饰的动物模型(例如，小鼠)的情况下，经转化的宿主细胞可包含在非人动物自身的体内。在一些实施方案中，宿主细胞是红系谱系的细胞，例如cd36+爆发型形成单位-红系(burst-formingunits-erythroid，bfu-e)细胞或集落形成单位-红系(colony-formingunit-erythroid，cfue-e)祖细胞。在一些实施方案中，将本文中所述的组合物(例如，sirna、shrna和/或目的替代基因)配制在纳米粒中。在一些实施方案中，将本文中所述的组合物(例如，sirna、shrna和/或目的替代基因)配制在脂质纳米粒中。在一些实施方案中，将本文中所述的组合物(例如，sirna、shrna和/或目的替代基因)配制在称为阳离子脂质纳米粒的脂质-聚阳离子复合物中。脂质纳米粒的形成可通过本领域中已知和/或如美国公布no.20120178702(其通过引用整体并入本文)中所述的方法来实现。作为一个非限制性实例，聚阳离子可包括阳离子肽或多肽，例如但不限于聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸，以及国际公布no.wo2012013326或美国专利公布no.us20130142818中描述的阳离子肽；其各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，将本文中所述的组合物(例如，sirna、shrna和/或目的替代基因)配制在包含非阳离子脂质的脂质纳米粒中，所述非阳离子脂质例如但不限于胆固醇或二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)。实施例实施例1：敲减rho的短干扰rna(sirna)的鉴定使用由khvorova及同事描述的短干扰rna(sirna)设计原理4，5，设计了14种sirna用于特异性地切割狗sirna，其中12种也靶向人视紫红质mrna。在进行之前，使用ncbiblast实用程序(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)针对ncbi人refseq数据库筛选sirna的第2至19位。排除了两种潜在的sirna，因为其与可能在视网膜中表达的其他基因紧密匹配。10种sirna的rna形式与用作对照的非靶向sirna一起从gehealthcaredharmacon订购。这些在表达与绿色荧光蛋白(gfp，图11中描绘的示例性质粒图谱)融合的人rho的细胞中测试，并且通过荧光激活细胞分选(facs)测量绿色荧光细胞的减少。基本原理是对rhomrna的切割将降低gfp的产生。虽然所有sirna都是基于sirna的当前设计原理设计的，但是测试的10种中只有3种导致降低30％或更多(图1a-c)。为了确定这些sirna作为从rna聚合酶iii启动子表达并且通过aav递送的小发夹rna会是有效的，克隆了表达三种sirna的用于shrna的dna序列(图2)。令人感兴趣的是，使用sirna的相对rho敲减并不准确地预测使用shrna的相对rho抑制，因为sirna131(seqidno：1)是最有效的sirna，但是测试的shrna的效率最低。简单转染作为rna的sirna可无法准确地预测设计成通过转录和加工产生相同sirna的shrna的有效性。为了确定shrna在切割野生型(正常)和突变rho方面均是有效的，使用定量逆转录pcr(qrt-pcr)作为测定测试在aav载体中克隆的相同三种shrna消化野生型和两种不同突变rhomrna的能力(图3)。表5列出了对应于鉴定为能够切割rho的shrna序列的rna序列(包括有义链、环、反义链和突出端)。每条序列示出具有粗体且加有下划线以强调的两种替选环序列，其中突出端为斜体且加有下划线以强调。表5：小发夹rna(shrna)sirna也可作为类似于图4中结构的结构的人工微rna7递送。图4的示例性微rna包含rho131的有义链(100)和反义链(101)(分别为seqidno：1和2)。这种表达模式的优点是可通过使用特定的启动子序列使sirna的产生成为细胞类型特异性的。在这种情况下，人视紫红质基因的近端启动子或人视紫红质激酶启动子将用于限制感光细胞的表达。实施例2：rho+/+狗中rhokd的分析狗2190(rcd1携带者)以表6中列出的浓度接受aav2/5-sc-h1-shrna-rho131的视网膜下注射。在注射之后8周将狗终止。从每只眼的泡和非泡区域二者收集数个3mm神经视网膜活检钻取物。表6：狗2190本文中描述的aav2/5-sc-h1-shrna构建体的一些非限制性实例还可称为aav2/5-sc-mop500rgfp-shrna构建体。aav2/5表示编码shrna的核酸以aav2itr为侧翼，并且在包含aav5衣壳蛋白的raav颗粒中提供。在一些实施方案中，本文中所述的任何干扰rna和本文中所述的任何重组rho基因可在raav颗粒(例如，包含aav5衣壳蛋白)中的同一aav核酸(例如，以aav2itr为侧翼)上提供。在一些实施方案中，本文中所述的任何干扰rna和本文中所述的任何重组rho基因可在衣壳化在不同raav颗粒(例如，各自包含aav5衣壳蛋白，或者各自具有来自不同aav血清型的衣壳蛋白)中的不同aav核酸(例如，各自以aav2itr为侧翼，或者各自以来自不同aav血清型的itr为侧翼)上提供。western印迹分析：将来自每只眼的两种活检钻取物(代表泡或非泡区域)在50μllewin缓冲溶液a(含有蛋白酶抑制剂)中在冰上孵育15分钟。以40％振幅、15secon/10secoffx8脉冲对样品进行声处理。然后，将样品离心并弃去沉淀。通过bradford法测量上清液中的蛋白质浓度。对1μg总蛋白质进行免疫印迹以使视紫红质可视化(使用的抗体：milliporemab5356，在封闭缓冲液中1∶1000稀释)，使用抗组蛋白抗体(abcamab1791，1∶3000稀释)作为上样对照(图5a)并且使信号归一化(图5b)。泡与非泡区域之间的rho蛋白量之间的比较与实验设计不一致(图5c)。犬视网膜中犬视紫红质rna的绝对定量：为了确定核酶处理之后视网膜中存在的视紫红质rna的绝对量，使用q-pcr标准曲线法进行绝对定量。使用已知量的犬rhocdna的稀释系列构建标准曲线。基于该标准曲线计算每个样品中犬rhorna的总量(图6a)。用aav2/5-sc-h1-shrna-rho131观察到犬rho的部分敲减。在使用的最高浓度下，蛋白质水平降低37％，而rna降低接近50％(图6b)。实施例3：rho+/+狗中rhokd的进一步分析狗2194(rcd1携带者)以表7中列出的浓度接受aav2/5-sc-h1-shrna-rho820的视网膜下注射。在注射之后8周将狗终止。从每只眼的泡和非泡区域二者收集数个3mm神经视网膜活检钻取物。表7：狗2194western印迹分析：将来自每只眼的两种活检钻取物(代表泡或非泡区域)在50μllewin缓冲溶液a(含有蛋白酶抑制剂)中在冰上孵育15分钟。以40％振幅、15secon/10secoffx8脉冲对样品进行声处理。然后，将样品离心并弃去沉淀。通过bradford法测量上清液中的蛋白质浓度。对1μg总蛋白质进行免疫印迹以使视紫红质可视化(使用的抗体：milliporemab5356，在封闭缓冲液中1∶1000稀释)。使用抗组蛋白抗体(abcamab1791，1∶3000稀释)作为上样对照(图7a)并且使信号归一化(图7b)。泡与非泡区域之间的rho蛋白量之间的比较与实验设计不一致(图7c)。犬视网膜中犬视紫红质rna的绝对定量：为了确定核酶处理之后视网膜中存在的视紫红质rna的绝对量，使用q-pcr标准曲线法进行绝对定量。使用已知量的犬rhocdna的稀释系列构建标准曲线。基于该标准曲线计算每个样品中犬rhorna的总量(图8a)。用aav2/5-sc-h1-shrna-rho820观察到犬rhorna和蛋白质的完全敲减，即使在1×1012vg/ml的较低剂量下也是如此(图8b)。实施例4：替代基因的硬化mrna序列在一些实施方案中，替代基因(例如，替代rho)的mrna可在一个或更多个位置被修饰成使其“硬化”(即，使其对通过sirna的降解具有抗性)。在一些实施方案中，相对于提供用于敲减内源性基因(例如，rho基因)的sirna，可在替代基因中包含一个或更多个沉默核苷酸替换。图9和10提供了可引入到替代rhomrna中的核苷酸替换的一些非限制性实例。应当理解，替代rho基因可包含这些替换中的一个或更多个。图9描绘了在每种shrna与内源性人或硬化rhomrna的靶序列之间发生的碱基配对的代表。所有shrna均与狗的rhomrna的靶序列完美地碱基配对。白框：shrna与内源性狗以及硬化rhomrna之间的错配。深灰色框：在rna中鸟苷与尿嘧啶之间发生的弱摆动碱基配对。浅灰色框：仅shrna与硬化rhomrna之间的错配。图10描绘了在shrna134与内源性人或硬化rho131mrna的靶序列之间发生的碱基配对的代表。shrna131和134的靶序列接近度使得能够使用相同的硬化rho131。深灰色框：在rna中鸟苷与尿嘧啶之间发生的弱摆动碱基配对。浅灰色框：仅shrna与硬化rhomrna之间的错配。实施例5：编码sirna和替代基因在一些实施方案中，可期望提供在dna载体中编码的sirna。图12a-b描绘了在dna载体中编码的sirna(例如，shrna)的一些非限制性实例。在一些实施方案中，如图12a-b中所示的示例性质粒图谱中进一步描绘的，dna载体还可编码在sirna(例如，shrna)侧翼的末端反向重复(itr)序列。在一些实施方案中，编码以itr序列为侧翼的sirna的dna载体可用于产生包含sirna的重组aav颗粒。在一些实施方案中，可期望提供在dna载体中编码的替代rhomrna。图12c描绘了在dna载体中编码的替代rhomrna(例如，人rho)的一个非限制性实例。在一些实施方案中，如图12c所示的示例性质粒图谱中进一步描绘的，dna载体还可编码在替代rhomrna(例如，人rho)侧翼的itr序列。在一些实施方案中，编码以itr序列为侧翼的替代rhomrna的dna载体可用于产生包含人rho的重组aav颗粒。在一些实施方案中，可提供类似的dna载体，其包含以itr序列为侧翼的替代rho基因和编码一种或更多种干扰rna的一个或更多个序列二者。在一些实施方案中，干扰rna和/或替代rho基因与启动子(例如，rna聚合酶iii启动子、或h1rna聚合酶iii启动子、或如本申请中所述的其他启动子)有效偶联。图12a-c中所示的干扰rna和/或替代rho基因在h1rna聚合酶iii启动子的控制之下。图12a-c的构建体还包含mop500-rgfp(在gfp的反向序列(rgfp)(因此不表达)上游的小鼠视杆视蛋白启动子(mop500)的-385/+86部分)并且可称为h1构建体或mop500构建体。然而，不需要mop500(例如，mop500-rgfp)部分。因此，质粒或raav核酸可编码如本文中所述的干扰rna和/或经修饰rho基因，其各自在没有小鼠视蛋白启动子和/或没有任何gfp编码序列(在任一方向上)下在相同或不同启动子(例如，h1启动子)的控制之下。实施例6：对在wtrho+/+狗中用shrna820进行rhokd的分析实施例6包括：鉴定在wt狗中视网膜下注射之后使视紫红质表达高效地沉默的携带shrna820敲减试剂的aav2/5的病毒滴度，通过wt狗中体内视网膜成像证明在视网膜下注射aav2/5-sc-h1-shrna820之后包含光感受器的层(onl)保持但包含视紫红质的层减小，鉴定在突变体rhot4r/+狗(rho-adrp的天然模型)中视网膜下注射之后使视紫红质表达高效地沉默的携带shrna820敲减试剂的aav2/5的病毒滴度，鉴定在突变体rhot4r/+狗中赋予光感受器以针对光诱导的视网膜变性的保护的aav2/5-sc-h1-shrna820的病毒滴度，证明视紫红质表达的高效敲减导致视杆中的外段的损失。由于外段的保留对于光转导(视杆将光转换成电信号的机制)是关键的，因此对rho-adrp的最佳治疗应降低天然rho但保留外段结构。这些结果表明，敲减方法是不够的，并且主张使用组合的敲减和替代策略。五只wtrho+/+狗以如下表8中所示的病毒浓度(1×1011至5×1012vg/ml)在两只眼中均接受aav2/5-sc-h1-shrna-rho820的视网膜下注射。表8：在wtrho+/+狗中用shrna820进行的rhokd在注射之后6-8周，进行体内视网膜成像(cslo/oct)，并随后终止狗。从两只眼(狗2194)或仅从os眼(其他狗)的泡/经处理和非泡/未经处理区域二者中收集数个3mm神经视网膜活检钻取物，以通过western印迹测量犬视紫红质的表达水平并且通过qpcr分析测量rhorna。将od眼固定，包埋在最佳切割温度介质中并进行处理用于组织学和免疫组织化学染色。western印迹分析：将代表泡或非泡区域的多达三对活检钻取物在50ullewin缓冲溶液a(含有蛋白酶抑制剂)中在冰上孵育15分钟。以40％振幅、15secon/10secoffx8脉冲对样品进行声处理。然后，将样品离心并弃去沉淀。通过bradford法测量上清液中的蛋白质浓度。将样品储存在-20℃。将1ug总蛋白质加载到凝胶上以使视紫红质可视化(使用的抗体：milliporemab5356，在odyssey封闭缓冲液中1：1000稀释)。使用抗组蛋白h3抗体(abcamab1791，1∶3000稀释)作为上样对照并且使信号归一化。犬视网膜中犬视紫红质rna的绝对定量：为了确定shrna820处理之后视网膜中存在的视紫红质rna的绝对量，使用q-pcr标准曲线法进行绝对定量。使用已知量的犬rhocdna的稀释系列构建标准曲线。使用0.1纳克的总cdna进行定量。基于该标准曲线计算每个样品中犬rhorna的总量。通过体内视网膜成像对注射有不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820的wtrho+/+狗的眼中视网膜完整性的评价。使用通过cslo/oct的体内视网膜成像评估视网膜下注射不同滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820之后6至8周onl的视网膜完整性。onl厚度的地形图显示该层在所有滴度下都得到保持。外界膜(externallimitingmembrane，elm)、内段(innersegment，is)和外段(outersegment，os)的分割揭示对应于注射1×1012vg/ml和5×1012vg/ml滴度的眼中泡区域的区域中的信号强度降低。这些结果表明作为rho沉默的结果光感受器os和is缩短，并且可用于评估rhokd在体内的效力。图13a-13e示出了在wtrho+/+狗中视网膜下注射不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820下视紫红质敲减的rna和蛋白质分析。图13a示出了视网膜图谱，其显示用于western印迹分析和rna定量的活检钻取物的位置。成对的深灰色、灰色和有点圆圈表示用于每个western印迹重复的泡/经处理和非泡/未经处理区域中活检钻取物的位置，而黑色圆圈表示用于rna定量的活检钻取物的位置。图13b示出了条形图，其显示作为在同一视网膜的未经处理区域中测量的水平的百分比的经处理区域中剩余的犬视紫红质rna。图13c示出了免疫印迹，其显示取自犬视网膜的经处理(tx)和未经处理(untx)区域的活检钻取物中视紫红质的量。组蛋白h3用于归一化。条形图示出了作为在同一视网膜的未经处理区域中测量的水平的百分比的剩余犬视紫红质蛋白。图13d-13e示出了显示来自每个实验的数值的表(报道为剩余rna或蛋白质的百分比，以及作为替代地分别报道为rna或蛋白质的敲减百分比)。图14a-14d示出了在wt狗中视网膜下注射不同滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820之后onl和elm/is/os完整性的评估。图14a示出了onl厚度图；图14b示出了经归一化强度的elm/is/os图；图14c示出了onl厚度值；并且图14d示出了elm/is/os层的经归一化强度的值。这些结果表明作为rho沉默的结果光感受器os和is缩短，并且可用于评估rhokd在体内的效力。在以低至1×1012vg/ml的病毒滴度视网膜下注射aav2/5-sc-h1-shrna820的wt狗中观察到犬rhorna和蛋白质的完全敲减。即使在最高的病毒浓度下也未观察到onl厚度的减小，这表明视紫红质的敲减不诱导感光细胞死亡。在以诱导100％视紫红质kd的高病毒滴度注射的眼的经处理/泡区域中观察到elm/is/os层的oct反射率降低。该观察结果与这些层的变薄相容，并且可用作kd效率的体内结果量度。实施例7：对在rhot4r/+突变体狗中用shrna820进行rhokd的分析四只rhot4r/+狗以如下表9中所示的病毒浓度在两只眼中均接受aav2/5-sc-h1-shrna-rho820的视网膜下注射。表9：在rhot4r/+突变体狗中用shrna820进行的rhokd在注射之后8周进行cslo/oct，并且对所有狗的os眼进行光暴露(在1mw/cm2下1分钟)以触发光诱导的视网膜变性。在光暴露之后2周对所有狗再次进行cslo/oct，以评估处理所赋予的任何挽救效果。终止狗并且从od眼的泡/经处理和非泡/未经处理区域收集数个3mm神经视网膜活检钻取物，以通过western印迹测量犬视紫红质的表达水平并且通过qpcr分析测量rhorna。将os眼固定，包埋在最佳切割温度介质中并进行处理用于组织学和免疫组织化学染色。western印迹分析：将来自每只os眼的三对活检钻取物(代表泡/经处理或非泡/未经处理视网膜区域)在50ullewin缓冲溶液a(含有蛋白酶抑制剂)中在冰上孵育15分钟。以40％振幅、15secon/10secoffx8脉冲对样品进行声处理。然后，将样品离心并弃去沉淀。通过bradford法测量上清液中的蛋白质浓度。将样品储存在-20℃。将1ug总蛋白质加载到凝胶上以使视紫红质可视化(使用的抗体：milliporemab5356，在odyssey封闭缓冲液中1∶1000稀释)。使用抗组蛋白h3抗体(abcamab1791，1∶3000稀释)作为上样对照并且使信号归一化。犬视网膜中犬视紫红质rna的绝对定量：为了确定shrna820处理之后视网膜中存在的视紫红质rna的绝对量，使用q-pcr标准曲线法进行绝对定量。使用已知量的犬rhocdna的稀释系列构建标准曲线。使用0.1纳克的总cdna进行定量。基于该标准曲线计算每个样品中犬rhorna的总量。通过体内视网膜成像对注射有不同病毒滴度的aav2/5-shrna820的突变体rhot4r/+狗的眼中从光诱导损伤的光感受器挽救的评价。在注射之后8周(光暴露之前)通过cslo/oct成像检查来自以1×1012vg/ml降至1×1011vg/ml的病毒滴度视网膜下注射的突变体rhot4r/+狗的眼。泡/经处理区域中的onl厚度被保持，表明shrna820在此期间没有引起光感受器的任何损失。使用对先前显示在rhot4r突变体中引起急性视网膜变性但在wt狗中则不引起的强度(角膜辐照度为1mw/cm2)的白光暴露1分钟来评估由aav2/5-sc-h1-shrna820在经处理/泡区域中赋予的保护水平。对于每只眼，周围的非泡/未经处理区域用作内部对照。在光暴露之后两周，对视网膜重新成像，并且在注射有1×1012vg/ml和5×1011vg/ml滴度的眼的泡/经处理区域中显示出良好的onl厚度保持。在2.5×1011vg/ml滴度下观察到非常轻微的挽救，且在1×1011vg/ml滴度下则没有观察到。图15a-15e示出了在突变体rhot4r/+狗中视网膜下注射不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820下视紫红质敲减的rna和蛋白质分析。图15a示出了视网膜图谱，其显示用于western印迹分析和rna定量的活检钻取物的位置。成对的深灰色、灰色和有点圆圈表示用于每个western印迹重复的泡区域和非泡区域中活检钻取物的位置，而黑色圆圈表示用于rna定量的活检钻取物的位置。图15b是显示作为在同一视网膜的未经处理区域中测量的水平的百分比的剩余犬视紫红质rna的量的条形图。图15c是显示取自犬视网膜的经处理(tx)和未经处理(untx)区域的活检钻取物中犬视紫红质的量的免疫印迹。组蛋白h3用于归一化。条形图示出了作为在同一视网膜的未经处理区域中测量的水平的百分比的剩余犬视紫红质蛋白的量。图15d-15e是显示来自每个实验的数值的表(报道为剩余rna或蛋白质的百分比，以及作为替代地分别报道为rna或蛋白质的敲减百分比)。图16a-16d示出了octb扫描，其涵盖在暴露于引起突变体rhot4r/+狗中急性视网膜变性的短暂光剂量之后2周rhot4r/+狗的经处理(经不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820处理)和未经处理的视网膜区域。(图16a)经1×1012vg/ml处理的狗的oct扫描。(图16b)经5×1011vg/ml处理的狗的oct扫描。(图16c)经2.5×1011vg/ml处理的狗的oct扫描。(图16d)经1×1011vg/ml处理的狗的oct扫描。图17a-17b示出了来自经aav2/5-sc-shrna820处理的rhot4r/+的onl厚度地形图，其显示针对光诱导的视网膜变性的保护。(图17a)未经处理的wt对照狗的onl厚度图(左图)和经5e+11vg/ml的aav2/5-sc-shrna820处理的em411-os的onl厚度图，并且示出了在光诱导的损伤之后数周经处理/泡区域中保持的onl厚度。黑色和白色曲线显示如在视网膜下注射之后立即看到的泡的界限。下面的图示出了具有颜色为较深灰色(中间带)的onl的octb扫描用于可视化目的。(图17b)选择在泡外部和内部的位点用于onl厚度测量。在1×1012和5×1011vg/ml病毒滴度的aav2/5-shrna-rho820下观察到犬rhorna和蛋白质(通过western印迹)的完全敲减。用1×1012和5×1011vg/ml病毒滴度的aav2/5-shrna-rho820实现对包含光感受器的细胞体的外核层(outernuclearlayer，onl)的完全挽救。通过组织学和免疫组织化学对注射有不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820的突变体rhot4r/+狗的眼中针对光诱导损伤的光感受器保护的评价。检查来自上表中列出的同一突变体rhot4r/+狗的眼，其以1×1012降至1×1011vg/ml的病毒滴度视网膜下注射并且随后光暴露(在注射之后8周时)于持续1分钟的一定强度(角膜辐照度为1mw/cm2)的白光。该光剂量先前显示在rhot4r突变体中引起急性视网膜变性但在wt狗中则不引起。组织学和免疫组织化学用于评估由aav2/5-sc-h1-shrna820在经处理/泡区域中赋予的保护水平。对于每只眼，周围的非泡/未经处理区域用作内部对照。使用针对视紫红质(rho)和人视锥拘留蛋白(humanconearrestin，hca)的抗体评估视杆外段和视锥形态的完整性。图18示出了视网膜下注射有不同病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820的突变体rhot4r/+视网膜的经处理(tx)和未经处理(untx)区域的组织学(h&e染色)和免疫组织化学(视紫红质染色为绿色并且在图18的下图中显示为较浅染色；人视锥拘留蛋白染色为红色并且在图18的下图中显示为灰色染色)。在光暴露之后两周，观察到注射有1×1012vg/ml和5×1011vg/ml滴度的眼的泡/经处理区域中onl厚度的良好保持，而在2.5×1011vg/ml下onl厚度略微减小，并且在1×1011vg/ml滴度下未观察到保护。与在1×1012和5×1011vg/ml滴度下的视紫红质表达的非常高效敲减一致，与视紫红质表达降低组合地在h&e切片上观察到视杆os长度的减小。在1×1012和5×1011vg/ml病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820下观察到犬rhorna和蛋白质(通过western印迹)的完全敲减。用1×1012和5×1011vg/ml病毒滴度的aav2/5-sc-h1-shrna820实现对包含光感受器的细胞体的外核层(outernuclearlayer，onl)的完全保护。作为有效rho敲减的结果的视杆中外段结构的损失主张需要组合的kd和替代策略以允许经处理的视杆保留外段并且保持功能性。实施例8：该实施例使用rho-adrp提供了支持基因治疗的数据。其包括在突变体rhot4r/+狗中测试将shrna820敲减试剂和替代试剂rho820(＝硬化人rhomrna)二者组合的aav2/5载体构建体(aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820)，鉴定导致内源性犬rho高效敲减以及替代硬化人rho(rho820)高效表达的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820的病毒滴度，证明aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820在突变体rhot4r/+狗中赋予光感受器以针对光诱导的视网膜变性的保护，以及证明在经aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820处理的视网膜区域中实现视杆外段的保留。对在rhot4r/+突变体狗中用shrna820和rho820进行rhokd&替代的分析：两只rhot4r/+狗以如下表中所示的病毒浓度在两只眼中均接受aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820的视网膜下注射(表10)。表10hop：人视蛋白启动子；h1：h1rna聚合酶iii启动子在注射之后11周时进行体内视网膜成像(cslo/oct)，并且对两只狗的os眼进行光暴露(在1mw/cm2下1分钟)以触发光诱导的视网膜变性。在光暴露之后2周对所有狗再次进行cslo/oct以评估处理所赋予的任何挽救效果。终止狗并且从od眼的泡/经处理和非泡/未经处理区域二者收集数个3mm神经视网膜活检钻取物以通过western印迹测量视紫红质的表达水平并且通过qpcr分析测量犬和人rhorna。将os眼固定，包埋在最佳切割温度介质中并进行处理用于组织学和免疫组织化学染色。western印迹分析：将来自每只od眼的三对活检钻取物(代表泡/经处理或非泡/未经处理视网膜区域)在50ullewin缓冲溶液a(含有蛋白酶抑制剂)中在冰上孵育15分钟。以40％振幅、15secon/10secoffx8脉冲对样品进行声处理。然后，将样品离心并弃去沉淀。通过bradford法测量上清液中的蛋白质浓度。将样品储存在-20℃。将1ug总蛋白质加载到凝胶上以使视紫红质可视化(使用的抗体：milliporemab5356，在odyssey封闭缓冲液中1∶1000稀释)。注意，该抗体检测犬和人rho二者。由于asn2处糖基化的丧失，突变体t4r视紫红质由于其具有可在免疫印迹上检测到的较低mw而可与wt(犬或人)rho蛋白区分开。因此，来自杂合突变体rhot4r/+的rho免疫印迹显示出对应于wt(高mw)和突变体t4r(低mw)rho蛋白的两个条带。使用抗组蛋白h3抗体(abcamab1791，1∶3000稀释)作为上样对照并且使信号归一化。犬视网膜中犬和人视紫红质rna的绝对定量：为了确定在用aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820处理之后视网膜中存在的内源性犬视紫红质rna和人rho820rna二者的绝对量，使用q-pcr标准曲线法进行绝对定量。使用已知量的犬和人rhocdna的稀释系列构建标准曲线。使用0.1纳克的总cdna进行定量。基于该标准曲线计算每个样品中犬rho和人rho820rna的总量。图19a-19f示出了在突变体rhot4r/+狗中视网膜下注射5×1011vg/ml滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820下视紫红质敲减和替代的rna和蛋白质分析。图19a示出了视网膜图谱，其显示用于western印迹分析和rna定量的活检钻取物的位置。成对的深灰色、灰色和有点圆圈表示用于每个western印迹重复的经处理(tx)和未经处理(untx)区域中活检钻取物的位置，而黑色圆圈表示用于rna定量的活检钻取物的位置。图19b示出了免疫印迹，其显示取自犬视网膜的经处理(tx)和未经处理(untx)区域的活检钻取物中总视紫红质(犬+人rho820)的量。组蛋白h3用于归一化。条形图示出了经处理和未经处理区域中剩余视紫红质蛋白的百分比。注意em424-od和em425-od的经处理区域中较低mw条带(对应于突变体t4rrho蛋白)的损失。图19c是显示用于蛋白质定量的每对钻取物的数值的表。图19d是显示作为在未经处理区域中测量的犬rhorna水平的百分比的经处理区域中剩余犬视紫红质rna的条形图。图19e是显示作为在未经处理区域中测量的犬rhorna水平的百分比的经处理区域中人rho820的水平的条形图。图19f是显示用于rna定量的每对钻取物的数值的表。通过体内视网膜成像对以5×1011vg/ml视网膜下注射aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820的突变体rhot4r/+狗的眼中针对光诱导损伤的光感受器保护的评价：在注射之前、注射之后11周(光暴露之前)和光损伤之后2周通过cslo/oct成像检查来自以5×1011vg/ml病毒滴度视网膜下注射的2只突变体rhot4r/+狗的眼。使用对先前显示在rhot4r突变体中引起急性视网膜变性但在wt狗中则不引起的强度(角膜辐照度为1mw/cm2)的白光暴露1分钟来评估由aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820载体在经处理/泡区域中赋予的保护水平。在所有注射之后时间点均保持泡/经处理区域中的onl厚度，表明该载体构建体无毒并且在此期间没有光感受器的损失。对于每只眼，周围的非泡/未经处理区域用作内部对照。在光暴露之后两周，在两只注射眼中的泡/经处理区域中均完全保持onl厚度。图20a-20c示出了体内视网膜成像，其显示在经5×1011/vg/ml滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820处理的突变体rhot4r/+视网膜区域中针对光诱导的视网膜变性的保护。图20a示出了enfacecslo复合图，其显示在光暴露之后2周被保护免受变性的视网膜区域(边界由白色箭头界定)。浅灰色箭头表示图20b中所示的octb扫描在经处理区域中的位置，深灰色箭头表示图20c中所示的octb扫描在未经处理区域中的位置。图20b示出了注射之前、注射之后11周和注射之后13周/光暴露之后2周经处理区域中的octb扫描。在注射病毒载体之后的这两个时间点在整个经处理区域均保持onl厚度。图20b和30v示出了注射之前、注射之后11周和注射之后13周/光暴露之后2周未经处理区域中的octb扫描。onl被保持直至注射之后11周，但在光暴露之后2周完全丧失。图21示出了来自经5×1011/vg/ml滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820处理的两个rhot4r/+的onl厚度的地形图，其显示针对光诱导的视网膜变性的保护。通过组织学和免疫组织化学对以5×1011/vg/ml滴度注射aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820的突变体rhot4r/+狗的眼中针对光诱导损伤的光感受器保护的评价：检查来自上文中列出的同一突变体rhot4r/+狗的眼，其被视网膜下注射5×1011/vg/ml滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820并且随后光暴露(在注射之后11周时)于持续1分钟的一定强度(角膜辐照度为1mw/cm2)的白光。该光剂量先前显示在rhot4r突变体中引起急性视网膜变性但在wt狗中则不引起。使用免疫组织化学评估由aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820在经处理/泡区域中赋予的保护水平。对于每只眼，周围的非泡/未经处理区域用作内部对照。针对视紫红质(rho)和人视锥拘留蛋白(hca)的抗体用于评估视杆外段和视锥形态的完整性。在光暴露之后两周，在注射有5×1011vg/ml滴度的眼的泡/经处理区域中实现onl厚度的优异保持。除在用敲减试剂shrna820处理视网膜时观察到的之外并且与之相反，用aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820构建体实现视杆外段的保留。图22示出了视网膜下注射有5×1011/vg/ml滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820的突变体rhot4r/+视网膜的经处理区域、过渡区和未经处理区域的免疫组织化学(视紫红质染色为绿色并且在图22的图中显示为较浅染色；人视锥拘留蛋白染色为红色并且在图22的图中显示为灰色染色)。在经处理区域中，外核层(onl)厚度和视杆外段(os)完全保留，而在未经处理区域中，所有视杆都已损失，并且onl减小至单排锥细胞体。在过渡区看到经处理区域和未经处理区域之间的明确边界。用5×1011vg/ml病毒滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820实现犬rhorna和蛋白质(通过western印迹)的完全敲减。当与犬视网膜中的正常rho水平相比时，在mrna(118％至130％)和蛋白质(30％至33％)水平均实现硬化rho820的高效替代。用5×1011vg/ml病毒滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820实现对包含光感受器的细胞体的外核层(onl)的完全保护。用5×1011vg/ml病毒滴度的aav2/5-sc-hop-rho820-h1-shrna820实现作为用rho820进行高效rho替代之结果的视杆外段的完全保留。参考文献：1.maoh，gorbatyukms，rossmillerb，hauswirthww，lewinas，long-termrescueofretinalstructureandfunctionbyrhodopsinrnareplacementwithasingleadeno-associatedviralvectorinp23hrhotransgenicmice.humgenether.2012；23：356-366.2.rossmillerb，maoh，lewinas，genetherapyinanimalmodelsofautosomaldominantretinitispigmentosa.molvis.2012；18：2479-2496.3，gorbatyukm，justilienv，liuj，hauswirthww，lewinas.suppressionofmouserhodopsinexpressioninvivobyaavmediatedsirnadelivery.visionres.2007；47：1202-1208.4.khvorovaa，reynoldsa，jayasenasd.functionalsirnasandmirnasexhibitstrandbias.cell.2003；115：209-216.5.reynoldsa，leaked，boeseq，scaringes，marshallws，khvorovaa.rationalsirnadesignforrnainterference.natbiotechnol.2004；22：326-330.6.jensensmr，schmitza，pedersenfs，kjemsj+，bramsenjb.functionalselectionofshrnaloopsfromrandomizedretrovirallibraries.plosone.2012；7：e43095.7.zhouh，xiaxg，xuz.anrnapolymeraseiiconstructsynthesizesshort-hairpinrnawithaquantitativeindicatorandmediateshighlyefficientrnai.nucleicacidsres.2005；33：e62-e70.等同方案虽然本文中已描述并举例说明了本发明的数个实施方案，但是本领域普通技术人员将容易预见用于进行本文中所述的功能和/或获得本文中所述的结果和/或一个或更多个优点的多种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化方案和/或修改方案均被视为在本文中所述的本发明实施方案的范围之内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文中描述的所有参数、尺寸、材料和构造意为示例性的且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验即可确定本文中所描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。因此，应理解的是，前述实施方案仅通过实例的方式给出，且在所附权利要求书及其等效文件的范围之内，可相对于具体描述和要求保护的以其他方式来实施本发明实施方案。本公开内容的本发明实施方案涉及本文中所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法不相互不一致，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法的任意组合也包括在本公开内容的本发明范围内。本文中限定和使用的所有定义均应理解为超过字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所限定术语的一般含义。本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均针对其各自被引用的主题而通过引用并入，其在一些情况下可涵盖文件的全部内容。除非明确指出相反，否则如本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。如本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应被理解为意指如此连接的要素(即，在一些情况下联合存在而在另一些情况下分开存在的要素)中的“任一个或两个”。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即如此连接的要素中的“一个或更多个”。除通过“和/或”子句所具体确定的要素之外，其他要素也可任选地存在，无论是否与具体确定的那些元素相关。因此，作为一个非限制性实例，当与开放式语言(例如“包含/包括”)联合使用时对“a和/或b”的提及在一个实施方案中可指仅a(任选地包括除b之外的要素)；在另一个实施方案中，可指仅b(任选地包括除a之外的要素)；在另一个实施方案中，可指a和b二者(任选地包括其他要素)等。如本文中在说明书和权利要求书中使用的“或/或者”应被理解为与如上限定的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或/或者”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但是也包括多于一个，任选地包括另外的未列出项目。只有明确指出相反的术语(例如“仅之一”或“恰好之一”，或者，在权利要求书中使用时，“由......组成”)才将指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性的术语(例如“任一”、“之一”、“仅之一”或“恰好之一”)时，本文中使用的术语“或/或者”应仅解释为表示排他性的替代选择(即“一个或另一个但不是二者”)。当在权利要求书中使用时，“基本上由......组成”应具有其在专利法领域中所使用的普通含义。如本文中在说明书和权利要求书中使用的，关于一个或更多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中任意一个或更多个要素中的至少一个要素，但是不一定包括要素列表内具体列出的各个要素和每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任意组合。该定义还允许可任选地存在除短语“至少一个”所指在要素列表内明确确定的要素之外的要素，不论与那些明确确定的要素是否相关。因此，作为一个非限制性实例，“a和b中的至少一个”(或等同地，“a或b中的至少一个”或等同地，“a和/或b中的至少一个”)在一个实施方案中可以指，至少一个a，任选地包括多于一个a，而不存在b(且任选地包括除b之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个b，任选地包括多于一个b，而不存在a(且任选地包括除a之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个a，任选地包括多于一个a，以及至少一个b，任选地包括多于一个b(且任选地包括其他要素)等。还应当理解，除非明确指出相反，否则在本文中要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定局限于方法的步骤或动作被记载的顺序。在权利要求书以及在上述说明书中，所有的连接词例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由...构成”等应理解为是开放式的，即意指包括但不限于。仅连接词“由......组成”和“基本上由...组成”应分别是封闭式或半封闭式连接词，如美国专利局专利审查程序手册2111.03部分中所述。应当理解，在本文件中使用开放式连接词(例如，“包含”)描述的实施方案在一些替代实施方案中也被考虑为“由通过开放式连接词描述的特征组成”和“基本上由其组成”。例如，如果本公开内容描述“包含a和b的组合物”，则本公开内容还考虑以下替代实施方案：“由a和b组成的组合物”和“基本上由a和b组成的组合物”。序列表<110>佛罗里达大学研究基金会有限公司宾夕法尼亚大学托管会<120>用于治疗显性视网膜色素变性的aav载体<130>u1197.70073wo00<140>尚未分配<141>与此同时<150>us62/398,451<151>2016-09-22<150>us62/302,122<151>2016-03-01<160>42<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>1cugccuacauguuucugcu19<210>2<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>2agcagaaacauguaggcag19<210>3<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>3ccuacauguuucugcugau19<210>4<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>4aucagcagaaacauguagg19<210>5<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>5gcauggucaucaucauggu19<210>6<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>6accaugaugaugaccaugc19<210>7<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>7guggcauucuacaucuuca19<210>8<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>8ugaagauguagaaugccac19<210>9<211>7<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>9ucaagag7<210>10<211>7<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>10ugugcuu7<210>11<211>45<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>11cugccuacauguuucugcuucaagagagcagaaacauguaggcag45<210>12<211>45<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>12cugccuacauguuucugcuugugcuuagcagaaacauguaggcag45<210>13<211>45<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>13ccuacauguuucugcugauucaagagaucagcagaaacauguagg45<210>14<211>45<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>14ccuacauguuucugcugauugugcuuaucagcagaaacauguagg45<210>15<211>45<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>15gcauggucaucaucaugguucaagagaccaugaugaugaccaugc45<210>16<211>45<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>16gcauggucaucaucaugguugugcuuaccaugaugaugaccaugc45<210>17<211>45<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>17guggcauucuacaucuucaucaagagugaagauguagaaugccac45<210>18<211>45<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>18guggcauucuacaucuucaugugcuuugaagauguagaaugccac45<210>19<211>93<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(38)<223>n是a、c、g、u或不存在<220><221>misc_feature<222>(58)..(76)<223>n是a、c、g、u或不存在<400>19ugcuguugacagugagcgannnnnnnnnnnnnnnnnnnuagugaagccacagauguannn60nnnnnnnnnnnnnnnncugccuacugccucgga93<210>20<211>47<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>20cugccuacauguuucugcuucaagagagcagaaacauguaggcaguu47<210>21<211>47<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>21cugccuacauguuucugcuugugcuuagcagaaacauguaggcaguu47<210>22<211>47<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>22ccuacauguuucugcugauucaagagaucagcagaaacauguagguu47<210>23<211>47<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>23ccuacauguuucugcugauugugcuuaucagcagaaacauguagguu47<210>24<211>47<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>24gcauggucaucaucaugguucaagagaccaugaugaugaccaugcuu47<210>25<211>47<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>25gcauggucaucaucaugguugugcuuaccaugaugaugaccaugcuu47<210>26<211>47<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>26guggcauucuacaucuucaucaagagugaagauguagaaugccacuu47<210>27<211>47<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>27guggcauucuacaucuucaugugcuuugaagauguagaaugccacuu47<210>28<211>89<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>28ugcuguugacagugagcgacugccuacauguuucugcugugaagccacagaugagcagaa60acauguaggcagcugccuacugccucgga89<210>29<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>29ccgccuauauguuccuccu19<210>30<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>30agcagaaacauguaggcag19<210>31<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>31ccgccuacauguuucugcu19<210>32<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>32gcauggugauaauaauggu19<210>33<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>33accaugaugaugaccaugc19<210>34<211>19<212>rna<213>人工序列<220><223>合成多核苷酸<400>34gcauggucaucaucauggu19<210>35<211>19<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