一种合成利那洛肽的方法与流程

本发明涉及药物合成领域，具体涉及一种合成利那洛肽的方法。

技术背景

利那洛肽(linaclotide)为ironwood公司开发的一种新型gc-c(肠上皮细胞尿苷酸环化酶c)受体激动剂，可激活肠上皮细胞顶端表面的gc-c受体，导致细胞内和细胞外环鸟苷酸增多。其净效应是氯和碳酸氢盐分泌进入肠腔增加，进而导致液体分泌增多以及大便通过加速，用于治疗成人慢传输型便秘和便秘型肠易激综合征(ibs-c)患者。该药物于2012年12月17日首次获批在美国上市，商品名为linzess。

利那洛肽由14个氨基酸组成，并且含有3对二硫键，具体结构序列如下：

利那洛肽的结构中二硫键是其发挥药效的主要作用点，不仅如此，在其合成路线中二硫键的合成难度最大，成为整个肽序列合成研究中的关键点。

关于利那洛肽的合成技术，最早见于miriam等人的文献报道，(“optimizedfmocsolid-phasesynthesisofthecysteine-richpeptidelinaclotide”，peptidescience,2011,volume96,issue1,pages69-80)其分别采用了三种不同的策略进行利那洛肽的合成：(1)肽序中全部采用trt为cys保护基固相合成线性粗肽，然后在液相中室温一步氧化得到利那洛肽；(2)肽序中采用五种不同半胱氨酸保护基，即采用2stbu、2pmeobzl、2trt或2mmt、2acm、2trt或2acm、2trt、2pmeobzl共三种正交保护方式，进行固相合成线性粗肽，然后采用分步环化策略完成二硫键的合成；(3)肽序中采用两种不同半胱氨酸保护基，即采用2个stbu和4个trt进行固相合成线性粗肽，然后采用分步环化策略完成二硫键的合成。

中国专利cn102875655b公开了一种合成利那洛肽的方法，其采用mmt保护基保护半胱氨酸侧链，用逐一偶联方式合成在c端偶联有树脂固相载体的利那洛肽树脂，裂解脱除保护基和树脂固相载体得到利那洛肽线性粗肽，最后采用gsh/gssh氧化体系进行氧化反应，得到利那洛肽粗品。

中国专利cn104231051a公开了一种利那洛肽的制备方法，其采用fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(mmt)-oh作为反应原料，逐一偶联获得利那洛肽树脂，经裂解反应获得线性利那洛肽，之后采用磷酸盐缓冲体系、dmso、edta进行氧化获得利那洛肽粗品。

以上文献报道中均采用了液相环化的方法，即首先合成在c端偶联有树脂固相载体的利那洛肽线形肽树脂，然后裂解脱除保护基和树脂固相载体得到利那洛肽线性粗肽，最后采用氧化体系进行环化反应，得到利那洛肽粗品。此外采用此类方法的还包括中国专利cn104628826a、cn103626849a、cn104974229a、cn105884864a、cn104844693a、cn106008674a、cn106167514a。然而，此类方法存在诸多不足：液相环化只有在较低的浓度下才能进行反应，反应效率较低，如miriam等的方法反应浓度仅为0.5mg/ml，否则会造成肽链的无序聚合，产生大量杂质，十分不利于工业放大化生产；在环化之前进行裂解和保护基的多步脱除，容易造成大量杂质的产生，多步环化的过程中需要对中间体进行多步纯化，操作复杂且增加纯化的难度；一些特殊氨基酸的使用，如fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-cys(hqm)-oh，使得生产成本较高，不利于推广使用。

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成利那洛肽的方法，本发明所述方法能够加大反应浓度，提高反应效率，减少杂质产生，避免使用特殊原料，简化生产工艺，提高利那洛肽的总收率，同时减少氧化体系的体积，降低生产成本，适合于放大生产。

技术实现要素：

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种合成利那洛肽的方法，包括以下步骤：

1)在活化体系存在下，将fmoc-tyr(tbu)-oh与树脂载体偶联，获得fmoc-tyr(tbu)-树脂；

2)fmoc-tyr(tbu)-树脂采用逐一偶联或分步偶联的方式偶联n端有fmoc保护基以及侧链连有特定保护基的其他氨基酸，获得利那洛肽线性肽树脂；

3)采用n-x代琥珀酰亚胺溶液氧化体系进行环化，获得cys1-6,2-10,5-13位环化而其他氨基酸侧链仍连有特定保护基的利那洛肽树脂；

4)树脂经裂解反应，纯化和冻干，获得利那洛肽。

在合成fmoc-tyr(tbu)-树脂载体中，活化体系选自由hobt、dic、dcc、hbtu、tbtu、pybop、dmap、dipea、diea中的一种或多种组成。

在合成fmoc-tyr(tbu)-树脂载体中，进一步优选，所述活化体系为diea、hobt/dic/dmap，hobt/dcc/dmap，hbtu/hobt/dipea，tbtu/hobt/dipea，pybop/hobt/dipea。

一些实施例中，所述活化体系更优选为diea、hobt/dic/dmap或hbtu/hobt/dipea。

在上述合成fmoc-tyr(tbu)-树脂载体中，所述活化体系采用dmf、dcm、nmp和dmso中任意一种或两种溶剂溶解。

优选地，采用dmf或体积比dmf:dcm为1:1的溶剂溶解。

一些实施例中，在上述合成fmoc-tyr(tbu)-树脂载体中，进一步优选，采用体积比dmf:dcm为1:1的混合溶剂溶解。

在合成fmoc-tyr(tbu)-树脂载体中，载体树脂选自wang树脂、ctc树脂或羟基类树脂。

优选地，载体树脂为wang树脂，替代度优选为0.4～1.2mmol/g，

更优选地，载体树脂为wang树脂，替代度优选为0.5～1.0mmol/g。

本发明所述保护基是在多肽合成领域常用的保护氨基酸主链氨基以及侧链上氨基、羧基、羟基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止上述活性基团在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质。本发明中的n端保护基为fmoc，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基、羟基、巯基等基团。

在一个实施例中，步骤2)中所述的n端有fmoc保护基以及侧链连有特定保护基的其他氨基酸为：fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-cys(trt)-oh。

在一个实施例中，步骤2)中所述的n端有fmoc保护基以及侧链连有特定保护基的其他氨基酸为：fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-cys(stbu)-oh。

在一个实施例中，步骤2)中所述的n端有fmoc保护基以及侧链连有特定保护基的其他氨基酸为：fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-cys(acm)-oh。

在一个实施例中，步骤2)中所述的n端有fmoc保护基以及侧链连有特定保护基的其他氨基酸为：fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh和fmoc-cys(trt)-oh。

在一个实施例中，步骤2)中所述的n端有fmoc保护基以及侧链连有特定保护基的其他氨基酸为：fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh和fmoc-cys(trt)-oh。

在一个实施例中，步骤2)中所述的n端有fmoc保护基以及侧链连有特定保护基的其他氨基酸为：fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh和fmoc-cys(trt)-oh。

本发明所述偶联可以采用逐一偶联或分步偶联。

在上述固相合成利那洛肽树脂的优选方案中，所述逐一偶联是指在第一个氨基酸与固相载体偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个与前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。在逐一偶联中，由于每个氨基酸n端都有保护基，因此需要先脱除n端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识。

在本发明所述方法中，以利那洛肽线性主链n端到c端的氨基酸顺序编号，如下式：

在上述固相合成利那洛肽树脂的优选方案中，进一步优选，所述分步偶联是指“8+6”或“5+9”模式。本领域技术人员应当知晓，“8+6”模式是指首先分别合成利那洛肽肽序中1-8八肽片段ⅰ和肽序中9-14六肽片段ⅱ树脂，再在偶联体系的存在下，将片段ⅰ与片段ⅱ连接得到利那洛肽线性肽树脂。同样地，“5+9”模式是指首先分别合成利那洛肽肽序中1-5五肽片段ⅰ和肽序中6-14九肽片段ⅱ树脂，再在偶联体系的存在下，将片段ⅰ与片段ⅱ连接得到利那洛肽线性肽树脂。

本发明所述纯化可以采用本技术领域常规纯化方法，如hplc纯化方法。

本发明步骤3)中所述的n-x代琥珀酰亚胺为n-氯代琥珀酰亚胺、n-溴代琥珀酰亚胺、n-碘代琥珀酰亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种。

本发明步骤3)中所述的n-x代琥珀酰亚胺溶液的溶剂为dmf、dcm。

本发明步骤3)中所述的n-x代琥珀酰亚胺溶液的用量为：1～5eq。

本发明所述合成利那洛肽的方法，在合成利那洛肽线性肽树脂后，采用n-x代琥珀酰亚胺溶液氧化体系进行环化，环化过程中1，6，2，10，5，13位cys的侧链保护基脱除并形成cys1-6,2-10,5-13二硫键，而其余氨基酸侧链保护基及树脂并未脱除，形成了cys1-6,2-10,5-13位环化而其他氨基酸侧链仍连有特定保护基的利那洛肽树脂。

本发明步骤4)中所述的裂解试剂为：tfa/mpr/tis、tfa/edt/tis/h2o。

作为优选，本发明步骤4)中所述的裂解试剂用量为：tfa/mpr/tis：(92～95)/(2～5)/(2～5)，tfa/edt/tis/h2o：(90～96)/(1～5)/(1～5)/(1～5)。

由本发明所述方法合成的利那洛肽粗肽，重量收率99.3-108.9％，经hplc检测纯度介于72.1-80.5％，由此得到的利那洛肽精肽经hplc检测纯度达99.34％，总收率达45.8-52.6％。

需要说明的是，现有的合成利那洛肽的技术中均是首先合成在c端偶联有树脂固相载体的利那洛肽线形肽树脂，然后裂解脱除保护基和树脂固相载体得到利那洛肽线性粗肽，最后采用氧化体系进行环化，得到利那洛肽粗品，即液相环化的方法。本发明中利那洛肽的合成采用的是固相环化，即利那洛肽线性肽树脂未经裂解而直接采用n-x代琥珀酰亚胺溶液氧化体系进行一步环化得到利那洛肽树脂，树脂经裂解，纯化和冻干得到利那洛肽。

液相环化只有在较低的浓度下才能进行反应，反应效率较低，如miriam等的方法反应浓度仅为0.5mg/ml，否则会造成肽链的无序聚合，产生大量杂质，十分不利于工业放大化生产；在环化之前进行裂解和保护基的多步脱除，容易造成大量杂质的产生，多步环化的过程中需要对中间体进行多步纯化，操作复杂且增加纯化的难度；一些特殊氨基酸的使用，如fmoc-cys(mmt)-oh、fmoc-cys(hqm)-oh，使得生产成本较高，不利于推广使用。

本发明合成利那洛肽的方法，具有以下优点：

1、采用固相环化，首先起到了假稀释效应，避免肽链的重复折叠，能在较高的浓度下进行环化反应，可极大的提高生产效率；其次环化之前线性肽树脂未进行裂解，避免了大量杂质的产生，提高了利那洛肽环化的效率。

2、采用n-x代琥珀酰亚胺进行一步环化，可避免中间体的多步纯化，降低了中间纯化步骤的成本，提高了利那洛肽的总收率。

3、采用特定的氨基酸侧链保护基，在环化过程中定位了1对二硫键，减少了错配副产物的生成，提高了利那洛肽的纯度，可极大的提高生产效率，降低生产成本。

附图说明

图1利那洛肽线性肽树脂环化示意图

图2实施例26利那洛肽粗肽hplc图

图3实施例31利那洛肽精肽hplc图

具体实施例

下面结合具体实施例对本发明的利那洛肽的合成方法作进一步详细的说明以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

说明书和权利要求书中所使用的英文缩写具体含义如表1所示。

表1说明书和权利要求书中所使用的英文缩写具体含义

实施例1：替代度为0.53mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂的制备

称取替代度为1.0mmol/g的wang树脂100g于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取fmoc-tyr(tbu)-oh45.9g(100mmol)，hobt16.2g(120mmol)，dmap1.2g(10mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入20.3mldic(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，加入70ml醋酸酐和60ml吡啶，混合封闭24h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到fmoc-tyr(tbu)-wang树脂，检测替代度为0.53mmol/g。

实施例2：替代度为0.48mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂的制备

称取替代度为1.0mmol/g的wang树脂100g，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤2次，用dmf溶胀树脂30分钟后，将fmoc-tyr(tbu)-oh45.9g(100mmol)、hobt16.2g(120mmol)，dmap1.2g(10mmol)，用dmf/dcm＝1:1(v/v)混合液溶解，冰水浴下加入20.3mldic(120mmol)活化5min后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后。加入70ml乙酸酐和62ml吡啶混合液封闭24h。用dmf洗涤3次，dcm洗3次，甲醇收缩抽干，得到fmoc-tyr(tbu)-wang树脂，检测替代度为0.48mmol/g。

实施例3：替代度为0.55mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂的制备

称取替代度为1.0mmol/g的wang树脂100g于固相反应柱中，加入dmf，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取fmoc-tyr(tbu)-oh45.9g(100mmol)，hobt16.2g(120mmol)，hbtu38.0g(100mmol)，dmap2.4g(20mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入32.0mldipea(150mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，加入70ml醋酸酐和60ml吡啶，混合封闭24h，dcm洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到fmoc-tyr(tbu)-wang树脂，检测替代度为0.55mmol/g。

实施例4：利那洛肽线性肽树脂的制备

称取实施例1中得到的替代度为0.53mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂188.7g(100mmol)于反应柱中，用dcm清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6次。称取fmoc-cys(trt)-oh175.7g(300mmol)，hobt48.6g(360mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入61mldic(360mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽序依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh。反应结束后，用甲醇收缩，得到利那洛肽线性肽树脂：h-cys(trt)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-cys(trt)-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂487.5g。

实施例5：利那洛肽线性肽树脂的制备

称取将实施例2中得到的替代度为0.48mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂208.2g(100mmol)于反应柱中，用dcm清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6次。称取fmoc-cys(trt)-oh175.7g(300mmol)，hobt48.6g(360mmol)，hbtu114.1g(300mmol)用dmf溶解，0℃冰水浴下加入77.5mldipea(360mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽序依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh。反应结束后，用甲醇收缩，得到利那洛肽线性肽树脂：h-cys(stbu)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-cys(stbu)-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂482.9g。

实施例6：利那洛肽线性肽树脂的制备

称取将实施例1中得到的替代度为0.53mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂189.2g(100mmol)于反应柱中，用dcm清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6次。称取fmoc-cys(acm)-oh127.8g(300mmol)，hobt48.6g(360mmol)，dmap36g(300mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入61mldic(360mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽序依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh和fmoc-cys(trt)-oh。反应结束后，用甲醇收缩，得到利那洛肽线性肽树脂：h-cys(trt)-cys(acm)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(acm)-cys(trt)-asn(trt)-pro-ala-cys(acm)-thr(tbu)-gly-cys(acm)-tyr(tbu)-wang树脂481.5g。

实施例7：利那洛肽线性肽树脂的制备

称取将实施例3中得到的替代度为0.55mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂181.8g(100mmol)于反应柱中，用dcm清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6次。称取fmoc-cys(tbu)-oh119.9g(300mmol)，hobt48.6g(360mmol)，hbtu114.1g(300mmol)用dmf溶解，0℃冰水浴下加入77mldipea(360mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽序依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(tbu)-oh和fmoc-cys(trt)-oh。反应结束后，用甲醇收缩，得到利那洛肽线性肽树脂：h-cys(trt)-cys(tbu)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(tbu)-cys(trt)-asn(trt)-pro-ala-cys(tbu)-thr(tbu)-gly-cys(tbu)-tyr(tbu)-wang树脂484.3g。

实施例8：利那洛肽线性肽树脂的制备

称取将实施例2中得到的替代度为0.48mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂208.3g(100mmol)于反应柱中，用dcm清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6次。称取fmoc-cys(trt)-oh175.7克(300mmol)，hobt48.6g(360mmol)，dmap36g(300mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入61mldic(360mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽序依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-cys(acm)-oh。反应结束后，用甲醇收缩，得到利那洛肽线性肽树脂：h-cys(acm)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-cys(acm)-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂475.3g。

实施例9：利那洛肽线性肽树脂的制备

称取将实施例3中得到的替代度为0.55mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂181.8g(100mmol)于反应柱中，用dcm清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6次。称取fmoc-cys(stbu)-oh129.5g(300mmol)，hobt48.6g(360mmol)，hbtu114.1g(300mmol)用dmf溶解，0℃冰水浴下加入77mldipea(360mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽序依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh和fmoc-cys(trt)-oh。反应结束后，用甲醇收缩，得到利那洛肽线性肽树脂：h-cys(trt)-cys(stbu)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(stbu)-cys(trt)-asn(trt)-pro-ala-cys(stbu)-thr(tbu)-gly-cys(stbu)-tyr(tbu)-wang树脂494.6g。

实施例10：替代度为0.52mmol/g的fmoc-pro-ctc树脂的合成

称取替代度为1.00mmol/g的2-ctc树脂200.00g，加入到固相反应柱中，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤1次，用dmf溶胀树脂30分钟后，取33.84gfmoc-pro-oh(100mmol)用dmf溶解，冰水浴下加入16.5mldiea(100mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入200ml无水甲醇封闭1小时。用dmf洗涤3次，dcm洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到fmoc-pro-ctc树脂，检测替代度为0.52mmol/g。

实施例11：fmoc-cys(acm)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-cys(acm)-asn(trt)-pro-oh的制备

称取将实施例10中得到的替代度为0.52mmol/g的fmoc-pro-ctc树脂192.3g(100mmol)于反应柱中，用dcm清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6次。称取fmoc-asn(trt)-oh113.8g(300mmol)，hobt45.2g(300mmol)，hbtu114.1g(300mmol)用dmf溶解，0℃冰水浴下加入77mldipea(360mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽序依次偶联fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-cys(acm)-oh。反应结束后，用甲醇收缩，得到肽树脂359.6g，真空干燥过夜，加入至25l玻璃反应器中。

配置裂解液85％tfa/h2o5l，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液浓缩后加至10l异丙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，异丙醚洗涤，并且真空干燥，得到fmoc-cys(acm)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-cys(acm)-asn(trt)-pro-oh白色固体276.2g。

实施例12：替代度为0.54mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-ctc树脂的制备

称取替代度为1.00mmol/g的2-ctc树脂200.00g，加入到固相反应柱中，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤1次，用dmf溶胀树脂30分钟后，取45.95gfmoc-tyr(tbu)-oh(100mmol)用dmf溶解，冰水浴下加入16.5mldiea(100mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入200ml无水甲醇封闭1小时。用dmf洗涤3次，dcm洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到fmoc-pro-ctc树脂，检测替代度为0.54mmol/g。

实施例13：fmoc-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-ctc树脂的制备

称取将实施例12中得到的替代度为0.54mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-ctc树脂185.3g(100mmol)于反应柱中，用dcm清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6次。称取fmoc-cys(trt)-oh175.7g(300mmol)，hobt45.2g(300mmol)，hbtu114.1g(300mmol)用nmp溶解，0℃冰水浴下加入77mldipea(360mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽序依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh和fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh。偶联完毕，用dmf洗涤3次，dcm洗涤3次，抽干得到275.6gfmoc-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-ctc树脂。

实施例14：利那洛肽线性肽树脂的制备

取实施例13中得到fmoc-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-ctc树脂于反应柱中，用dcm清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，然后用dmf洗涤6次。称取实施例11中得到的fmoc-cys(acm)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-cys(acm)-asn(trt)-pro-oh，hobt48.6g(360mmol)，hbtu114.1g(300mmol)用dmso溶解，0℃冰水浴下加入77mldipea(360mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时，然后用dblk脱除fmoc保护基团。反应结束后，用甲醇收缩，得到利那洛肽线性肽树脂：h-cys(acm)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-cys(acm)-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-ctc树脂480.3g。

实施例15：取代度为0.80mmol/g的fmoc-cys(trt)-ctc树脂的合成

称取取代度为1.20mmol/g的2-ctc树脂50.00g，加入到固相反应柱中，加入到固相反应柱中，用dmf洗涤1次，用dmf溶胀树脂30分钟后，取43.16gfmoc-cys(trt)-oh(100mmol)用dmf溶解，冰水浴下加入17mldiea(100mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入500ml无水甲醇封闭1小时。用dmf洗涤3次，dcm洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到fmoc-cys(trt)-ctc树脂，检测替代度为0.80mmol/g。

实施例16：fmoc-cys(stbu)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-oh的合成

称取200.00g取代度为0.80mmol/g的fmoc-cys(trt)-ctc树脂125g(100mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤1次，用dmf溶胀fmoc-cys(trt)-ctc树脂30分钟后，用dmf:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，称取137.91gfmoc-tyr(tbu)-oh(300mmol)、40.52ghobt(300mmol)加入体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，冰水浴下加入46mldic(300mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利那洛肽主链肽序，依次完成fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh和fmoc-cys(stbu)-oh的偶联。

将树脂加入到5000ml的三口圆底烧瓶中，按体积比为1:4的tfe和dcm配置裂解液3200ml，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量tfa洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到fmoc-cys(stbu)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-oh165.37g

实施例17：h-cys-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂的合成

称取将实施例1中得到的替代度为0.53mmol/g的fmoc-tyr(tbu)-wang树脂189.2g(100mmol)于反应柱中，用dmf洗涤1次，用dmf溶胀fmoc-tyr(tbu)-wang树脂30分钟后，用dmf:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，称取175.7gfmoc-cys(trt)-oh(300mmol)、40.5ghobt(300mmol)加入体积比为1:1的dcm和dmf混合溶液，冰水浴下加入46mldic(300mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利那洛肽主链肽序，依次fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-cys(stbu)-oh的偶联。

偶联完毕，采用20％β-巯基乙醇，0.1mn-甲基吗啉的dmf裂解液去stbu保护基，然后用dmf洗涤6次，得到fmoc-cys-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂，用dmf:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，dcm洗涤3次，meoh洗涤3次，dcm洗涤3次，meoh洗涤3次，抽干得到354.8gh-cys-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂。

实施例18：h-cys(stbu)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys-cys-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂的合成

称取实施例16制得的165.37gfmoc-cys(stbu)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-oh(100mmol)，15.00ghsbzl(120mmol)加入2000mlthf中，冰水浴下加入19mldic(120mmol)，反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加dcm溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，冰乙醇重结晶3次，过滤，固体油泵拉干的到158.62gfmoc-cys(stbu)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-sbzl。

称取实施例17制得的354.8gh-cys-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂(100mmol)，加入固相反应柱中，用dmf洗涤1次，用dmf溶胀30分钟后，称取158.62gfmoc-cys(stbu)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys(trt)-sbzl(100mmol)加入dmf溶液，加入上述装有树脂的反应柱中，25℃下反应4小时后，得到fmoc-cys(stbu)cys(trt)glu(otbu)tyr(tbu)cys-cysasn(trt)pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang王树脂。用dmf:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去fmoc保护，然后用dmf洗涤6次，dcm洗涤3次，meoh洗涤3次，dcm洗涤3次，meoh洗涤3次，抽干得到425.4gh-cys(stbu)cys(trt)glu(otbu)tyr(tbu)cys-cysasn(trt)pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂。

实施例19：利那洛肽肽树脂的制备

以60mg/ml的浓度将487.5g实施例4制得的利那洛肽线性肽树脂(100mmol)溶于8.13ldmf中。在溶液中加入1eq的n-溴代琥珀酰亚胺dmf溶液，25℃搅拌反应12小时，得到利那洛肽肽树脂292.85g。反应如图1所示。

实施例20：利那洛肽肽树脂的制备

以45mg/ml的浓度将482.9g实施例5制得的利那洛肽线性肽树脂(100mmol)溶于10.73ldmf中。在溶液中加入2eq的n-氯代琥珀酰亚胺dmf溶液，30℃搅拌反应12小时，得到利那洛肽肽树脂289.74g。

实施例21：利那洛肽肽树脂的制备

以50mg/ml的浓度将481.5g实施例6制得的利那洛肽线性肽树脂(100mmol)溶于9.63ldmf中。在溶液中加入3eq的n-碘代琥珀酰亚胺dcm溶液，30℃搅拌反应12小时，得到利那洛肽肽树脂289.37g。

实施例22：利那洛肽肽树脂的制备

以50mg/ml的浓度将484.3g实施例7制得的利那洛肽线性肽树脂(100mmol)溶于9.69ldmf中。在溶液中加入3eq的n-羟基硫代琥珀酰亚胺dmf溶液，25℃搅拌反应12小时，得到利那洛肽肽树脂285.61g。

实施例23：利那洛肽肽树脂的制备

以55mg/ml的浓度将475.3g实施例8制得的利那洛肽线性肽树脂(100mmol)溶于8.64ldmf中。在溶液中加入4eq的n-羟基硫代琥珀酰亚胺dmf溶液，28℃搅拌反应12小时，得到利那洛肽肽树脂294.31g。

实施例24：利那洛肽肽树脂的制备

以48mg/ml的浓度将494.6g实施例9制得的利那洛肽线性肽树脂(100mmol)溶于10.30ldmf中。在溶液中加入2.5eq的n-氯代琥珀酰亚胺dmf溶液，25℃搅拌反应12小时，得到利那洛肽肽树脂287.34g。

实施例25：利那洛肽肽树脂的制备

以52mg/ml的浓度将480.3g实施例14制得的利那洛肽线性肽树脂(100mmol)溶于9.24ldmf中。在溶液中加入2.5eq的n-溴代琥珀酰亚胺dmf溶液，25℃搅拌反应12小时，得到利那洛肽肽树脂297.36g。

实施例26：利那洛肽肽树脂的制备

以42mg/ml的浓度将425.4g实施例18制得的h-cys(stbu)-cys(trt)-glu(otbu)-tyr(tbu)-cys-cys-asn(trt)-pro-ala-cys(trt)-thr(tbu)-gly-cys(trt)-tyr(tbu)-wang树脂(100mmol)溶于10.13ldmf中。在溶液中加入2.5eq的n-溴代琥珀酰亚胺dmf溶液，25℃搅拌反应12小时，得到利那洛肽肽树脂259.46g。

实施例27：利那洛肽粗肽的制备

将实施例19制备得到的利那洛肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(tfa/mpr/tis：94/3/3)(v/v))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉降，沉降液经过滤或离心，所得滤饼用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利那洛肽粗肽140.32g。粗肽重量收率为108.9％，hplc纯度为72.1％，如图2所示。

实施例28：利那洛肽粗肽的制备

将实施例20制备得到的利那洛肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(tfa/mpr/tis：92/4/4)(v/v))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉降，沉降液经过滤或离心，所得滤饼用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利那洛肽粗肽145.21g。粗肽重量收率为99.9％，hplc纯度为75.4％，hplc图与实施例26的相似。

实施例29：利那洛肽粗肽的制备

将实施例21制备得到的利那洛肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(tfa/edta/tis/h2o：90/3/3/4)(v/v))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉降，沉降液经过滤或离心，所得滤饼用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利那洛肽粗肽144.21g。粗肽重量收率为98.9％，hplc纯度为80.3％，hplc图与实施例26的相似。

实施例30：利那洛肽粗肽的制备

将实施例22制备得到的利那洛肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(tfa/mpr/tis：94/2/4)(v/v))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉降，沉降液经过滤或离心，所得滤饼用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利那洛肽粗肽144.21g。粗肽重量收率为98.9％，hplc纯度为80.5％，hplc图与实施例26的相似。

实施例31：利那洛肽粗肽的制备

将实施例23制备得到的利那洛肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(tfa/edta/tis/h2o：92/1/5/2)(v/v))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉降，沉降液经过滤或离心，所得滤饼用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利那洛肽粗肽143.21g。粗肽重量收率为100.9％，hplc纯度为76.3％，hplc图与实施例26的相似。

实施例32：利那洛肽粗肽的制备

将实施例24备得到的利那洛肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(tfa/edta/tis/h2o：94/2/3/1)(v/v))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉降，沉降液经过滤或离心，所得滤饼用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利那洛肽粗肽146.34g。粗肽重量收率为100.9％，hplc纯度为78.2％，hplc图与实施例26的相似。

实施例33：利那洛肽粗肽的制备

将实施例24备得到的利那洛肽肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂(tfa/edta/tis/h2o：94/2/3/1)(v/v))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量tfa洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉降，沉降液经过滤或离心，所得滤饼用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利那洛肽粗肽143.34g。粗肽重量收率为99.3％，hplc纯度为77.6％，hplc图与实施例26的相似。

实施例34：利那洛肽精肽的制备

取实施例26制备得到的利那洛肽粗肽，采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到利那洛肽精肽116.45g，hplc纯度99.23％，总收率45.8％。精肽谱图如图3所示。

实施例35：利那洛肽精肽的制备

取实施例27制备得到的利那洛肽粗肽，采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到利那洛肽精肽114.53g，hplc纯度99.32％，总收率50.3％。精肽谱图如与实施例31相似。

实施例36：利那洛肽精肽的制备

取实施例28制备得到的利那洛肽粗肽，采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到利那洛肽精肽115.32g，hplc纯度99.21％，总收率46.8％。精肽谱图如与实施例31相似。

实施例37：利那洛肽精肽的制备

取实施例29制备得到的利那洛肽粗肽，采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到利那洛肽精肽114.26g，hplc纯度99.16％，总收率52.6％。精肽谱图如与实施例31相似。

实施例38：利那洛肽精肽的制备

取实施例30制备得到的利那洛肽粗肽，采用novaseprp-hplc系统，波长220nm，色谱柱为反相c18柱，常规0.1％tfa/水、乙腈流动相体系纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到利那洛肽精肽112.34g，hplc纯度99.34％，总收率49.5％。精肽谱图如与实施例31相似。