本申请要求2016年1月29日提交的标题为“鉴定结合细胞表面表位的抗体的筛选方法(screeningmethodsforidentifyingantibodiesthatbindcellsurfaceepitopes)”的美国临时申请号62/288,729的优先权，其内容通过引用全文的方式纳入。
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本公开内容提供了用于鉴定与微生物，例如病原微生物，例如细菌其它感染性物质结合的抗体的测定或方法。在一些实施方式中，用于鉴定结合靶微生物的抗体的方法包括在凝胶微滴中凝胶包封产抗体细胞和靶微生物。本公开还提供了通过该方法产生的抗体。本公开还提供了与不动杆菌的变体或物种所具有的保守区域或表位相结合的抗体。
背景
多重耐药细菌已在全世界范围内出现并且患病率越来越高，其引起严重的公共卫生问题。美国疾病控制和预防中心认为每年至少有23,000人死于抗生素耐药性感染，其中一些感染类型的死亡率高达50％。据报告，在难以治疗的革兰氏阴性病原体，例如不动杆菌的种(acinetobacterspp.)和绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)中，在美国的多重耐药率分别为63％和13％。这些多重耐药菌株的持续流行使临床医生对患有危及生命的感染的患者几乎没有治疗选择。解决这种对新抗生素的迫切需要来治疗多重耐药的革兰氏阴性感染至关重要。本领域需要鉴定治疗剂(例如抗体)的方法，所述治疗剂特定地针对病原微生物(例如，对许多现有的治疗方法有耐药性的细菌)。本领域还需要鉴定对广泛的微生物例如病原体有效的治疗剂的方法。本文提供满足此类需求的方法和制品。
技术实现要素：
本文提供了鉴定结合靶微生物的抗体的方法，其包括以下步骤：(a)获得多个候选产抗体细胞；(b)将靶微生物与多个候选产抗体细胞包封在凝胶微滴中；和(c)确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生结合靶微生物的抗体，从而鉴定特异性结合靶微生物的抗体。在一些实施方式中，步骤(b)还包括在微滴中包封靶微生物的含表位片段或其变体；并且步骤(c)包括确定被鉴定为与靶微生物结合的抗体是否也在同一凝胶微滴中结合其含表位片段。
本文提供了鉴定结合靶微生物的抗体的方法，其包括以下步骤：(a)获得多个候选产抗体细胞；(b)将靶微生物和靶微生物的含表位片段或其变体与多个候选产抗体细胞包封在凝胶微滴中；并且(c)确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与同一凝胶微滴中存在的靶微生物和/或其含表位片段结合的抗体，从而鉴定出与靶微生物或其含表位片段特异性结合的抗体。
在一些实施方式中，含表位片段与固体支持物结合。在一些实施方式中，所述固体支持物是珠。
在一些实施方式中，靶微生物是细菌，真菌，寄生虫或病毒。在一些实施方式中，靶微生物是细菌或真菌。在一些实施方式中，微生物是多重耐药性微生物。
在一些实施方式中，微生物是细菌，其为革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，革兰氏阴性细菌是变形菌。在一些实施方式中，微生物是选自如下物种的细菌：不动杆菌(acinetobacter)，蛭弧菌(bdellovibrio)，伯克霍尔德氏菌(burkholderia)，衣原体(chlamydia)，肠杆菌(enterobacter)，埃希氏菌(escherichia)，弗朗西斯菌(francisella)，嗜血杆菌(haemophilus)，螺杆菌(helicobacter)，克雷伯氏菌(klebsiella)，军团菌(legionella)，莫拉氏菌(moraxella)，奈瑟菌(neisseria)，泛菌(pantoea)，假单胞菌(pseudomonas)，沙门氏菌(salmonella)，志贺氏菌(shigella)，寡养单胞菌(stenotrophomonas)，弧菌(vibrio)和耶尔森氏菌(yersinia)。
在一些实施方式中，微生物选自蜂属不动杆菌(acinetobacterapis)，鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)，百利不动杆菌(acinetobacterbaylyi)，贝杰不动杆菌(acinetobacterbeijerinckii)，贝齐不动杆菌(acinetobacterbereziniae)，布赫不动杆菌(acinetobacterbohemicus)，波希不动杆菌(acinetobacterboissieri)，布菲不动杆菌(acinetobacterbouvetii)，布瑞不动杆菌(acinetobacterbrisouii)，乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)，简德不动杆菌(acinetobactergandensis)，简瑞不动杆菌(acinetobactergerneri)，广东不动杆菌(acinetobacterguangdongensis)，瑰丽不动杆菌(acinetobacterguillouiae)，吉伦伯不动杆菌(acinetobactergyllenbergii)，溶血不动杆菌(acinetobacterhaemolyticus)，哈尔滨不动杆菌(acinetobacterharbinensis)，印度不动杆菌(acinetobacterindicus)，约氏不动杆菌(acinetobacterjohnsonii)，琼氏不动杆菌(acinetobacterjunii)，库奇不动杆菌(acinetobacterkookii)，鲁氏不动杆菌(acinetobacterlwoffii)，拿氏不动杆菌(acinetobacternectaris)，诺氏不动杆菌(acinetobacternosocomialis)，巴基斯坦不动杆菌(acinetobacterpakistanensis)，帕尔乌斯不动杆菌(acinetobacterparvus)，彼特不动杆菌(acinetobacterpitii)，皮特不动杆菌(acinetobacterpittii)，濮阳不动杆菌(acinetobacterpuyangensis)，清风不动杆菌(acinetobacterqingfengensis)，抗辐不动杆菌(acinetobacterradioresistans)，抗辐射不动杆菌(acinetobacterradioresistens)，鲁迪斯不动杆菌(acinetobacterrudis)，辛德勒不动杆菌(acinetobacterschindleri)，塞氏不动杆菌(acinetobacterseifertii)，索利不动杆菌(acinetobactersoli)，坦氏不动杆菌(acinetobactertandoii)，提氏不动杆菌(acinetobactertjernbergiae)，塔氏不动杆菌(acinetobactertowneri)，乌氏不动杆菌(acinetobacterursingii)，可变不动杆菌(acinetobactervariabilis)，温氏不动杆菌(acinetobactervenetianus)，大肠杆菌(escherichiacoli)，流感嗜血菌(haemophilusinfluenzae)，肺炎克雷伯氏菌(kilbsiellapneumoniae)，绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，鲍氏志贺氏菌(shigellaboydii)，痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae)，弗氏志贺氏菌(shigellaflexneri)，索氏志贺氏菌(shigellasonnei)，霍乱弧菌(vibriocholera)和鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)。在一些实施方式中，微生物是鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)。
在一些实施方式中，微生物是细菌，其为革兰氏阳性细菌。在一些实施方式中，微生物选自葡萄球菌(staphylococcus)和链球菌(streptococcus)的物种。
在一些实施方式中，微生物是真菌，其是曲霉(aspergillus)物种或念珠菌(candida)物种。
在一些实施方式中，微生物是寄生虫，其是球虫(coccidia)或疟原虫(plasmodium)物种。
在一些实施方式中，多个候选产抗体细胞获自已经暴露于靶微生物或靶微生物的含表位片段或其变体的供者。
在本文提供的方法的一些实施方式中，通过包括以下步骤的方法获得多个候选产抗体细胞：(i)通过将含有产抗体细胞的细胞组合物导入免疫受损动物中来扩增从已经暴露于靶微生物或靶标微生物的含表位片段或其变体的供者获得的产抗体细胞；并且(ii)回收扩增的产抗体细胞，从而获得多个候选产抗体细胞。
在一些实施方式中，含有产抗体细胞的细胞组合物包括从供者的脾和/或淋巴结获得的细胞。在一些实施方式中，细胞组合物包括t细胞。在一些实施方式中，细胞组合物包括外周血单核细胞(pbmc)，其包括产抗体细胞。
在一些实施方式中，免疫受损动物是scid小鼠。
在一些实施方式中，将含有产抗体细胞的细胞组合物经静脉内或通过移植到免疫受损动物的脾中而导入免疫受损动物。
在本文提供的方法的一些实施方式中，产抗体细胞来自暴露于靶微生物的第一变体或其含表位片段的供者，并且在将含有产抗体细胞的细胞组合物导入免疫受损动物之前，该方法包括将产抗体细胞与靶微生物的第二变体或其含表位片段混合或孵育，其中导入的细胞组合物包括与靶微生物的第二变体或其含表位片段复合的产抗体细胞。
在一些实施方式中，含表位片段包括靶微生物的必需蛋白质(essentialprotein)或必需蛋白质的片段。
在一些实施方式中，含表位片段包括源自靶微生物的细菌外膜(om)蛋白，膜蛋白，包膜蛋白，细胞壁蛋白，细胞壁组分，表面脂质，糖脂，脂多糖，糖蛋白，表面多糖，荚膜，表面附属物，鞭毛，菌毛，单分子表面层，或s-层或其片段。
在一些实施方式中，含表位片段包括来自靶微生物表面的脂质。在一些实施方式中，含表位片段包括脂多糖(lps)或脂蛋白。
在一些实施方式中，含表位片段包括外膜(om)蛋白。在一些实施方式中，om蛋白选自bama，lptd，adec，adek，btub，fadl，feca，fepa，fhac，fhua，lamb，mepc，mexa，nalp，nmpc，nspa，nupa，omp117，omp121，omp200，omp71，ompa，ompc，ompf，ompg，ompt，ompw，opca，opra，oprb，oprf，oprj，oprm，oprn，osta，pagl，pagp，phoe，plda，pora，porb，pord，porp，smec，smef，srpc，sucy，tolc，ttgc和ttgf。在一些实施方式中，om蛋白是bama或lptd。
在一些实施方式中，通过溶解om蛋白或其片段来制备含表位片段。在一些实施方式中，通过添加一种或多种去污剂或表面活性剂进行溶解。
在本文提供的方法的一些实施方式中，该方法还包括在与产抗体细胞混合或孵育之前再折叠含表位片段。在一些实施方式中，再折叠在一种或多种去污剂或表面活性剂的存在下进行。
在一些实施方式中，去污剂或表面活性剂选自：月桂基二甲基氧化胺(ldao)，2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)，两亲高分子(amphipol)，两亲高分子a8-35，c8e4，曲通x-100，辛基葡糖苷，dm(正癸基-β-d-吡喃麦芽糖苷)，ddm(正十二烷基-β-d-吡喃麦芽糖苷，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(chaps)和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(chapso)。
在本文提供的方法的一些实施方式中，该方法还包括用两亲性聚合物或表面活性剂替换制备中的一些或全部去污剂和/或表面活性剂。
在一些实施方式中，在与产抗体细胞混合或孵育之前，从含表位片段的制备中除去或减少过量的去污剂或表面活性剂至对产抗体细胞无毒和/或不诱导产抗体细胞裂解的水平或量。
在一些实施方式中，第一和第二变体各自独立地包括靶微生物的含表位片段。在一些实施方式中，第一和第二变体共享至少一个保守区域或结构域。在一些实施方式中，第一和第二变体各自包含彼此不同的至少一个区域或结构域。
在一些实施方式中，第一和第二变体包括衍生自相同微生物的两种不同临床分离物的om蛋白或其片段。
在一些实施方式中，第一变体和/或第二变体是全长om蛋白，且第一和/或第二变体中的另一个是om蛋白的片段，其包括om蛋白的免疫显性表位或环的缺失。
在一些实施方式中，鉴定的抗体结合靶微生物的至少一个保守区域或结构域。
在本文提供的方法的一些实施方式中，供者已经用靶微生物或靶微生物的含表位片段或其变体免疫或被其感染。在一些实施方式中，供者是免疫的动物或感染的动物。在一些实施方式中，供者是哺乳动物或鸟。在一些实施方式中，供者是人，小鼠或鸡。在一些实施方式中，供者是被微生物感染的人供者。在一些实施方式中，供者是经遗传修饰的非人动物，其产生部分人抗体或完全人抗体。
在本文提供的方法的一些实施方式中，产抗体细胞包含外周血单核细胞(pbmc)，b细胞，浆母细胞或浆细胞。在一些实施方式中，产抗体细胞包含b细胞，浆母细胞或浆细胞。
在一些实施方式中，通过正选择或负选择从供者中选择多个候选产抗体细胞以分离或富集b细胞。在一些实施方式中，b细胞是浆母细胞或浆细胞。在一些实施方式中，所述选择是基于选自以下一种或多种的细胞表面标志物的表达的正选择：cd2，cd3，cd4，cd14，cd15，cd16，cd34，cd56，cd61，cd138，cd235a(血型糖蛋白a)和fceria。在一些实施方式中，产抗体细胞包含cd138+细胞。在一些实施方式中，至少或至少约50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％或更多的细胞是浆细胞或浆母细胞和/或是cd138+细胞。
在一些实施方式中，抗体是抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，凝胶微滴通过基于微流体的方法产生。在一些实施方式中，凝胶微滴包括选自以下的材料：琼脂糖，角叉菜胶，藻酸盐，藻酸盐-聚赖氨酸，胶原，纤维素，甲基纤维素，明胶，壳聚糖，细胞外基质，葡聚糖，淀粉，菊粉，肝素，透明质酸，纤维蛋白，聚乙烯醇，聚(n-乙烯基-2-吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚(甲基丙烯酸羟乙酯)，丙烯酸酯聚合物和聚丙烯酸钠，聚二甲基硅氧烷，顺式聚异戊二烯，puramatrixtm，聚二乙烯基苯，聚氨酯或聚丙烯酰胺或其组合。
在一些实施方式中，凝胶微滴包括琼脂糖。在一些实施方式中，琼脂糖是低胶凝温度琼脂糖。在一些实施方式中，琼脂糖的胶凝温度低于约35℃，约30℃，约25℃，约20℃，约15℃，约10℃或约5℃。在一些实施方式中，琼脂糖的胶凝温度为约5℃至约30℃，约5℃至约20℃，约5℃至约15℃，约8℃至约17℃，或约5℃至约10℃。
在本文提供的方法的一些实施方式中，步骤(b)还包括在包封后将凝胶微滴在约0℃至约5℃的温度下孵育约1分钟至约10分钟。
在一些实施方式中，珠，例如与其含表位片段结合的珠，具有约100nm至约100μm，或约3μm至约5μm的平均直径。
在一些实施方式中，候选产抗体细胞与凝胶微滴的平均比率小于1或小于约1。在一些实施方式中，候选产抗体细胞与凝胶微滴的平均比率为约0.05至约1.0，约0.05至约0.5，约0.05至约0.25，约0.05至约0.1，约0.1至约1.0，约0.1至约0.5，约0.1至约0.25，约0.25至约1.0，约0.25至约0.5或0.5至约1.0，各自包括端值。在一些实施方式中，候选产抗体细胞与微滴的平均比率为0.1或约0.1。
在一些实施方式中，微生物与凝胶微滴的平均比率为约50至约150或约50至约100。
在一些实施方式中，珠与凝胶微滴的平均比率为约2至约10或约3至约5。
在一些实施方式中，候选细胞与微生物与珠的平均比率为约0.1:100:10。
在一些实施方式中，凝胶微滴包含生长培养基并被非水性环境包围。在一些实施方式中，非水性环境包括油。在一些实施方式中，油是气体透过性的。
在本文提供的方法的一些实施方式中，该方法还包括在步骤(c)之前在37℃或约37℃的温度下孵育凝胶微滴。在一些实施方式中，凝胶微滴在生长培养基中孵育。
在本文提供的方法的一些实施方式中，该方法还包括，在步骤(c)之前，将结合抗体的试剂引入凝胶微滴中，所述试剂包括可检测部分。在一些实施方式中，所述试剂包括对由包封的产抗体细胞产生的抗体具有特异性的二抗。
在一些实施方式中，确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段相结合的抗体包括检测复合物的存在，其包括：(i)靶微生物或其含表位片段；(ii)由产抗体细胞产生的抗体；和(iii)包含结合的可检测部分的试剂，其中该复合物的存在表明抗体特异性结合靶微生物或其含表位片段。
在一些实施方式中，确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段结合的抗体包括确定抗体的存在是否修饰相同凝胶微滴中靶微生物的表型特征，其中经修饰的表型特征的存在表明抗体特异性结合靶微生物或其含表位片段。
在一些实施方式中，经修饰的表型特征选自：细胞生长，细胞死亡，结合，转录，翻译，表达，蛋白质转运，细胞或膜结构，粘附，运动，细胞应激，细胞分裂，细胞活力和/或行为的改变。
在一些实施方式中，确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段结合的抗体包括检测由报告分子产生的信号，其中该信号在存在经修饰的表型特征的情况下产生。在一些实施方式中，微生物包括编码报告分子的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸包括与编码报告分子的序列操作性连接的调节区，其中调节区对经修饰的表型特征具有响应性。在一些实施方式中，调节区包括启动子。
在一些实施方式中，经修饰的表型特征包括细胞应激，并且信号在细胞应激的存在下产生。在一些实施方式中，细胞应激包括对细菌的外膜(om)的应激。在一些实施方式中，用可检测部分检测由报告分子产生的信号。
在一些实施方式中，由报告分子产生的信号包括荧光信号，发光信号，色度信号，化学发光信号或放射性信号。在一些实施方式中，报告分子是荧光蛋白，发光蛋白，色蛋白或酶。
在一些实施方式中，确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段结合的抗体包括确定抗体的存在是否杀伤相同凝胶微滴中的靶微生物，其中对于靶微生物的杀伤表明抗体特异性结合靶微生物或其含表位片段。在一些实施方式中，凝胶微滴包含指示细胞死亡的可检测部分。
在一些实施方式中，可检测部分包括一种或多种可检测标记物，其选自：发色团部分，荧光部分，磷光部分，发光部分，光吸收部分，放射性部分和过渡金属同位素质量标签部分。
在本文提供的方法的一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：(d)分离包含产生鉴定的抗体的细胞的微滴，或分离编码被鉴定为特异性结合靶微生物或其含表位片段的抗体的多核苷酸。在一些实施方式中，使用显微操纵器或自动分选器进行分离。
在本文提供的方法的一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：(e)确定编码鉴定的抗体的核酸的序列。在一些实施方式中，利用核酸扩增和/或测序来确定核酸的序列。在一些实施方式中，利用单细胞pcr和核酸测序来确定核酸的序列。
在本文提供的方法的一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：(f)将含有编码鉴定的抗体或其片段的核酸序列的多核苷酸引入细胞中。
在一些实施方式中，所提供的方法在步骤(a)完成后的约60天，50天，40天，30天，20天，19天，18天，17天，16天，15天，14天，13天，12天，11天，10天，9天，8天，7天，6天，5天，4天，3天，2天或1天内完成。
在一些实施方式中，所提供的方法在步骤(a)完成后的约30天，20天，19天，18天，17天，16天，15天，14天，13天，12天，11天，10天，9天，8天，7天，6天，5天，4天，3天，2天或1天内完成。
本文还提供了使用本文提供的方法鉴定的抗体，或该抗体的任何抗原结合片段。在一些实施方式中，提供的抗体与存在于革兰氏阴性细菌的bama(β-桶组装机器)的至少一个保守区域或结构域中的表位相结合。
本文还提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与存在于革兰氏阴性细菌的bama(β-桶组装机器)的至少一个保守区域或结构域中的表位相结合。
在所提供的抗体或其抗原结合片段的一些实施方式中，革兰氏阴性细菌是不动杆菌物种。在一些实施方式中，革兰氏阴性细菌是鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaummannii)。在一些实施方式中，保守区域或结构域是来自鲍氏不动杆菌atcc19606和鲍氏不动杆菌atcc17978的bama之间共有的保守区域或结构域。在一些实施方式中，保守区域或结构域包括seqidno：11中列出的鲍氏不动杆菌bama序列氨基酸残基423-438，440-460，462-502，504-533，537-544，547-555，557-561，599-604，606-644，646-652，659-700，702-707，718-723，735-747，749-760，784-794，798-804，806-815和817-841。在一些实施方式中，保守区域或结构域包括seqidno：12-20中所示的序列。
在一些实施方式中，表位是保守区域或结构域的连续或非连续序列。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是人抗体或抗原结合片段。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段由产抗体细胞产生，所述产抗体细胞来自经工程改造以产生人源化抗体的转基因动物。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是重组的。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是单克隆的。
在一些实施方式中，提供的抗体或其抗原结合片段是抗原结合片段。
在一些实施方式中，所提供的抗体或其抗原结合片段还包括亲和标签，可检测蛋白，蛋白酶切割序列，接头或非蛋白质部分。
在一些实施方式中，所提供的抗体或抗原结合片段对鲍氏不动杆菌bama的平衡解离常数(kd)是或小于或小于约400nm，300nm，200nm，100nm，50nm，40nm，30nm，25nm，20nm，19nm，18nm，17nm，16nm，15nm，14nm，13nm，12nm，11nm，10nm，9nm，8nm，7nm，6nm，5nm，4nm，3nm，2nm或1nm。
本文还提供了编码本文提供的任何抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
本文还提供了含有本文提供的任何抗体或其抗原结合片段的组合物。在一些实施方式中，组合物还含有药学上可接受的赋形剂。
本文还提供了含有多个微滴的组合物，其中每个微滴包含：候选产抗体细胞；和靶微生物。在一些实施方式中，每个微滴还含有与固体支持物结合的靶微生物或其含表位片段或其变体。在一些实施方式中，靶微生物含有编码报告分子的多核苷酸。
本文还提供了凝胶微滴的文库，其中每个微滴包含：候选产抗体细胞；和靶微生物。在一些实施方式中，每个微滴还含有与固体支持物结合的靶微生物或其含表位片段或其变体。在一些实施方式中，靶微生物含有编码报告分子的多核苷酸。
附图说明
图1提供了所提供方法的一个实施方式的图，其在一些方面包括从表达抗体的b细胞来源的b细胞富集，功能性抗体选择和单细胞克隆。在一些情况下，所提供的方法可以称为快速抗体发现(rad)平台。
图2提供了rad平台中稀有b细胞富集的一个实施方式的示意图。该方法允许通过用一种变体进行免疫并用仅具有共同保守表位的第二种变体进行富集，来富集针对感兴趣靶抗原上的高度保守的表位的抗体。示例靶标根据氨基酸保守性由阴影标示。浅阴影对应于可变区域，深阴影对应于保守区域。
图3显示了功能性抗体选择的实施方式。病原体抗体捕获(pat)技术的该实施方式允许检测产生稀有抗体的抗体分泌型细胞。绿色荧光信号(带箭头的浅灰色斑点)表明可以在阳性pat内的珠和细菌上看到抗体结合。
图4提供了bama的同源模型。左图显示了带状结构，而右图显示了鲍氏不动杆菌bama的空间填充模型。在一组鲍氏不动杆菌临床分离物中根据保守性标记氨基酸。环4基本上是多样的，但在细胞外表面上发现了高度保守的表位。浅阴影对应于可变区域，深阴影对应于保守区域。
图5显示了稀有b细胞扩增步骤的实施方式的示意图，以bama变体为例。b细胞igg特异性分析中的每个暗点代表分泌抗体的b细胞。bama变体2特异性分析中的每个暗点代表产生针对保守表位的抗体的b细胞。
图6a-6b显示功能性抗体选择的免疫荧光。绿色荧光(由浅灰色斑点和箭头表示)描绘了来自山羊抗小鼠-alexafluor488的信号；箭头描绘了来自抗体结合的细菌的信号；箭头描绘来自抗体结合的bama包被的珠的信号；空心箭头表示来自未标记细菌的信号；而空心箭头描绘来自未标记的抗原包被的珠的信号；比例尺＝25μm；图6a描绘了含有b细胞的中心颗粒，所述b细胞分泌针对保守的表面暴露型bama表位的抗体，通过来自细菌和珠的荧光信号鉴定。图6b描绘了移液管尖端中的单个选定颗粒。
图7显示重组抗体与bama的高度保守表位的结合。代表性的elisa曲线(重复样品)。在颗粒筛选中鉴定的重组抗体显示特异性结合三种bama变体(变体1，3和4)，但不结合阴性对照蛋白(bsa)，表明该表位位于bama的高度保守区域。
图8-10是显示在所提供方法的某些实施方式中使用的凝胶包封的筛选方法的各种实施方式的图。
图11a-11c显示了用具有对外膜(om)应激具有响应性的报告物的细菌细胞对含有产抗体细胞的微滴进行的检测。荧光信号表明存在om应力和/或om的破坏。
图12显示了来自靶向lptd/lpte的九种杂交瘤产生的抗体的elisa结合测定的光密度(od)测量的直方图。进行elisa以评估在1:50和1:250稀释度下针对lptd/lpte的结合，以及在1:50下的针对阴性对照抗原(bama)的结合。
图13a和13b显示了从用bama变体1免疫的小鼠产生的多克隆血清对差异表达bama变体5的鲍氏不动杆菌菌株的细胞结合反应的荧光信号的重叠直方图。图13a显示了表面不表达bama的鲍氏不动杆菌的结合。图13b显示了与表达bama变体5的鲍氏不动杆菌的结合。
具体实施方式
本公开内容提供了用于鉴定与微生物，例如病原微生物，例如细菌其它感染因子结合的抗体的测定或方法。在本文提供的方法的一些实施方式中，该方法包括鉴定结合靶微生物的抗体。在一些实施方式中，该方法包括以下步骤：(a)获得多个候选产抗体细胞；(b)将靶微生物与多个候选产抗体细胞包封在凝胶微滴中；和(c)确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生结合靶微生物的抗体，从而鉴定特异性结合靶微生物的抗体。在特定的实施方式中，该抗体能够抑制靶细胞，细菌和其它感染因子的生长或增殖。在特定实施方式中，抗体能杀伤靶细胞，细菌和其它感染因子。
与传统的小分子药物相比，治疗性抗体具有许多优点，使其成为治疗新发感染性疾病的有吸引力的选择。抗体对靶抗原具有精确的特异性，大大降低了脱靶毒性的风险。这种有益的安全性允许预防性和治疗性治疗选择，以及适合儿科和老年人群的安全范围，这些人群在新发感染性疾病爆发期间通常具有最高风险。此外，大多数人抗体具有较长的半衰期(约21天)，具有可预测的人体清除率，这可以在受感染的个体中实现单剂量治疗选择，并进一步实现高风险个体的预防性治疗选择。这些有利的抗体特性也支持快速的临床开发途径，这对于感染性疾病爆发期间的快速反应是必需的。不仅加速了临床开发，而且新的抗体发现技术使得治疗性抗体鉴定比传统的小分子发现更快。最后，已确定药物组合能够限制耐药性，但由于潜在的药物-药物相互作用和意外的脱靶毒性，难以快速开发小分子药物组合。抗体提供了快速配制抗体混合物的可能性，这将限制耐药性并增加效力的宽度。由于上述原因，人或人源化抗体可用于治疗感染性疾病。
传统上，难以鉴定能够广泛中和给定病原体的所有临床分离物的单一抗体。这是因为病原体与宿主免疫反应处于“军备竞赛(armsrace)”状态。例如，当宿主免疫应答由功能性中和抗体支配时，病原体必须逃避宿主防御以留下成功的病原体。
病原体利用两种基本方法来保持免疫显性抗体反应不被广泛中和。首先，它们在必需蛋白质上产生高度可变和免疫显性的表位，诱使宿主产生针对高度可变表位的大量非功能性抗体。这些表位充当诱饵，其使宿主免疫应答的焦点偏离更保守的重要表位。其次，它们通过使意图保护的保守功能性表位不易被接近来对它们进行保护，从而大大减少了与这些重要表位结合的抗体的数量。这使得广泛中和抗体的频率非常低并且使用传统抗体发现方法(例如杂交瘤)几乎不可能发现这些抗体。该范例的最近实例可以在与广泛中和的甲型流感抗体的发现有关的文献中找到。免疫后或活跃的流感感染期间产生的大多数抗体与甲型流感表面上的高度可变的表位结合。因此，抗体反应在后续时期期间不具有保护作用，使得个体在其一生中多次感染流感。几十年前，流感表面上一个高度保守的表位被确定，但直到最近免疫学和分子生物学的进展才发现可以结合该表位并广泛中和所有甲型流感的抗体。
所提供的方法提供了一种高效且有效的方法，用于快速产生，筛选和鉴定感兴趣的候选产抗体细胞，其特异性结合感兴趣的含表位片段，例如在靶微生物的物种和/或变体间保守的表位。
i.定义
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。
如本文所用，术语“有效量”是指至少在必要的剂量和时间段内有效实现所需结果，例如，对抗原的增强的免疫应答，肿瘤生长或转移的减少，或肿瘤尺寸减小的量。可在一次或多次给药中给予有效量。
如本文所用，除非另有说明，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。
本文中述及“约”值或参数是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。在特定实施方式中，对于约的提及是指比值或参数高或低10％的范围，而在其它实施方式中，它是指比值或参数高或低5％或20％的范围。本文中述及“约”值或参数，包括(并描述)指向该值或参数本身的方面。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。
如本文所用，术语“调节”意指改变，并且与对照相比，包括正调节，例如“增加”，“增强”，“诱导”或“刺激”，以及负调节，例如“减少”，“抑制”或“减小”，通常以具有统计学显著性或生理学显著量。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量一般是“统计学显著的”量，并且可包括增加1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括之间并大于1的所有整数和小数，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的由无本文所述处理或对照处理产生的量，包括之间的所有整数。“减少的”、“抑制的”或“增小的”量一般是“统计学显著的”量，并且可包括减少由无本文所述处理或对照处理产生的量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％，包括之间的所有整数。
“统计学显著的”指结果不太可能偶然发生。统计学显著性可用本领域已知的任何方法测定。
常用的显著性测量法包括p值，其代表若零假设成立时观察到的事件会发生的频率或可能性。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝原假设。在简单的情况下，显著性水平定义为p值为0.05或更小。
应理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括“包含”，“组成”和“基本上由......组成”方面和实施方式。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包含任意同种型的抗体或免疫球蛋白，保持特异结合抗原的抗体片段，包括但不限于fab、fv、scfv和fd片段，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体以及含有抗体和非抗体蛋白的抗原结合部分的融合蛋白。所述抗体能进行可检测标记，例如用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等。该抗体还可偶联于其它部分，如特异性结合对成员，如生物素(生物素-亲和素特异性结合对的成员)等。抗体也可以与固体支持物结合，包括但不限于聚苯乙烯板或珠等。该术语还包括fab'，fv，f(ab’)2，和/或保留与抗原特异性结合的其它抗体片段，以及单克隆抗体。抗体可以以多种其它形式存在，包括例如fv，fab和(fab’)2，以及双功能(即，双特异性)杂合抗体(例如，lanzavecchia等，eur.j.immunol.17,105(1987))和单链(例如，huston等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.,85,5879-5883(1988)和bird等，science,242,423-426(1988))。(一般参见hood等，《免疫学》(immunology)，benjamin,n.y.，第2版(1984)，以及hunkapiller和hood，nature，323,15-16(1986))。还包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原-结合性)抗体片段，包括片段抗原结合(fab)片段、f(ab')2片段、fab'片段、fv片段、重组igg(rigg)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(vh)区、单链抗体片段，包括单链可变片段(scfv)，和单结构域抗体(例如，sdab、sdfv、纳米抗体)片段。该术语包括免疫球蛋白的基因工程改造和/或其它修饰的形式，如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体，和异源偶联抗体、多特异性例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体，和四抗体、串联二-scfv、串联三-scfv。除非另外说明，术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段，本文也称为“抗原结合片段”。该术语也包括完整或全长抗体，包括任意类型或亚型的抗体，包括igg及其亚型，igm、ige、iga，和igd。
如本文所用，载体(或质粒)是指核酸构建体，通常是环状dna载体，其含有不连续元件，其用于将异源核酸引入细胞中以表达或复制核酸。载体通常保持附加型，但可以经设计以使基因或其部分稳定整合到基因组的染色体中。在一些情况下，载体含有复制起点，其允许在细菌或真核细胞中产生许多质粒拷贝，而不将质粒整合到宿主细胞dna中。这些载体的选择和使用是本领域技术人员熟知的。
术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换使用，指单链和/或双链多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)，以及rna或dna的类似物或衍生物。多核苷酸分子的长度在本文中以核苷酸(缩写为“nt”)或碱基对(缩写为“bp”)给出。术语“核酸”还包括核酸的类似物，例如肽核酸(pna)，硫代磷酸酯dna和其它此类类似物和衍生物。核酸可以编码基因产物，例如多肽，调节rna，微小rna，sirna和功能性rna。因此，核酸分子意在包括所有类型和大小的dna分子，包括cdna，质粒或载体以及包括修饰的核苷酸和核苷酸类似物的dna。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，表示氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽可包括氨基酸残基，其包括天然和/或非天然氨基酸残基。该术语还包括所述多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面中，所述多肽可包含对原始或天然序列进行的修饰，只要该蛋白质保留所需活性即可。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主突变或pcr扩增所致的误差。
如本文所用，关于具体基因使用的“调节序列”或“调节区”是指该基因内的编码或非编码核酸控制序列，其必需或足以提供基因编码区的受调节表达。因此，该术语包括启动子序列，调节蛋白结合位点，上游激活子序列等。调节区内的特定核苷酸可以起到多种功能。例如，特定核苷酸可以是启动子的一部分并参与转录激活蛋白的结合。
“操作性(地)连接”指核酸表达控制序列(如启动子)和第二核酸序列之间的功能连接，其中所述表达控制序列引导对应于该第二序列的核酸的转录。
在两个或更多个核酸或多肽序列的内容中，“相同”或“同一性”的百分比是指当使用序列比较算法或通过目视检查确定时，比较并对齐以获得最大相似性，两个或更多个序列相同或具有特定百分比的相同核酸残基或氨基酸残基。对象氨基酸序列与参考氨基酸序列的“序列同一性百分比”或“％同一性”或“％序列同一性”或“％氨基酸序列同一性”是指当序列最佳比对时，对象氨基酸序列在比较长度上以指定的百分比与参考氨基酸序列相同(即一个接着一个氨基酸序列)。因此，相对于两个氨基酸序列，80％氨基酸序列同一性或80％同一性意味着两个最佳比对的氨基酸序列中80％的氨基酸残基是相同的。
如本文所用，术语“工程化的/经工程改造的”和“重组的”细胞或“重组的”核酸分子意指已经导入外源dna片段或基因(例如编码至少一种融合蛋白的cdna或基因)或者这种含有外源dna片段或基因的核酸分子的细胞。因此，工程化的细胞可与不含重组导入的外源dna区段或基因的天然存在的细胞区分开。因此，工程化的细胞是具有通过人为干预导入的一种或多种基因的细胞。重组细胞包括具有导入的cdna或基因组基因的细胞，并且还包括与不与特定导入基因天然相关的启动子相邻的基因。
如本文所用，“报告分子”是指可直接或间接检测到或能够以其它方式度量其存在的分子。在一些方面，受体分子包括可以发射可检测信号(例如荧光信号)的蛋白质，以及可以催化可检测反应或催化可检测产物形成的酶。报告分子还可包括可检测的核酸。在一些实施方式中，报告分子是当在细胞中表达时可以检测到的多肽。在一些情况下，可检测报告分子的表达可导致产生信号，例如荧光，生物发光或色度信号，其可使用常规技术检测。信号可以在表达后直接从报告分子产生，或间接通过二级分子产生，例如标记的抗体。
术语“报告细胞”和“报告微生物”可互换使用，指工程化的微生物，其中已经导入了编码报告分子的外源或异源多核苷酸，例如cdna或基因。因此，报告细胞可与不含重组导入的外源多核苷酸的天然存在的微生物区分开。因此，报告细胞是具有通过人为干预引入的一种或多种基因，并且表达外源报告分子的细胞。
如本文所用，关于多核苷酸或基因述及的异源(也称为外源或外来)是指对于生物体或其中包含的基因而言不是天然的或正常情况下不在表达该该核苷酸序列的生物体(例如，细菌体)内产生的核苷酸序列。
如本文所用，试剂盒是包装的组合，其任选地包括其它组成要素，例如其它试剂和用于其组合或组成要素的使用说明。试剂盒任选包含使用说明。
除非另有说明，本发明的实施将采用细胞培养、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，例如，《分子克隆：实验室手册》(molecularcloning:alaboratorymanual)，第三版(sambrook等，2001)冷泉港出版社；《寡核苷酸合成》(oligonucleotidesynthesis)(p.herdewijn编，2004)；《动物细胞培养》(animalcellculture)(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法》(methodsinenzymology)(学术出版公司)；《实验免疫学手册》(handbookofexperimentalimmunology)(d.m.weir和c.blackwell编)；《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(genetransfervectorsformammaliancells)(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《新编分子生物学方案》(currentprotocolsinmolecularbiology)(f.m.ausubel等编，1987)；《pcr：聚合酶链反应》(pcr:thepolymerasechainreaction)(mullis等编，1994)；《新编免疫学方案》(currentprotocolsinimmunology)(j.e.coligan等编，1991)；《分子生物学简明方案》(shortprotocolsinmolecularbiology)(威利父子出版社(wileyandsons)，1999)；《临床实验室免疫学手册》(manualofclinicallaboratoryimmunology)(b.detrick,n.r.rose和j.d.folds编，2006)；《免疫化学方案》(immunochemicalprotocols)(j.pound编，2003)；《生物化学实验手册：免疫学和生物技术》(labmanualinbiochemistry:immunologyandbiotechnology)(a.nigam和a.ayyagari编，2007)；《免疫学方法手册：综合技术资料手册》(immunologymethodsmanual:thecomprehensivesourcebookoftechniques)(ivanlefkovits编，1996)；《抗体使用：实验室手册》(usingantibodies:alaboratorymanual)(e.harlow和d.lane编，1988)；等。
本发明中提及的所有出版物，包括专利文件、学术论文和数据集，均以各个体出版物好似独立地通过引用纳入的相同程度通过引用其全文纳入本文用于所有目的。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其它出版物中所示的定义不同或其它情况下不一致，则相对于通过引用纳入本文的文件中的定义，以本文所示的定义为主。
本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。
ii.使用病原体抗体捕获技术(pat)筛选抗体的方法
本文提供了快速有效筛选产抗体细胞以鉴定结合靶微生物的抗体的方法。所提供的方法利用凝胶包封产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞，以及靶微生物和/或抗原(例如，在凝胶微环境中)，以就产生具有靶微生物(例如细菌或真菌细胞)结合、行为改变或杀菌活性的抗体的能力快速筛选抗体产生型b细胞和/或浆母细胞。所提供的方法特别适用于鉴定可以广泛中和给定病原微生物的全部或大部分临床分离物的单一抗体，以及用于鉴定有效治疗难以用常规治疗剂治疗的感染(例如多重耐药性微生物)的抗体。
本公开内容部分涉及用于鉴定结合细胞、细菌和其它感染因子(例如微生物)表面的抗体的方法和/或测定。在特定的实施方式中，该抗体能够抑制靶细胞、细菌和其它感染因子的生长或增殖。在特定实施方式中，所述抗体能够杀伤靶细胞、细菌和其它感染因子。
在一些实施方式中，所提供的方法可以鉴定使用常规方法难以鉴定的抗体，和/或可以鉴定靶向难以产生相针对的抗体的表位的抗体。例如，在一些实施方式中，所提供的方法可以鉴定针对靶标的抗体，所述靶标在靶微生物的许多变体和/或物种中是必需的并且是保守的，但是难以鉴定或获得其抗体。在一些情况下，难以鉴定是由于在产生抗体或产抗体细胞的常规方法中对于保守和必需的表位的阻碍，或在产生抗体或产抗体细胞的常规方法中针对靶微生物的可变、免疫显性表位的抗体占优势。在一些实施方式中，所提供的方法允许高效产生和/或筛选产生针对所需靶微生物和/或其含表位片段的抗体的候选产抗体细胞，从而减少鉴定感兴趣特定抗体所需的时间。
用于鉴定技术的现有方法具有许多限制。目前，b细胞用于杂交瘤融合技术，其处于由该b细胞产生的抗体的任何结合或功能数据的上游。杂交瘤融合技术极其低效，融合率约为每5000个b细胞中1个。因此，通过免疫应答产生的抗体库中的大多数不会被研究或测试抗体结合或功能。另外，b细胞杂交瘤融合伴侣不容易在除小鼠以外的物种获得，这将对的稀有细菌或真菌细胞结合和功能性抗体的检索限制到单一供者动物物种。
本文提供的方法不依赖于杂交瘤技术，因此可以研究整个免疫组库中结合或引起微生物(例如细菌或真菌细胞)表型修饰的抗体。这允许发现非常稀有抗体，这对于杂交瘤技术是不可行的。此外，所提供的方法允许人们筛选来自任何希望的动物来源的b细胞和/或浆母细胞，所述来源包括但不限于人，大鼠，鸡，美洲驼或骆驼。
在所提供方法的具体实施方式中，抗体选择步骤使用称为病原体抗体捕获(pat)技术的方法，基于凝胶包封，筛选由分泌单个抗体的b细胞和/或浆母细胞(包括富集的b细胞)产生的抗体。在特定实施方式中，所提供的方法允许在进行抗体克隆、生产和表征的更为劳动密集的步骤之前仅选择具有产生功能性抗体的最高可能性的那些b细胞。
在某些实施方式中，使用凝胶包封(例如pat技术)筛选产抗体细胞，例如b细胞。在一些实施方式中，pat技术的典型特征是将分泌单个抗体的b细胞和/或浆母细胞包封在小琼脂糖微滴中。在某些实施方式中，pat微滴的大小是均匀的。
所提供的用于鉴定结合靶微生物的抗体的方法涉及利用多种候选产生细胞和特定靶微生物，例如病原微生物或其含表位片段，例如抗原的凝胶微囊化。在一些实施方式中，该方法包括以下步骤：得多个候选产抗体细胞；将靶微生物与多个候选产抗体细胞包封在凝胶微滴中；并且确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生结合靶微生物的抗体，从而鉴定特异性结合靶微生物的抗体。
任何微生物，例如病原体，例如，任何细菌或真菌物种都可以包封在凝胶微环境中，并按照所提供的方法进行筛选。本文描述了示例性病原体。
在特定实施方式中，本发明的技术可用于鉴定结合细胞表面暴露的蛋白质，碳水化合物，脂质部分或其任何组合的抗体。
在一些情况下，与感兴趣的免疫保护蛋白，例如来自靶微生物的含表位片段偶联的珠可以共同包封在琼脂糖微滴中。本文发现所提供的方法可以使用微生物进行，例如病原体，例如细菌细胞，其可以共同包封在相同的琼脂糖微滴中，获得pat包封。如图3所示，可以包封产抗体细胞，例如杂交瘤细胞与抗原偶联的珠(例如，与靶微生物的含表位片段偶联的珠)和微生物(例如，细菌细胞)中之一或两者以鉴定分泌与珠上或细菌表面上的抗原(例如bama)结合的抗体的杂交瘤细胞。使用所提供的方法，即使在以非常低的频率与产生不结合抗原的抗体的杂交瘤细胞混合后，也可以容易地检测抗原结合性克隆。
因此，在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：在微滴中包封靶微生物或其变体的含表位片段；并且确定被鉴定为与靶微生物结合的产抗体细胞是否也在同一凝胶微滴中结合其含表位片段。
在某些实施方式中，通过检视(例如通过荧光显微镜检查)确定所需抗体的存在。在一些实施方式中，用荧光二抗对pat进行染色以检视并确定一抗是否与靶蛋白特异性结合。使用低倍荧光显微镜，如果分泌的抗体与识别的抗原结合，则可在pat内看到点状荧光斑点。在一些实施方式中，检测分泌的抗体与偶联至珠的免疫保护性蛋白质和病原体表面上的靶蛋白质的结合。在一些这样的情况下，与抗原偶联的珠(例如，与靶微生物的含表位片段偶联的珠)和与病原体表面的抗体结合获得了非常高的置信度，即抗体是靶特异性的并且能够识别病原体表面天然产生的免疫保护蛋白。
在特定实施方式中，pat技术用于功能性筛选抗体以直接鉴定抑制靶标，例如，抑制靶微生物的生长或增殖的抗体。
在一些方面，可以简单地选择包含感兴趣的阳性b细胞的pat，用于在发现平台的下一阶段中进行克隆。因为人眼可以如此快速地从缺少信号的阴性pat中辨别出阳性pat内的荧光信号，所以一名科研工作者可以使用pat技术快速筛选数十万个b细胞。有趣的是，pat方法比流体分离系统(例如facs)高效得多，其允许筛选显著更多的b细胞以发现感兴趣的稀有抗体。
在一些实施方式中，可以使用数千至数百万或更多凝胶包封的产抗体细胞的高通量筛选来实施所提供的方法。在一些实施方式中，可以使用所提供的方法在单个发现实验期间对数百万个b细胞进行pat包封和筛选。在某些实施方式中，在包封后，允许b细胞在琼脂糖液滴内分泌抗体几小时，然后进行抗体的筛选和选择。本文所述方法的实施方式可用于针对病原体，例如，细菌或真菌，细胞结合或功能性抗体快速筛选数百万抗体分泌性b细胞。
在一些实施方式中，每天可筛选至少1百万个b细胞。在某些实施方式中，该方法允许每次pat筛选克隆约100个抗体。在某些实施方式中，所述方法能够进行每次pat筛选约100个抗体的转染，纯化，体外效力分析。
本公开的具体实施方式涉及现有技术的抗体发现平台，其整合了稀有b细胞富集，功能性抗体选择，接着是单b细胞克隆，其可称为快速抗体发现(rad)平台。该平台允许快速扩增，选择和发现大群功能性人抗体，其结合最高度保守和重要的靶蛋白表位。
在某些实施方式中，本公开包括用于鉴定特异性结合靶微生物，例如病原体或含表位片段的抗体的方法，其包括：(a)通过将产抗体细胞导入免疫受损动物中来扩增从用靶病原体或其含表位片段感染或免疫的动物获得的产抗体细胞；(b)将按步骤(a)获自免疫受损动物的产抗体细胞与靶病原体和/或其含表位片段一起包封在凝胶微滴中，其中多个凝胶微滴包含仅一个产抗体细胞；并且(c)确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与同一凝胶微滴中存在的靶病原体和/或其含表位片段结合的抗体，从而鉴定出与靶病原体或其含表位片段特异性结合的抗体。
在本文提供的方法的一些实施方式中，所述方法包括体内富集或扩增产生针对特定靶微生物或靶微生物的抗原或表位的抗体的稀有产抗体细胞的步骤。例如，在一些实施方式中，通过以下方法获得多个候选产抗体细胞，其包括：(i)通过将产抗体细胞导入免疫受损动物来扩增从已经暴露于靶微生物或靶标微生物的含表位片段或其变体的供者获得的产抗体细胞；并且(ii)回收经扩增的产抗体细胞，从而获得多个候选产抗体细胞。在一些实施方式中，此类步骤可用于富集或扩增感兴趣的稀有产抗体细胞。
在某些实施方式中，所提供方法的具体实施方式，例如筛选产抗体细胞的方法，包括以下步骤中的一个或多个：产生b细胞和/或浆母细胞，其产生针对感兴趣靶标的人源化抗体或人抗体；2)例如，使用体内富集(例如scid扩增)来扩增b细胞和/或浆母细胞，例如稀有b细胞，以获得富含所需抗体的细胞；3)凝胶包封方法，用于包封单个b细胞与抗原和感兴趣的病原体以选择具有最高潜力的b细胞；和单b细胞克隆。在某些实施方式中，在鉴定所提供的用于筛选产抗体细胞的方法中的信号时，人眼可比诸如facs的自动化系统更适合。因此，在某些实施方式中，使用荧光显微术来快速鉴定和选择含有感兴趣细胞(例如产生特异性结合靶微生物的抗体的细胞)的凝胶微滴。
本方法提供了一种平台，其允许在进行更加劳动密集的抗体发现下游步骤之前富集具有最高治疗潜力的抗体。因此，在特定实施方式中，稀有b细胞富集阶段允许快速产生具有所需功能活性的大片产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞，并大大提高成功产生治疗性抗体候选物和有效的治疗抗体的机会。
在特定实施方式中，所提供的用于筛选产抗体细胞的方法，例如快速抗体发现(rad)平台，用于发现用于治疗感染性疾病的治疗性抗体。可以根据提供的方法产生靶向由绿脓假单胞菌和鲍氏不动杆菌引起的最难治疗的感染性疾病的杀菌抗体。所提供的方法可用于快速产生和鉴定针对难以通过常规疗法治疗的感染的微生物的有效抗体。
在某些实施方式中，所提供的方法用于产生高亲和性人抗体，其通过与必需外膜蛋白bama和lptd上的高度保守的表位结合而直接杀伤细菌。本文描述的初始实验已经显示这些示例性靶抗原的实验证据和验证，其可用于抗体结合并且对于细菌适应性和存活是必需的。
虽然该平台适用于发现针对任何靶标的抗体，但它特别适合快速响应对人类健康构成重大威胁的感染性疾病。在一些实施方式中，所提供的方法可以在比鉴定抗体的常规方法短得多的时间内鉴定特定抗体。例如，在一些实施方式中，所提供的方法在获得候选产抗体细胞后的约60天，50天，40天，30天，20天，19天，18天，17天，16天，15天，14天，13天，12天，11天，10天，9天，8天，7天，6天，5天，4天，3天，2天或1天内完成。在一些实施方式中，所提供的方法在获得候选产抗体细胞后的约30天，20天，19天，18天，17天，16天，15天，14天，13天，12天，11天，10天，9天，8天，7天，6天，5天，4天，3天，2天或1天内完成。具体地，所提供的方法的具体实施方式，例如抗体发现平台技术可以分为三个阶段：稀有b细胞富集(例如，约10天)，功能性抗体选择(例如，约1天)和单b细胞克隆(例如，约7天)，其从b细胞提取到鉴定治疗性抗体候选物总共需要大约18天(例如，参见图1)。
在一些实施方式中，提供的方法包括鉴定特异性结合靶微生物的抗体。在一些实施方式中，所述方法还包括分离包含产生鉴定的抗体的细胞的微滴，或分离编码被鉴定为特异性结合靶微生物或其含表位片段的抗体的多核苷酸。在一些实施方式中，该方法还包括确定编码鉴定的抗体的核酸的序列。在一些实施方式中，可以利用核酸扩增和/或测序方法进行对产生感兴趣抗体的产抗体细胞的分离和对编码感兴趣抗体的序列的确定。例如，在一些实施方式中，单细胞pcr和克隆用于分离和序列确定。在某些实施方式中，用于筛选产抗体细胞的方法的单b细胞克隆阶段利用所提供方法高效地由pcr扩增编码在所选凝胶微滴内产生的抗体的重链和轻链基因的能力。在特定实施方式中，pcr在单细胞水平进行，避免了pcr前7天b细胞增殖步骤的需要。另外，单细胞pcr消除了对杂交瘤融合伴侣的需要，这使得从任何动物b细胞来源(包括人类)进行抗体发现成为可能。在短短几个小时内，所提供的方法允许从富集的b细胞和/或浆母细胞池进展到选择具有最大潜力的b细胞和/或浆母细胞，并开始对编码这些抗体的核酸进行pcr扩增。
所提供的用于筛选产抗体细胞的方法提供了优于传统抗体发现平台的许多优点。首先，它允许发现天然产生的完全人抗体，因此在某些情况下消除了人源化的需要并最终加速了开发时间线。其次，这些方法允许b细胞和/或浆母细胞的扩增和富集，所述b细胞和/或浆母细胞产生针对微生物的最重要表位，例如感兴趣的免疫保护蛋白，例如感兴趣的抗原或表位的抗体。第三，凝胶包封技术允许在提供宝贵的时间和资源以克隆编码抗体的基因之前测试抗原特异性和结合。此外，与传统抗体发现方法相比，单一b细胞克隆技术与线性dna转染技术相结合显著减少了所需的时间。因此，在约18天内，所提供的用于筛选产抗体细胞的方法可产生一组完全人抗体，其被验证以结合微生物的最高度保守和重要的表位，例如免疫保护性蛋白质靶标，例如抗原或感兴趣的表位。这比传统的小鼠杂交瘤技术快得多，传统的小鼠杂交瘤技术通常需要至少2个月才能验证结合靶抗原或表位的一组抗体。相比于仅来自最主要b细胞克隆并且因此可能是非功能性的一组杂交瘤抗体，通过所提供的方法鉴定的抗体具有显著优势。另外，杂交瘤抗体在发现后仍需要经历漫长的人源化过程，说明所提供的用于筛选产抗体细胞的方法如何在响应新出现的传染病威胁时节省大量时间(约4个月)。
所提供的用于筛选产抗体细胞的方法可填补对新出现的感染的响应能力的差距。抗体疗法提供安全性，提供广泛的临床适用性，能够满足儿科和其它特殊人群的需求。与其它抗体产生技术不同，提供的用于筛选产抗体细胞的方法具有非常短的从b细胞到克隆抗体的生产周期。这使得它适用于应对以前未知病因的疾病，针对这些疾病几乎没有可用的分子工具。特别相关的是，新发疾病的感染或恢复的受害者可以使用所提供的方法提供产抗体细胞，例如b细胞，用于筛选。此外，所提供的方法的极其选择性的能力，可以鉴定到为由于缺乏治疗潜力的抗体的淹没而被其它方法错过的稀有抗体。
在一个方面，所提供的方法涉及抗体发现平台，其能够快速产生治疗候选物以解决多种传染病威胁。如上所述，根据所提供的方法鉴定感兴趣抗体所需的时间明显少于使用现有方法鉴定感兴趣抗体。此外，所提供的方法允许鉴定与感兴趣的保守表位结合由于微生物上存在免疫显性的高变性表位而使用现有方法难以鉴定的稀有抗体。该技术也可用于鉴定靶向细菌或真菌细胞的此类抗体。在具体实施方式中，该平台用于产生对多重耐药性革兰氏阴性细菌具有内在杀菌活性的抗体。在具体的实施方式中，本发明的方法用于鉴定和获得特异性结合bama或lptd的抗体。
用于筛选产抗体细胞的所提供方法的优点包括但不限于：
●治疗性抗体的安全性，特异性和药代动力学特性非常适合于感染性疾病对策的快速开发
●高特异性和低脱靶毒性潜力使抗体成为高风险患者群体(如儿科和老年人)的理想治疗剂。
●所提供的筛选产抗体细胞的方法允许产生针对重要表位的治疗性抗体，这对于传统的杂交瘤或噬菌体抗体方法是不可能的
●稀有功能性抗体的体内稀有细胞富集(例如scid小鼠扩增)解锁(unlock)了整个免疫库的多样性
●包括产抗体细胞(例如b细胞和/或浆母细胞)的凝胶微滴的筛选比用于查询大量单细胞的流体系统更快
●单b细胞克隆消除了对融合伴侣的需要，允许从任何细胞来源发现人抗体；并且单b细胞克隆确保正确的重链和轻链配对，这是噬菌体展示所不可能的。
a.候选产抗体细胞
在本文提供的方法的任何实施方式中，待筛选和鉴定的多种候选产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞，可来自多种来源，例如供者动物和/或经修饰的细胞。在一些实施方式中，候选产抗体细胞获自已经暴露于靶微生物或其含表位片段或其变体和/或其任何组合的供者(例如动物)。例如，在一些实施方式中，产抗体细胞获自已经用靶抗原或其表位或变体，表达靶抗原或其表位或变体的感兴趣微生物，和/或其任何组合或混合物免疫或被其感染的供者(例如动物)。
在某些实施方式中，从用靶微生物(例如病原体或其含表位片段)感染或免疫动物获得并扩增的产抗体细胞是外周血单核细胞(pbmc)或b细胞或浆母细胞。
在某些实施方式中，产抗体细胞获自人或其它动物供者，其被病原体感染或用病原体或其含表位片段免疫。在一些实施方式中，供者是哺乳动物或鸟。在一些实施方式中，供者是人，小鼠或鸡。
在具体的实施方式中，产生人抗体的b细胞获自人或人源化动物，例如小鼠或鸡，其用靶病原体免疫或用靶病原体感染。在具体实施方式中，病原体是细菌，病毒或其它微生物。在一些实施方式中，供者是被微生物感染的人供者。
在某些实施方式中，用靶病原体或其含表位片段感染或免疫的动物是遗传修饰的非人动物，其产生部分人或完全人抗体。这些动物是本领域已知和可获得的，包括但不限于例如转染色体牛和转基因啮齿动物，例如trianni转基因小鼠，和转基因鸡，例如来自晶体生物科学公司(crystalbiosciences)的humab鸡。
在一些实施方式中，产抗体细胞是已经修饰的细胞的细胞，例如遗传或物理修饰的细胞。在一些实施方式中，产抗体细胞是融合细胞，例如杂交瘤。在一些实施方式中，产抗体细胞尚未被修饰。
在一些实施方式中，采用富集产抗体细胞。在一些实施方式中，可以通过将与抗原(例如靶微生物的含表位片段)复合的产抗体细胞导入免疫受损动物(例如scid小鼠)中来进行富集。在某些实施方式中，产生结合靶病原体的抗体的b细胞和/或浆母细胞是通过将靶抗原引入免疫受损动物，例如scid动物，例如小鼠而产生的。在特定实施方式中，通过脾注射或尾静脉注射将抗原导入scid动物。涉及b细胞富集和扩增方法的示例性方法在下文第iii部分中进一步描述。
在某些实施方式中，免疫缺陷动物是具有严重联合免疫缺陷(scid)的啮齿动物，例如scid小鼠。可根据本发明使用的免疫受损动物的实例包括但不限于美国专利申请公开号us2014/0134638，depraeter等，(2001)j.immunology166:2929-2936，pct专利申请公开号wo1999/60846和美国专利号5,663,481所述的那些。
在某些实施方式中，该方法用于富集抗原特异性浆母细胞或b细胞，以鉴定稀有抗体，例如，通过体内稀有细胞富集步骤。在具体实施方式中，来自供者动物的细胞，包括产抗体细胞，例如外周血白细胞或pbmc，通过与抗原(例如，靶病原体或含表位片段)一起植入动物的脾中而被导入免疫受损动物中。在其它实施方式中，将它们单独或与靶病原体或其含表位片段组合经肠胃外，例如静脉内，例如通过尾静脉注射导入免疫受损动物。在某些实施方式中，在将产抗体细胞引入免疫受损动物之前，将其与靶病原体或其含表位片段一起孵育。
在一些实施方式中，多个候选产抗体细胞获自产抗体细胞文库，例如b细胞文库或重组产抗体细胞文库。
b.靶微生物或其含表位片段
提供的方法可用于快速且特异性地鉴定结合靶微生物的抗体。具体地，所提供的方法可用于靶微生物和/或其含表位片段或其抗原，其中用于抗体鉴定的现有方法无效、低效和/或非特异性，因为难以发现产生特异性靶向感兴趣的微生物、抗原或表位的抗体的稀有抗体-产生细胞。
在一些实施方式中，所述方法包括用靶微生物将多个候选产抗体细胞包封在凝胶微滴中。
所提供的方法可用于鉴定靶向任何感兴趣微生物的抗体。例如，靶微生物可以是病原微生物，例如病原体。靶微生物可以是原核生物，真核生物或病毒。靶微生物可以是单细胞或多细胞的。在本发明方法的各种实施方式中，病原体是微生物，包括但不限于本文所述的任何微生物。在具体实施方式中，微生物是细菌或真菌。在一些实施方式中，该病原体是细菌、病毒、寄生虫或真菌。
适用于本发明的细胞的实例包括但不限于埃希氏菌，克雷伯氏菌，不动杆菌，肠杆菌，假单胞菌，弗朗西斯菌，伯克霍尔德氏菌，葡萄球菌，链球菌，曲霉和球虫物种。
在一些实施方式中，靶微生物是细菌，例如革兰氏阴性细菌。在一些实施方式中，细菌是变形菌。例如，在一些实施方式中，靶微生物选自不动杆菌，蛭弧菌，伯克霍尔德氏菌，衣原体，肠杆菌，埃希氏菌，弗朗西斯菌，嗜血杆菌，螺杆菌，克雷伯氏菌，军团菌，莫拉氏菌，奈瑟菌，泛菌，假单胞菌，沙门氏菌，志贺氏菌，寡养单胞菌，弧菌和耶尔森氏菌的物种。
在一些实施方式中，微生物选自蜂属不动杆菌(acinetobacterapis)，鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)，百利不动杆菌(acinetobacterbaylyi)，贝杰不动杆菌(acinetobacterbeijerinckii)，贝齐不动杆菌(acinetobacterbereziniae)，布赫不动杆菌(acinetobacterbohemicus)，波希不动杆菌(acinetobacterboissieri)，布菲不动杆菌(acinetobacterbouvetii)，布瑞不动杆菌(acinetobacterbrisouii)，乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)，简德不动杆菌(acinetobactergandensis)，简瑞不动杆菌(acinetobactergerneri)，广东不动杆菌(acinetobacterguangdongensis)，瑰丽不动杆菌(acinetobacterguillouiae)，吉伦伯不动杆菌(acinetobactergyllenbergii)，溶血不动杆菌(acinetobacterhaemolyticus)，哈尔滨不动杆菌(acinetobacterharbinensis)，印度不动杆菌(acinetobacterindicus)，约氏不动杆菌(acinetobacterjohnsonii)，琼氏不动杆菌(acinetobacterjunii)，库奇不动杆菌(acinetobacterkookii)，鲁氏不动杆菌(acinetobacterlwoffii)，拿氏不动杆菌(acinetobacternectaris)，诺氏不动杆菌(acinetobacternosocomialis)，巴基斯坦不动杆菌(acinetobacterpakistanensis)，帕尔乌斯不动杆菌(acinetobacterparvus)，彼特不动杆菌(acinetobacterpitii)，皮特不动杆菌(acinetobacterpittii)，濮阳不动杆菌(acinetobacterpuyangensis)，清风不动杆菌(acinetobacterqingfengensis)，抗辐不动杆菌(acinetobacterradioresistans)，抗辐射不动杆菌(acinetobacterradioresistens)，鲁迪斯不动杆菌(acinetobacterrudis)，辛德勒不动杆菌(acinetobacterschindleri)，塞氏不动杆菌(acinetobacterseifertii)，索利不动杆菌(acinetobactersoli)，坦氏不动杆菌(acinetobactertandoii)，提氏不动杆菌(acinetobactertjernbergiae)，塔氏不动杆菌(acinetobactertowneri)，乌氏不动杆菌(acinetobacterursingii)，可变不动杆菌(acinetobactervariabilis)，温氏不动杆菌(acinetobactervenetianus)，大肠杆菌(escherichiacoli)，流感嗜血菌(haemophilusinfluenzae)，肺炎克雷伯氏菌(kilbsiellapneumoniae)，绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，鲍氏志贺氏菌(shigellaboydii)，痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae)，弗氏志贺氏菌(shigellaflexneri)，索氏志贺氏菌(shigellasonnei)，霍乱弧菌(vibriocholera)和鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)。在一些实施方式中，病原体是鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)。
在一些实施方式中，靶微生物是多重耐药性微生物。本文提供的方法的任何实施方式可用于快速有效地鉴定靶向那些靶微生物的抗体，从而允许鉴定多重耐药性靶微生物易感的新治疗剂。在一些实施方式中，靶微生物是多重耐药性革兰氏阴性细菌。
在本文提供的任何方法中，待鉴定的抗体结合靶微生物，特别是靶微生物的含表位片段。例如，在一些实施方式中，抗体结合靶微生物中表达的抗原或表位，特别是靶微生物表面上的表位。
在一些实施方式中，含表位片段可以是包含表位的细胞的任何片段或部分，其包括被免疫分子，例如抗体或免疫受体识别的抗原决定簇。例如，在一些实施方式中，含表位片段是抗原。在一些实施方式中，含表位片段是抗原的表位，或片段或部分。
在一些实施方式中，含表位片段是蛋白质或多肽或其片段。在一些实施方式中，含表位片段选自蛋白质，糖蛋白，脂质，磷脂，糖脂，脂多糖，核酸，多糖和/或其组合中的一种或多种。
在一些实施方式中，含表位片段存在于靶微生物的表面。在一些实施方式中，所述含表位片段可由所鉴定的抗体在活微生物上接近，例如与微生物表面上的抗原或表位结合。例如，在一些实施方式中，含表位片段选自细菌外膜(om)蛋白，膜蛋白，包膜蛋白，细胞壁蛋白，表面脂质，糖脂(例如脂多糖)，糖蛋白，表面多糖(例如荚膜)，表面附属物(例如鞭毛或纤毛/菌毛)，单分子表面层(例如s-层)，或其任何表位，部分或片段或其组合。在一些实施方式中，含表位片段与靶微生物的外膜(om)，细胞壁或包膜相关。在一些实施方式中，靶微生物是革兰氏阴性细菌，并且含表位片段是om蛋白。在一些实施方式中，含表位片段与om的细胞外侧相关。在一些实施方式中，含表位片段与病毒的包膜或细菌或真菌的细胞壁相关。
在一些实施方式中，微生物的含表位片段，例如抗原，是靶微生物的必需组分。在一些实施方式中，含有含表位片段的抗原是靶微生物中的必需蛋白质。在一些实施方式中，使用本文提供的方法鉴定的抗体与抗原或含表位片段的结合可导致作为微生物的必需组分的含表位片段的功能之阻断、减少、预防、改变和/或抑制，从而干扰靶微生物中的基本功能，并使靶抗微生物易受使用该抗体进行的治疗干预的影响。
在一些实施方式中，含表位片段包含革兰氏阴性细菌的om蛋白。om蛋白是完全整合的膜蛋白，其为靶微生物提供必需的功能，包括营养摄取，细胞粘附，细胞信号传导和废物输出。在一些靶微生物中，om蛋白还可作为营养物清除和宿主防御机制逃避的毒力因子。在一些情况下，例如通过抗体结合干扰革兰氏阴性细菌中必需om蛋白的功能可以杀伤或严重抑制细菌的生长。在一些实施方式中，含表位片段包含选自bama，lptd，adec，adek，btub，fadl，feca，fepa，fhac，fhua，lamb，mepc，mexa，nalp，nmpc，nspa，nupa，omp117，omp121，omp200，omp71，ompa，ompc，ompf，ompg，ompt，ompw，opca，opra，oprb，oprf，oprj，oprm，oprn，osta，pagl，pagp，phoe，plda，pora，porb，pord，porp，smec，smef，srpc，sucy，tolc，ttgc和ttgf的om蛋白。
为了选择用于抗体发现的靶微生物，抗原和/或表位，在开始着手新的感染性疾病靶标的新治疗性抗体发现工作时通常存在四个关键考虑因素。首先，感兴趣的微生物(例如病原体)内的所选靶抗原或表位必须是对于病原体的适应性或生存力而言所必需的。其次，抗体治疗剂必须能够到达靶标。第三，适合抗体结合的表位必须在病原体的最普遍的临床分离物中高度保守。最后，对于抗体与保守表位的结合将如何转化为对基本靶标的抑制应研得有力的基本原理。在一些实施方式中，满足上述四种标准的靶微生物的表位结合片段是bama，例如用于鲍氏不动杆菌中的抗体发现目的的表位结合片段。
在具体实施方式中，提供的方法可用于产生对多重耐药性革兰氏阴性细菌具有固有杀细菌活性的抗体。在一些实施方式中，此类抗体需要抗体接合(antibodyengagement)可接近的靶标，并且其抑制对细胞是致命的。最近对已知在革兰氏阴性细菌表面编码必需蛋白质的两种基因，bama(β-桶装配机器)和lptd(脂多糖转运)的表征，为杀细菌抗体的发现创造了这样的机会。在一些实施方式中，靶微生物的表位结合片段是或包含bama或lptd。
大肠杆菌中lptd或bama的耗尽会使外膜组装失败，外膜是革兰氏阴性细菌中必需的细胞器，从而导致细胞死亡。lptd和bama都是整合性外膜(om)β-桶蛋白，在外膜生物发生中起关键作用。bama是一个16链β-桶，具有五个多肽转运相关(potra)结构域，位于周质中。lptd催化脂多糖输出到细胞表面的终末步骤，而bama是折叠所有外膜蛋白(包括lptd)所需的。lptd与脂蛋白lpte形成复合物，以形成om中的复合物。对于lptd的抗体抑制会降低外膜中的lps水平，从而导致对传统抗生素的急剧致敏或细胞死亡。bama的抗体抑制将阻断外膜蛋白的折叠，从而急剧损害外膜的基本功能。lptd和bama在革兰氏阴性细菌物种中普遍存在，这提高了抑制这些靶标的抗体可能与广泛的革兰氏阴性病原体相关的可能性，从而导致革兰氏阴性细菌感染的治疗方式的范式转变。
在一些实施方式中，含表位片段包含鲍氏不动杆菌bama。在某些实施方式中，含表位片段包含seqidno：1，2，5，6或31中所示的氨基酸序列或其片段、区域或结构域。在一些实施方式中，含表位片段包含与seqidno：1，2，5，6或31中所示氨基酸序列或片段、区域或结构域包含至少90％序列同一性，例如至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，本文提供的方法中使用的含表位片段任选地与用于纯化的亲和标签和/或用于随后去除标签的切割序列连接。
在一些实施方式中，含表位片段包含鲍氏不动杆菌lptd。
在一些实施方式中，含表位片段是蛋白质或多肽的部分或片段。在一些实施方式中，含表位片段是多肽片段或连续的氨基酸残基段(stretch)，并且具有约5至约25个氨基酸残基，例如约7至约22，约9至约22，约10至约20，约12至约20，约13至约19，约14至约19，约13至约17个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，含表位片段含有不连续(构象)表位，所述表位包含在蛋白质序列中远距离分开并通过蛋白质的三维折叠而接近的多肽片段。在一些实施方式中，构象表位具有约50至约25个氨基酸残基，例如约7至约22，约9至约22，约10至约20，约12至约20，约13至约19，约14至约19，约13至约17个氨基酸残基长度的组合长度。
在一些实施方式中，含表位片段包含在靶微生物的许多变体或微生物的不同物种间保守的表位。在一些实施方式中，含表位片段包含在微生物表面或其变体表达上表达的蛋白质的许多变体间保守的表位。鲍氏不动杆菌的示例性变体包括但不限于鲍氏不动杆菌atcc19606，鲍氏不动杆菌atcc17978，鲍氏不动杆菌菌株1440422，鲍氏不动杆菌菌株msp4-16和鲍氏不动杆菌菌株1202252。
在一些实施方式中，变体衍生自相同微生物的不同临床分离物。在一些实施方式中，两种或更多种变体，例如变体蛋白，各自独立地包含靶微生物的含表位片段。在一些实施方式中，两种或更多种变体(例如变体蛋白)共有至少一个保守区域或结构域。在一些实施方式中，所述两种或更多种变体各自包含彼此不同的至少一个区域或结构域。在一些实施方式中，两种或更多种变体(例如蛋白质变体)的长度不同，例如，变体之一具有蛋白质的特定区域或结构域的缺失。在本文提供的方法的一些实施方式中使用的含表位片段可以衍生自天然产生的变体和/或可经遗传工程改造或操作。例如，在一些实施方式中，含表位片段包含第一变体和第二变体蛋白，并且第一和/或第二变体是全长，而第一和/或第二变体中的另一个是包括蛋白质的免疫显性表位或环之缺失的蛋白质片段。在一些实施方式中，可以工程改造含表位片段以阻止抗体与膜蛋白的周质部分或细胞内部分上的保守表位结合。在一些实施方式中，可以在不同变体之间交换含表位片段的结构域或区域，以产生包含来自一种变体的某些结构域或区域，以及来自靶微生物的另一变体的其它结构域或区域的新变体。例如，在一些实施方式中，含有表位的可变环可以在不同变体之间交换。例如，bama变体5(在seqidno：31中列出)是bama变体1的修饰形式，其中胞外环4是在bama的不同分离物和变体之间高度可变的环，其被bama变体2的胞外环4序列替代。
在一些实施方式中，保守表位是在鲍氏不动杆菌的至少两种不同变体之间保守的表位。在一些实施方式中，保守表位是在bama的至少两种不同变体之间保守的表位。例如，在一些实施方式中，靶微生物是鲍氏不动杆菌，并且bama的第一和第二变体在鲍氏不动杆菌的第一和第二变体上表达。在一些实施方式中，鲍氏不动杆菌的第一和第二变体衍生自不同的临床分离物。bama含有在不同变体之间表现出显著氨基酸多样性的区域或结构域，特别是在胞外环中，例如在环4中(参见例如图4)。在一些实施方式中，表现出显著氨基酸多样性的区域或结构域是高变和/或免疫显性区域或结构域。bama还含有保守的结构域或区域，它们在不同的变体间是保守的。在一些实施方式中，此类高度保守的结构域或区域对蛋白质的功能是必需的或关键的。
在一些实施方式中，保守表位是或包含连续的氨基酸序列。在一些实施方式中，保守表位是或包含非连续的氨基酸序列。例如，bama是跨膜蛋白，并且包含周质结构域，跨膜β-桶和胞外和周质环。对于与靶微生物表面上的含表位片段(例如om蛋白)结合的抗体，胞外环暴露于靶微生物的表面上。因此，此类抗体将与暴露的胞外环内的表位结合。对于作为跨膜蛋白的om蛋白，例如bama，表位可包含非连续序列，因为抗体可结合包含一个或多个不连续的胞外环或其部分或其组合的表位。
在各种鲍氏不动杆菌中保守的示例性区域可包括seqidno：11中列出的鲍氏不动杆菌atcc19606bama序列的氨基酸残基423-438，440-460，462-502，504-533，537-544，547-555，557-561，599-604，606-644，646-652，659-700，702-707，718-723，735-747，749-760，784-794，798-804，806-815和817-841。在一些实施方式中，在各种鲍氏不动杆菌中保守的示例性保守区域包括seqidno：12-30中所示的任何一种或多种氨基酸序列或其任何片段。
在一些实施方式中，使用本文提供的方法鉴定的抗体结合的表位是微生物的不同变体之间的保守表位，例如在微生物表面上表达的蛋白质的不同变体上的保守表位。在一些实施方式中，鉴定的抗体结合靶微生物的至少一个保守区域或结构域。这种鉴定的与保守表位结合的抗体可以有效对抗广泛的微生物变体，例如不同血清型的病原体，或多种病原体物种。
在一些实施方式中，其含表位片段可以通过在细胞系统中表达或在增强蛋白质产生的培养基中生长来产生。在一些实施方式中，可以使用重组技术产生含表位片段的全部或一部分。在一些实施方式中，可以在重组细菌或真菌蛋白质表达系统中产生含表位片段。在一些实施方式中，可用于重组表达的示例性细菌细胞包括大肠杆菌菌株mc4100，b1lk0，rr1，大肠杆菌le392，大肠杆菌b，大肠杆菌x1776(atcc编号31537)，大肠杆菌bl21-de3和大肠杆菌w3110(f-，λ-，原养型，atcc编号273325)。
在一些实施方式中，含表位片段经重组产生，并经历纯化。在一些实施方式中，编码含表位片段或其变体的多核苷酸与编码亲和标签或纯化标签的多核苷酸操作性连接，以促进纯化。示例性亲和标签包括多组氨酸标签(例如，在seqidno：10中列出)，strep标签，flag标签，avitagtm，ha-标签，myc标签和gst标签。在一些实施方式中，多核苷酸编码含表位片段和亲和标签的融合蛋白。在一些实施方式中，纯化柱用于从重组表达系统的其余生物材料中分离或纯化含表位片段。在一些实施方式中，本文提供的方法中使用的含表位片段任选地与切割序列连接，例如蛋白酶切割位点。在一些实施方式中，蛋白酶切割位点可用于随后去除亲和标签。示例性的切割序列包括烟草蚀刻病毒(tev)切割位点。在一些实施方式中，本文提供的方法中使用的含表位片段任选地与一个或多个标签和/或一个或多个切割序列连接。此类标签的示例包括avitag-10xhis-tev(如seqidno：9所示)。
在一些实施方式中，含表位片段是膜蛋白，例如om蛋白，并且所提供的方法包括产生含表位片段的制剂，其包括膜相关多肽或片段的溶解，变性和/或再折叠。在一些实施方式中，溶解和/或再折叠需要另一种蛋白质，其与含表位片段形成复合物。例如，lptd与om中的脂蛋白lpte形成复合物，并且lpte的制备需要lptd的正确再折叠。表位结合片段的制剂可以通过标准重组dna技术产生，并且如果需要，可以溶解表位结合片段，例如使用本领域已知的或本文描述的任何方法。用于溶解膜蛋白的示例性步骤包括wo2015/097154中描述的那些。
在一些实施方式中，提供的该方法还包括在与产抗体细胞混合或孵育之前再折叠含表位片段。在一些实施方式中，再折叠在一种或多种去污剂或表面活性剂的存在下进行。在一些实施方式中，可以使用制剂中的去污剂或表面活性剂使含表位片段溶解、变性和/或再折叠。在一些实施方式中，溶解的和/或变性的制剂可以例如在去污剂或表面活性剂的存在下再折叠或变性。在一些实施方式中，去污剂或表面活性剂选自月桂基二甲基氧化胺(ldao)，2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)，两亲高分子，两亲高分子a8-35，c8e4，曲通x-100，辛基葡糖苷，dm(正癸基-β-d-吡喃麦芽糖苷)，ddm(正十二烷基-β-d-吡喃麦芽糖苷，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(chaps)和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(chapso)。在一些实施方式中，可以在免疫接种或者与产抗体细胞接触或孵育之前除去制剂中的过量去污剂。
在某些实施方式中，其含表位片段与固体支持物，如珠结合。在某些实施方式中，使用合适的连接剂(例如，合适的基于邻硝基苄基的连接剂)将含有抗原的片段或病原体抗原系连到基材上，所述连接剂具有一个或多个以下特征：用于连接的基材标签，间隔物部分，接头，例如可切割的接头和反应性基团。在某些实施方式中，标签可以是亲和标签，例如生物素基团等，或反应性部分(例如羧基，氨基，卤素基团，甲苯磺酸酯基，甲磺酸酯基，反应性羟基或金属氧化物)，其可以与基材表面上的合适位点(例如，醇，氨基亲核试剂，硫醇亲核试剂或硅烷基团)反应以在基材和接头或含有抗原的片段之间产生共价键。在某些实施方式中，间隔物可含有非反应性烷基链，例如含有3-12个碳原子(例如，5-氨基己酸)，并且可选择可裂解的接头为含有适当的化学物质(参见上文)。反应性基团通常与效应分子反应并与其行形成共价键。合适的反应基团包括卤素(巯基反应性)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)-碳酸盐(胺反应性)和n,n-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺(即羟基反应性的)，并且几种其它反应性基团是本领域已知的，并且可以容易地用于本发明的方法中。
在某些非限制性实施方式中，珠粒的尺寸范围可以为20nm至200μm或更大。在一些实施方式中，珠粒的平均直径为约100nm至约100μm，约250nm至约75μm，约500nm至约50μm，约750nm至约25μm，约1μm至约10μm，约2μm至约8μm，约3μm至约7μm或约3μm至约5μm；或者具有约1μm，2μm，3μm，4μm，5μm，6μm，7μm，8μm，9μm或10μm的平均直径。
在一些实施方式中，珠可以由例如聚苯乙烯制成，但也使用其它材料例如聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)，聚乙烯基甲苯(pvt)，苯乙烯/丁二烯(s/b)共聚物，苯乙烯/乙烯基甲苯(s/vt)。可用于本发明的珠可从许多来源商业获得，包括分子探针公司(molecularprobes)(英杰公司(invitrogen))，旁氏实验室公司(bangslabs)和聚合微球公司(polymicrospheres,inc)。
可以使珠在其表面上显示各种化学官能团。通常使用的反应性基团包括羧基，氨基，醛，羟基，环氧基和氯甲基(参见，例如，美国专利号4,217,338，5,326,692，5,786,219，4,717,655，7,445,844，5,573,909和6,023,540)。在某些实施方式中，接头可以连接到这些反应基团，并且含靶抗原的片段可以通过接头直接或间接偶联。
c.凝胶包封
所提供的方法包括将多个候选产抗体细胞与靶微生物包封在微滴，例如，凝胶微滴中。在一些实施方式中，微滴包含(i)候选产抗体细胞和(ii)靶微生物。在一些实施方式中，所述方法还包括在微滴中包封靶微生物的含表位片段或其变体，例如靶微生物的抗原或其表位或变体。在具体实施方式中，微滴包含：(i)一种或多种产抗体细胞；和(ii)靶微生物，例如病原体，和/或其含表位片段。在一些实施方式中，含表位片段与固体支持物，例如珠结合。微滴，例如，凝胶微滴可包含靶微生物的多个拷贝，例如病原体，和/或其含表位片段。微滴，例如，凝胶微滴提供了一种快速有效的筛选结合靶抗原的抗体的方法，并且与任何常规方法相比，可以显著减少鉴定具有对特定靶标的所需结合特异性的抗体所需的时间。
在一些实施方式中，通过正选择或负选择选择或纯化多个候选产抗体细胞，以分离或富集产抗体细胞，例如b细胞，浆母细胞和/或浆细胞。在一些实施方式中，产抗体细胞是浆母细胞或浆细胞。在一些实施方式中，在包封之前，从供者或免疫受损动物的器官或组织样品中选择或纯化产抗体细胞。在一些实施方式中，器官或组织样品是脾或淋巴结。在一些实施方式中，器官或组织样品是外周血。在一些实施方式中，从供者或免疫受损动物获得的细胞是外周血单核细胞(pbmc)，b细胞，浆细胞和/或浆母细胞。
在一些实施方式中，对于来自器官或组织样品的细胞，例如多个候选产抗体细胞，基于细胞表面标志物的表达进行一种或多种正选择或负选择。在一些实施方式中，获得候选产抗体细胞包括基于细胞中一种或多种特定分子，例如表面标志物，例如表面蛋白，细胞内标志物或核酸的表达或存在选择细胞类型。在一些实施方式中，任何已知的基于此类标志物的选择方法可用于获得候选产抗体细胞。在一些实施方式中，选择是基于亲和性或免疫亲和性的选择。例如，在一些方面，分离包括对细胞和细胞群进行选择，所述选择基于细胞的一种或多种标志物的表达或表达水平(通常是细胞表面标志物)，例如通过与特异性结合这些标记物的抗体或结合剂一起孵育，之后通常是洗涤步骤和从未与抗体或结合剂结合的那些细胞中选择已结合所述抗体或结合剂的细胞。
这样的选择步骤可以基于正选择，其中保留了结合试剂的细胞用于进一步应用，和/或负选择，其中保留了未与抗体或结合剂结合的细胞。
选择不需要获得100％富集或特定细胞群或表达特定标志物的细胞的去除。例如，特定类型细胞(如表达某标志物的细胞)的正选择或富集指的是提高此类型细胞的数量或百分数，其结果不必是使不表达该标志物的细胞完全消失。同样地，特定类型细胞(如表达某标志物的细胞)的负选择、去除或消除指的是减少此类细胞的数量或百分数，其结果不必是此类细胞的完全清除。
在一些实例中，进行多轮选择步骤，其中来自一个步骤的正选择或负选择的级分经历另一个选择步骤，例如随后的正选择或负选择。在一些实例中，单个选择步骤可以同时消耗表达多个标志物的细胞，例如通过将细胞与多种抗体或结合剂一起孵育，每种抗体或结合剂特异于负选择靶向的标志物。同样地，通过将细胞与多种抗体或在各种细胞类型上表达的结合剂一起孵育，可以同时正选择多种细胞类型。
在一些实施方式中，选择是正选择，并且细胞表面标志物选自以下一种或多种：cd2，cd3，cd4，cd14，cd15，cd16，cd34，cd56，cd61，cd138，cd235a(血型糖蛋白a)和fceria。在一些实施方式中，使用一个或多个选择步骤，例如一个或多个单独的选择步骤，以获得用于包封和筛选的候选产抗体细胞。在一些实施方式中，商业细胞选择试剂盒，例如可从美天旎生物技术公司(miltenyibiotech)获得的b细胞分离试剂盒，来自干细胞技术公司(stemcelltechnologies)的easyseptmb细胞分离试剂盒，来自干细胞技术公司的cd138+细胞分离试剂盒或dynabeadsb细胞试剂盒，可用于获得候选产抗体细胞。其它已知的标志物和/或方法可用于分离所需的候选产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞。在一些实施方式中，用于包封的多个候选产抗体细胞包含cd138+细胞。在一些实施方式中，至少或至少约50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％或更多的细胞是浆细胞或浆母细胞和/或是cd138+细胞。
在一些实施方式中，将候选产抗体细胞与优化用于凝胶包封的培养基混合。在一些实施方式中，凝胶包封培养基包括促进产抗体细胞活力的细胞培养基，以及在包封期间防止产抗体细胞沉降以提高包封效率的密度梯度培养基。可使用的示例性密度梯度培养基包括市售密度梯度培养基，例如optipreptm，lymphopreptm，polymorphpreptm，
在一些实施方式中，凝胶微滴包含聚合物基质和/或凝胶基质。在某些实施方式中，凝胶微滴包含琼脂糖，角叉菜胶，藻酸盐，藻酸盐-聚赖氨酸，胶原，纤维素，甲基纤维素，明胶，壳聚糖，细胞外基质，葡聚糖，淀粉，菊粉，肝素，透明质酸，纤维蛋白，聚乙烯醇，聚(n-乙烯基-2-吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚(甲基丙烯酸羟乙酯)，丙烯酸酯聚合物和聚丙烯酸钠，聚二甲基硅氧烷，顺式聚异戊二烯，puramatrixtm，聚二乙烯基苯，聚氨酯或聚丙烯酰胺。在特定实施方式中，凝胶微滴包含聚合物基质，其可以是例如琼脂糖，角叉菜胶，藻酸盐，藻酸盐-聚赖氨酸，胶原，植物来源的树胶，纤维素或其衍生物(例如，甲基纤维素)，明胶，壳聚糖或细胞外基质(ecm)，如kleinman(美国专利号4,829,000)所述，或其组合。可用于凝胶微滴的合成水凝胶包括但不限于聚乙烯醇，乙烯-乙烯醇的嵌段共聚物，聚苯乙烯磺酸钠，乙烯基-甲基-三苄基氯化铵和聚磷腈。
可根据本发明使用的凝胶微滴和筛选方法包括本领域已知和可获得的任何凝胶微滴和筛选方法。可以使用的凝胶微滴和筛选方法的实例包括但不限于美国专利号8,415,173，8,030,095，7,939,344，7413868和8445193，美国专利申请公开号us20080038755和us20060073095以及pct专利申请公开号wo2015/038817中描述的那些。
在一些实施方式中，通过基于微流体的方法产生微滴。可用于产生微滴的示例性基于微流体的装置包括μencapsulator系统(白云石微流体公司(dolomitemicrofluidics))和
在一些实施方式中，凝胶微滴包含琼脂糖。在一些实施方式中，琼脂糖是低胶凝温度的琼脂糖，例如超低胶凝温度的琼脂糖。在一些实施方式中，低胶凝温度琼脂糖允许琼脂糖在较低温度下保持为液体，例如允许产抗体细胞和靶微生物(例如病原体)有活力的温度，从而允许活细胞和靶微生物，例如，病原体的包封。在一些实施方式中，用于包封的琼脂糖的胶凝温度使得液体琼脂糖的温度不会不利地影响产抗体细胞和/或靶微生物(例如病原体)的活力，并且可以在液态下进行凝胶包封。在一些实施方式中，琼脂糖的胶凝温度低于约35℃，例如约30℃，约25℃，约20℃，约15℃，约10℃或约5℃。在一些实施方式中，琼脂糖是超低胶凝温度的琼脂糖，例如胶凝温度低于约20℃，约15℃，约10℃或约5℃的琼脂糖。在一些实施方式中，琼脂糖的胶凝温度为约5℃至约30℃，约5℃至约20℃，约5℃至约15℃，约8℃至约17℃，或约5℃至约10℃，例如约8℃至约17℃。
在一些实施方式中，凝胶包封在允许产抗体细胞和靶微生物(例如病原体)有活力的温度下进行，例如，约37℃，约35℃，约30℃，约25℃或约20℃。
在本文提供的方法的一些实施方式中，所述方法包括在低于聚合物基质和/或凝胶基质的胶凝温度的温度下孵育微滴的步骤，例如，在约0℃至约5℃，例如约0℃，约1℃，约2℃，约3℃，约4℃或约5℃的温度下。在一些实施方式中，孵育持续约1分钟至约10分钟，例如约1分钟，约2分钟，约3分钟，约4分钟，约5分钟，约6分钟，约7分钟，约8分钟，约9分钟，或约10分钟。
在一些实施方式中，所提供的方法还包括在确定结合之前在37℃或约37℃的温度下孵育凝胶微滴。该步骤促进产抗体细胞(例如b细胞或浆母细胞)的存活和抗体分泌。在一些实施方式中，将凝胶微滴在生长培养基中孵育。培养基中孵育的时间可以基于产抗体细胞的最佳存活和抗体分泌来确定。在一些实施方式中，孵育为约45分钟至2小时，例如约1小时。
在一些实施方式中，在包封步骤期间或之后，凝胶微滴被非水性环境包围。在一些实施方式中，凝胶微滴包含生长培养基并被非水性环境包围。在一些实施方式中，非水性环境包含油。在一些实施方式中，油是气体透过性的。气体透过性油的存在允许微滴的物理分离，并且可以确保分泌的抗体不会逃离非水性环境，从而在微滴中产生足够高浓度的抗体以提高筛选效率。可使用的示例性气体透过性油包括氟化油，包括但不限于3mtmnovectm7500和fluorinertfc40(西格玛奥德里奇公司(sigmaaldrich))。在一些实施方式中，凝胶微滴在包封后在非水性环境中孵育。在一些实施方式中，在测定结合之前，将凝胶微滴在非水性环境中在37℃或约37℃的温度下孵育。在一些实施方式中，非水性环境包含气体透过性油，例如3mtmnovectm7500或fluorinertfc40。
在一些实施方式中，微滴包含一种或多种靶微生物，例如病原体或靶微生物，例如病原体的一种或多种含表位片段或其变体。在一些实施方式中，微滴包含一种或多种靶微生物，例如病原体和靶微生物，例如病原体的一种或多种含表位片段或其变体。在一些实施方式中，靶微生物(例如微滴中的病原体)在靶微生物(例如病原体)的表面上表达其表位或变体。在一些实施方式中，其包含表位的变体与固体支持物，例如珠结合。例如，在一些实施方式中，微滴包含用含表位片段包被的一个或多个珠。
在一些实施方式中，微滴包含产抗体细胞。在一些实施方式中，微滴平均包含一个或更少的产抗体细胞。在一些实施方式中，候选产抗体细胞与凝胶微滴的平均比率小于1或小于约1。在一些实施方式中，候选产抗体细胞与凝胶微滴的平均比率为约0.05至约1.0，约0.05至约0.5，约0.05至约0.25，约0.05至约0.1，约0.1至约1.0，约0.1至约0.5，约0.1至约0.25，约0.25至约1.0，约0.25至约0.5或0.5至约1.0，各自包括端值。在一些实施方式中，候选产抗体细胞与微滴的平均比率为0.1或约0.1。
在一些实施方式中，微滴可含有单一产抗体细胞和多种靶微生物，例如病原体。在一些实施方式中，微滴可以含有单个产抗体细胞和靶微生物的多个含表位片段，例如与固体支持物例如，珠结合的含表位片段。
产抗体细胞和靶微生物，例如，病原体和/或含表位片段的数量可以通过泊松统计来控制，例如，如powell(biotechnology19908：333-7)；weaver等(biotechnology19919：873-877)中所述。在包封过程中，组分颗粒(例如，产抗体细胞，靶微生物，例如病原体，含表位片段，例如与固体支持物结合的那些)随机分布到新生的微滴中。由于几乎所有颗粒都包埋到微滴中，如果颗粒的数量超过微滴的数量，则每个微滴平均可含有>1个颗粒。同样，如果微滴的数量超过颗粒的数量，那么每个微滴平均可含有<1个颗粒。
通常，对于本文所述的一些方法，可能需要每个微滴具有一个或更少的产抗体细胞，因为这确保了可以作用于靶微生物的单一类型的产抗体细胞的包封，例如，病原体和/或含表位片段，因此产生比在微滴中存在多种类型的产抗体细胞更能清楚解释的结果。在一些情况下，微滴可以含有产抗体细胞，其将随着时间的推移而生长，导致每个微滴中具有多个产抗体细胞。在这种情况下，一个微滴中的细胞始于克隆，因此仅产生一种类型的抗体。
在一些实施方式中，可以基于所需的筛选、检测和鉴定方法以及凝胶包封参数，优化候选细胞与靶微生物(例如病原体与含表位片段)的比率以及微滴中每种的平均数量。考虑这种优化的示例性变量包括但不限于例如靶微生物的大小，微滴的大小，微滴中的其它颗粒的数量，检测信号的强度，产抗体细胞的抗体输出和抗体的亲和力。对于靶微生物，例如病原体和/或含表位片段，可能需要在每个微滴中包含每种类型的多个成员。在一些实施方式中，候选细胞与微生物与珠的平均比率为约0.1:100:10。在一些实施方式中，候选细胞与微生物与珠的平均比率为约0.1:200:5，或约0.1:50:20。
可以优化每个微滴的靶微生物(例如病原体)的数量，以确保在筛选和鉴定产抗体细胞期间信号的可见性，以及与微滴的大小有关。在作为细菌的靶微生物的情况下，每个微滴的平均靶微生物数量可以为约5至约500，例如约10至约250，约50至约200，约50至约150，约50至约100，或约80至约120，例如约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190或200。对于细胞大小较大的微生物，例如真菌或寄生虫，每个微滴的靶微生物的数量可以平均较低。
可以针对荧光信号灵敏度和特异性优化含表位片段，例如，每个微滴与固体支持物结合的那些片段的数量。考虑的示例性变量包括但不限于例如珠的大小，微滴中的其它颗粒的数量，微滴的大小，检测信号的强度，产抗体细胞的抗体输出和抗体的亲和性。例如，对于包被在珠上的含表位片段，珠与凝胶微滴的的平均比率可以为约2至约25，约3至约8，约3至约7，约3至约5，约5至约20，约5至约15，约7至约15，约8至约12，约9至约11，或约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20。
d.检测或鉴定产抗体细胞
在本文提供的方法的一些实施方式中，所述方法包括确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生结合靶微生物的抗体。这些步骤可以允许鉴定特异性结合靶微生物的抗体。具体地，在一些实施方式中，本文提供的方法能鉴定使用常规方法难以鉴定的抗体。在一些实施方式中，所提供的方法可用于鉴定针对使用常规方法难以鉴定的靶表位的抗体。
在一些实施方式中，用于确定结合的此类步骤包括确定被鉴定为结合靶微生物的抗体是否在相同凝胶微滴中还结合其含表位片段。在一些实施方式中，用于确定结合的步骤包括检测分子结合，例如，抗体与靶微生物的含表位片段的结合的存在的方法和/或测定。在一些实施方式中，所提供的方法包括检测结合、靶微生物的表型特征的修饰和/或靶微生物的死亡或活力的方法和/或测定。在一些实施方式中，确定结合和/或其下游效应，例如修饰靶微生物的表型特征和/或死亡或生存力，在凝胶微滴内和/或使用报告分子进行。
在一些实施方式中，所提供的方法包括在确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生结合靶微生物的抗体之前向凝胶微滴中引入结合抗体的试剂的步骤，所述试剂包含可检测的部分。例如，该试剂包含对由包封的产抗体细胞产生的抗体具有特异性二抗。
在具体实施方式中，凝胶微滴包含可检测的部分，其有助于检测结合靶病原体或其含表位片段的抗体。在某些实施方式中，可检测部分特异性结合由包封的产抗体细胞产生的抗体。在某些实施方式中，可检测部分是对由包封的产抗体细胞产生的抗体具有特异性的带标记的二抗。来自任何物种的产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞，可以通过简单地改变荧光二抗使得它对b细胞产生的一抗具有特异性而用于该技术。
在具体实施方式中，确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生结合靶微生物，例如存在于相同凝胶微滴中的病原体和/或其含表位片段的抗体包括检测复合物的存在，该复合物包含：(i)靶微生物，例如病原体，或其含表位片段；(ii)由产抗体细胞产生的抗体；和(iii)可检测部分，其中复合物的存在表明抗体特异性结合靶病原体或其含表位片段。在一些实施方式中，可以通过添加带标记的二抗来进行确定结合，所述带标记的二抗是例如可以结合由候选产抗体细胞产生的一抗的抗体。例如，在一些实施方式中，二抗可检测针对特定表位(例如保守表位)的一抗的存在和/或结合，并且二抗的存在表明存在一抗和/或一抗与靶微生物和/或其含表位片段的结合。在一些实施方式中，二抗包含可检测标记物。
例如，在图8所示的一个示例性实施方式中，来自任何来源的单一产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞，可以单独包封在凝胶微环境中。产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞，将分泌一抗，其将在凝胶包封的微环境中积累。任何靶微生物，例如感兴趣的细菌或真菌细胞，可以包封在相同的凝胶微环境中。另外，由产抗体细胞(例如b细胞和/或浆母细胞)产生的对一抗同种型具有特异性的二级荧光抗体也可以包封在凝胶微环境中。一抗将与二抗结合以形成荧光抗体复合物。如果一抗对细菌或真菌细胞没有结合特异性，则荧光抗体复合物将保持扩散，这可以通过使用荧光显微镜来分析各个凝胶微环境来检测，例如，缺少斑点和/或来自可检测标记物的离散点状信号。如图8所示，如果一抗结合靶微生物，例如细菌或真菌细胞的表面，则荧光抗体复合物将在凝胶微环境内形成离散的点状荧光斑点，其可通过使用荧光显微镜检测，并且将选择该b细胞用于下游加工和抗体发现。
在某些实施方式中，确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生结合靶微生物，例如存在于相同凝胶微滴中的病原体和/或其含表位片段的抗体包括确定抗体的存在是否修饰相同凝胶微滴中靶病原体的表型特征，其中经修饰的表型特征的存在表明抗体特异性结合靶病原体或其含表位片段。在具体实施方式中，经修饰的表型特征是细胞生长或细胞死亡。
在一些实施方式中，本文提供的方法，经修饰的表型特征选自细胞生长，细胞死亡，结合，转录，翻译，表达，蛋白质转运，细胞或膜结构，粘附，运动，细胞应激，细胞分裂，细胞活力和/或行为的改变。
例如，在图9中所示的实施方式中，将单个产抗体细胞(例如b细胞和/或浆母细胞)与靶微生物(例如细菌或真菌细胞)一起包封在微环境中，所述靶微生物被设计为报告感兴趣的细胞状态。例如，为了获得引起细胞应激的抗体，细菌或真菌细胞被工程改造以在应激诱导时改变荧光特性。这些工程化的报告菌株可以在应激诱导时产生荧光化合物，或者对于给定的化学物质变得不稳定，其在应激下引起可以通过荧光显微镜检测的发生变化。如果抗体不与靶微生物(例如细菌或真菌细胞)结合，则细菌细胞内不会发生可观察到的表型变化，从而那些b细胞为不感兴趣的b细胞。抗体可以与靶微生物(例如细菌或真菌细胞)进行特异性接触，但不能引发所需的细菌或真菌表型，并且同样不对其感兴趣。然而，如图9所示，如果抗体与靶微生物(例如细菌或真菌细胞)特异性结合并调节期望的行为，则将选择产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞进行下游加工和抗体发现。如上所述，可以添加对由产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞产生的一抗同种型具有特异性的荧光二抗，以同时检测与靶微生物(例如细菌或真菌细胞)的结合，和靶微生物，例如细菌或真菌中的行为改变。
在一些实施方式中，本文提供的方法涉及确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段结合的抗体，其包括检测由报告分子产生的信号，其中该信号在修饰的表型特征存在下产生。
在一些实施方式中，本文提供的方法中使用的微生物包含编码报告分子的多核苷酸。例如，在一些实施方式中，与产抗体细胞包封在凝胶微滴中的微生物经遗传工程改造以含有产生报告分子，例如可检测的报告分子的多核苷酸，以响应特定的生理刺激或特定的细胞状态。通过遗传工程改造微生物例如细菌或真菌细胞以报告感兴趣的细胞状态，也可以容易地快速鉴定修饰抗体的行为。
在一些实施方式中，多核苷酸包括与编码报告分子的序列操作性连接的调节区，其中调节区对修饰的表型特征具有响应性。在一些实施方式中，调节区包含启动子。例如，在一些实施方式中，调节区响应于特定的修饰的表型特征。在一些实施方式中，调节区响应于例如在(例如靶微生物)存在修饰的表型特征的情况下指导与其操作性连接的报告分子的表达的修饰。
在一些实施方式中，修饰的表型特征包括细胞应激，并且在细胞应激的存在下产生信号。在一些实施方式中，细胞应激包括对细菌的外膜(om)的应激。
本领域技术人员可以容易地确定在存在修饰的表型变化的情况下基因的表达是否被调节。例如，可以比较已经暴露于经修饰的表型特征的微生物的基因的转录水平。在一些实施方式中，可以使用本领域技术人员已知的任何方法评估或确定表达水平，例如通过使用定量pcr，微阵列，rna-seq，northern印迹或sage。在一些实施方式中，可以使用微生物基因组的参考序列鉴定其序列或序列的部分或片段已被鉴定为已被调节(例如增加或减少)的基因。示例性的微生物基因组序列是已知的，并且可以在万维网上于tigr.org,kegg.jp或ncbi.nlm.nih.gov/genbank上在线获得。
在一些实施方式中，调节区或其部分包含基因的开放阅读框(orf)的上游或5'的序列，其表达响应于经修饰的表型变化而被调节(例如增加)。在一些实施方式中，调节区或其部分的序列足以提供与其操作性连接的报告分子的编码区的经调节表达，例如在诱导时或在存在经修饰的表型变化时。进行重组dna技术(包括缺失分析)以确定或鉴定足以在不同条件下诱导报告分子表达的调节区序列或其部分在本领域技术人员的能力范围内。在一些实施方式中，调节区是天然启动子或包含天然启动子。
本领域技术人员可通过标准技术鉴定调节区。例如，可以通过将推定的调节区或序列与编码报告分子的序列融合，使用标准技术将构建体引入微生物，通过引起修饰的表型改变诱导推定的调节区或上游序列，并确定报告分子是否被诱导来鉴定调节区。在不影响活性或诱导性的情况下，通常可以缩短或延长推定的调节区。本领域技术人员可以系统地测试从推定的调节区序列中去除核苷酸的效果，以确定对于修饰的表型行为需要哪种推定调节元件或哪种推定调节元件是足够的。
在一些实施方式中，可检测标记物选自发色团部分，荧光部分，磷光部分，色度部分，发光部分，化学发光部分，光吸收部分，放射性部分和过渡金属同位素质量标签部分。例如，在一些实施方式中，可通过荧光显微镜检测的任何荧光团(例如荧光部分)可用作细菌或真菌细胞行为修饰或细胞死亡的读出。
在一些实施方式中，使用选自光学显微镜，荧光显微镜，分光光度计，荧光激活细胞分选仪，荧光样品读取器，3d断层摄影仪或照相机的装置进行检测。
在一些实施方式中，用可检测部分检测由报告分子产生的信号。在一些实施方式中，由报告分子产生的信号包括荧光信号，发光信号，色度信号，化学发光信号或放射性信号。在一些实施方式中，报告分子是荧光蛋白，发光蛋白，色蛋白或酶。
在本文提供的方法的一些实施方式中，确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段结合的抗体包括确定抗体的存在是否杀伤相同凝胶微滴中的靶微生物，其中靶微生物的杀伤表明抗体特异性结合靶微生物或其含表位片段。在一些实施方式中，凝胶微滴包含指示细胞死亡的可检测部分。
在某些实施方式中，确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物，例如病原体和/或其含表位片段结合的抗体包括确定抗体的存在是否杀伤相同凝胶微滴中的靶病原体，其中靶病原体的杀伤表明抗体特异性结合靶病原体或其含表位片段。在一些实施方式中，凝胶微滴包含指示细胞死亡的可检测部分。在某些实施方式中，可检测部分能够区分活细胞和死细胞，例如活体染料。在具体实施方式中，凝胶微滴包含指示细胞死亡的可检测部分。通过使用区分活细菌或真菌细胞的荧光染料，可以快速鉴定杀细菌或杀真菌的抗体。
在一些实施方式中，可检测部分根据细胞的活力发射信号，例如，染料或包括指示细胞活力和/或死亡的染料的试剂盒。指示细胞死亡的示例性可检测部分包括但不限于：4',6-二脒基-2-苯基吲哚，5-羧基荧光素二乙酸酯，5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四唑(ctc)，7-aad，乙酰氧基甲酯(cfdaam)，膜完整性指标，aqua荧光活性染料，baclight细菌膜电位试剂盒，baclight固定油，baclightredoxsensorctc活力试剂盒，baclightredoxsensor绿色活力试剂盒，细菌计数试剂盒(细胞计数检测，c12-刃天青，钙黄绿素am，钙黄绿素am乙锭同型二聚体-1，钙黄绿素am，钙黄绿素am，calcofluor白m2r，氰基羰基氰基3-氯苯腙(cccp)，dmso中cccp，细胞增殖和细胞周期-第15.4节)，celltrace钙黄绿素am，dapi，dead红核酸染色，详细方案(产品信息表)，二盐酸盐(dapi)，二甲基亚砜(dmso)，dioc18，dmso中的dioc2，dmso，十二烷基三嗪(c12-刃天青)，乙锭同二聚体-1，f34953，可修复活力染料
在图10所示的示例性实施方式中，将单一产抗体细胞(例如b细胞和/或浆母细胞)与靶微生物(例如细菌或真菌细胞)一起包封在微环境中。然而，在这种微环境中也存在一种染料，其特异性地进入死细胞(而非活细胞)并在其中浓集。因此，可以使用显微镜检测死亡的靶微生物，例如细菌或真菌细胞。然后可以快速筛选抗体在靶微生物(例如感兴趣的细菌或真菌细胞)上引起杀灭性表型的能力。如果抗体不与靶微生物(例如细菌或真菌细胞)结合，则细菌细胞内可能不会发生可观察到的表型变化，并且将对那些b细胞不感兴趣。在具体实施方式中，抗体可以与靶微生物(例如细菌或真菌细胞)进行特异性接触，但不引发杀灭性应答。然而，如果抗体与靶微生物(例如细菌或真菌细胞)特异性结合并导致细胞死亡，则将选择该产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞进行下游加工和抗体发现。可加入由产抗体细胞(例如b细胞和/或浆母细胞)产生的对原发同种型特异的荧光二抗以同时检测细菌或真菌细胞结合和细菌或真菌细胞死亡。所提供的方法不限于用于检测细胞死亡的染料分子，因为任何报告系统均可用于特异性鉴定产生杀灭性抗体的产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞，该抗体例如可导致靶微生物死亡。在一些实施方式中，抗体是杀细菌抗体。
本公开还允许在消耗克隆、瞬时表达、纯化和测试抗体功能所需的时间和资源之前确定功能性输出。因此，只有来自那些先前被确定为产生感兴趣的功能性抗体的产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞的重链和轻链基因才能进入克隆阶段。在一些情况下，这可以在寻求稀有功能性抗体方面节省大量时间和金钱，并且可以促进产抗体细胞的高效筛选，以快速有效地鉴定感兴趣抗体。
e.分离和鉴定抗体
在一些实施方式中，提供的方法还包括分离包含产生鉴定的抗体的细胞的微滴，或分离编码被鉴定为特异性结合靶微生物或其含表位片段的抗体的多核苷酸。在一些实施方式中，提供的方法还包括确定编码鉴定的抗体的核酸的序列。
在一些实施方式中，将含有产生鉴定的抗体的细胞的凝胶微滴，例如与靶微生物或其含表位片段结合的感兴趣抗体，与多个微滴分开。在一些实施方式中，使用显微操纵器或自动化分选器进行分离。例如，在一些实施方式中，在显微镜下，例如在荧光显微镜下目视筛选凝胶微滴，并且含有产生鉴定的抗体，例如，表现出如本文所述的特定所需性质的抗体的细胞的微滴，可以在筛选过程中对它们进行鉴定时与其它微滴物理分离。在一些实施方式中，使用显微操纵器分离微滴。在一些实施方式中，自动化分选器可用于基于某一标准，例如微滴中可检测信号的水平，对特定液滴进行分选。
其它技术，如facs，允许单b细胞操作。然而，facs需要抗体被表达并保持附着于b细胞表面以便检查抗原结合。由于在facs期间具有高的物理剪切力，因此不可能使用facs来分离产生与细菌或真菌细胞表面结合的抗体的b细胞。因此，本文描述的本发明允许使用者在野生型中鉴定与微生物例如细菌或真菌的表面结合并引发细胞反应的抗体。关于由b细胞产生的抗体的这种知识深度对于仅采用facs而言是不可行的。
在一些实施方式中，提供的方法还包括确定编码鉴定的抗体的核酸的序列。在一些实施方式中，使用核酸扩增和/或测序来确定核酸的序列。本领域已知的任何确定核酸序列的方法均可用于本领域。具体地，允许从少量起始材料(例如单细胞pcr)确定核酸序列的技术可用于确定由凝胶微滴中包含的细胞产生的抗体的序列。在具体实施方式中，可以通过逆转录(rt)-pcr，蛋白质组学或用于获得抗体的分子标记的任何其它下游方法鉴定来自感兴趣的微环境中的b细胞的抗体。在一些实施方式中，使用单细胞pcr和核酸测序来确定核酸的序列。在具体实施方式中，提供的方法还包括分离编码被鉴定为特异性结合靶微生物，例如病原体，或其含表位片段(或其片段)的抗体的多核苷酸，将多核苷酸亚克隆到表达载体中，并产生特异性结合靶病原体的重组抗体。
可以检索任何凝胶微环境，例如凝胶微滴，其被鉴定为包含产生如上所述的感兴趣抗体的细胞，例如b细胞和/或浆母细胞，并且产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞的编码抗体的重链和轻链基因可以根据已建立的方案进行pcr扩增，克隆，测序和表达。例如，在一些实施方式中，本文提供的方法还包括将包含编码所鉴定的抗体或其片段的核酸序列的多核苷酸导入细胞中。在一些实施方式中，可以将多核苷酸导入哺乳动物细胞中。在一些实施方式中，可以将多核苷酸导入细胞中用于重组表达。在一些实施方式中，多核苷酸包括编码的序列。
在某些实施方式中，本发明提供了通过用编码抗体的线性pcrdna产物转染哺乳动物细胞来产生重组抗体的快速方法。这消除了在抗体产生之前质粒克隆的耗时步骤。在哺乳动物细胞转染开始制备感兴趣抗体蛋白之前，质粒克隆和验证通常需要10天。通过能够用线性pcr产物转染哺乳动物细胞，本发明的方法可用于在产生pcr产物的同一天内开始产生抗体。从单一产抗体细胞(例如b细胞)pcr扩增抗体基因并且还将这些基因以线性dna产物转染的能力将b细胞产生和治疗性抗体产生之间的时间量缩短至少17天。
然后这些抗体可用于测试用于检测的特定微生物(例如细菌或真菌细胞)的体外和体内活性和功效。在一些实施方式中，还可以在相同微生物的其它变体或其它微生物种类上测试此类抗体的体外和体内活性和功效。
可以进一步测试鉴定的抗体并评估其活性。在一些实施方式中，测试鉴定的抗体与广泛靶标的结合，例如，与微生物的许多变体或其含表位片段结合，和/或与保守表位结合，例如，在微生物或其含表位片段的许多变体间保守的表位。在一些实施方式中，测试抗体的功能活性，例如，针对靶微生物的杀伤活性，和/或改变靶微生物的表型特征的能力。在一些实施方式中，测试抗体的抗微生物活性，杀细菌活性和/或杀真菌活性。在一些实施方式中，测试抗体诱导补体结合的能力。在一些实施方式中，测试抗体针对广泛靶标，例如微生物的许多变体或其含表位片段和/或广泛的微生物变体，例如不同血清型的病原体，或各种病原体种类的功能活性。在一些实施方式中，测试抗体的广泛中和活性。
iii.体内稀有细胞富集
文提供的方法的一些实施方式可包括体内稀有细胞富集步骤，以允许体内优先刺激和扩增稀有产抗体细胞。在一些实施方式中，体内稀有细胞富集步骤可用于富集抗原特异性浆母细胞或b细胞以鉴定稀有抗体。具体地，可以使用该方法优先刺激产生与靶微生物表面上的保守表位，例如非免疫显性保守表位结合的抗体的稀有细胞，大大增加使用该方法鉴定这种稀有细胞的可能性。
在某些实施方式中，体内稀有细胞富集步骤，例如，稀有b细胞富集阶段涉及产生候选产抗体细胞库，例如b细胞和/或浆母细胞，其针对它们产生针对感兴趣的免疫保护蛋白，例如，靶微生物的含表位片段的抗体的能力高度富集。因为该技术不依赖于传统的杂交瘤或噬菌体展示技术，所以用于富集的候选产抗体细胞(例如b细胞)库可以来自任何来源。例如，在该阶段期间使用的b细胞可以从感染受害者的人类对象，最近从感染中恢复的人类对象，或人源化动物，例如经遗传工程改造以产生人源化抗体的动物(已经用靶抗原，例如靶微生物的含表位片段免疫)中回收。无论来源如何，候选产抗体细胞，例如b细胞，可以在辐射的免疫受损动物(例如scid小鼠)的脾脏内以抗原特异性方式扩增和富集(例如参见图2)。
在某些实施方式中，本发明的方法优先允许扩增那些候选产抗体细胞，例如b细胞，其产生针对靶微生物例如，病原体的免疫保护性靶蛋白，抗原或表位的最高度保守的表位的抗体。因此，该技术能够富集具有最高结合病原体表面上重要、关键或必需表位的潜力的抗体，并且具有最高的病原体中和的可能性。该方面将平台与查询抗体组的更传统技术区分开来，其中大多数抗体对感兴趣的靶抗原不具有特异性或与靶抗原的高度可变的非功能性表位结合。虽然这种传统方法可能是有效的，但它是极其劳动密集和缓慢的，这限制了它在应对新出现的感染性疾病威胁时的实用性。
在所述方法的一些实施方式中，通过包括以下操作的方法获得多个候选产抗体细胞：(i)通过将含有产抗体细胞的细胞组合物导入免疫受损动物中来扩增从已经暴露于靶微生物或靶标微生物的含表位片段或其变体的供者获得的产抗体细胞；并且(ii)回收扩增的产抗体细胞，从而获得多个候选产抗体细胞。
在一些实施方式中，包含产抗体细胞的细胞组合物包含从供者动物，例如用靶微生物感染或免疫的动物的脾和/或淋巴结获得的细胞。在一些实施方式中，从脾和/或淋巴结获得的细胞包括外周血单核细胞(pbmc)，其包含产抗体细胞，例如b细胞或浆母细胞，t细胞和nk细胞，树突细胞和其它免疫细胞。在一些实施方式中，细胞组合物包括t细胞。可将包含产抗体细胞的此类细胞组合物引入免疫缺陷动物，例如严重联合免疫缺陷(scid)小鼠。在一些实施方式中，细胞组合物通过肠胃外引入，例如静脉内引入，例如通过尾静脉注射，或通过移植到免疫受损动物的脾中进行引入。
在一些实施方式中，体内稀有细胞富集还包括在将细胞组合物引入免疫受损动物之前用靶微生物或其特定的含表位片段，抗原或表位或其任何变体刺激来自供者动物的细胞组合物的步骤。在一些实施方式中，使候选产抗体细胞与靶微生物，靶抗原或其表位和/或靶抗原的变体或其表位接触或孵育。在一些实施方式中，使候选产抗体细胞与一种或多种靶微生物和/或变体抗原和/或表位的混合物，例如不同抗原变体的混合物接触。在一些实施方式中，与接触供者动物的靶微生物或其含表位片段的变体相比，使候选产抗体细胞与表达含表位片段的不同变体的靶微生物变体接触。
在一些实施方式中，在将产抗体细胞引入免疫受损动物之前，将其与靶微生物或其含表位片段一起孵育或接触。在一些实施方式中，通过由抗体生产细胞产生的特异性抗体识别靶表位，孵育允许或导致在产抗体细胞与靶微生物或其含表位片段之间形成复合物。在一些实施方式中，该孵育对产生感兴趣抗体的候选细胞提供特定刺激，所述感兴趣抗体例如结合靶微生物或其含表位片段，特别是靶微生物或其含表位片段上的保守表位的抗体。因此，这可以优先刺激感兴趣的稀有产抗体细胞，并导致感兴趣的稀有细胞的扩增和富集。
在一些实施方式中，将产抗体细胞和/或抗原和/或靶微生物导入免疫受损动物的脾脏中或经静脉内导入。
在一些实施方式中，产抗体细胞来自暴露于靶微生物的第一变体或其含表位片段的供者，并且在将含有产抗体细胞的细胞组合物引入免疫受损动物之前，该方法包括将产抗体细胞与靶微生物的第二变体或其含表位片段混合或孵育，其中导入的细胞组合物包括与靶微生物的第二变体或其含表位片段复合的产抗体细胞。
在一些实施方式中，第一和第二变体各自独立地包括靶微生物的含表位片段。在一些实施方式中，第一和第二变体共享至少一个保守区域或结构域。在一些实施方式中，第一和第二变体各自包含彼此不同的至少一个区域或结构域，例如可变或高变的结构域或区域。
在一些实施方式中，第一和第二变体包括衍生自相同微生物的两种不同临床分离物的om蛋白或其片段。在一些实施方式中，第一或第二变体可以由现有变体(例如临床分离物)进一步修饰。例如，在一些实施方式中，第一变体和/或第二变体是全长om蛋白，第一和/或第二变体中的另一个是om蛋白的片段，其包括om蛋白的免疫显性表位或环之缺失。
在一些实施方式中，已经例如通过免疫或感染而与供者动物相接触的靶微生物或其含表位片段的变体与在导入免疫受损动物之前用于刺激的靶微生物或其含表位片段的变体不同。例如，在一些实施方式中，用来自靶微生物的含表位片段的一种变体(例如，bama变体1(在seqidno：1中列出))免疫供者动物，并且从供者动物获得的细胞组合物在导入免疫受损动物用于体内富集之前与来自靶微生物的含表位片段的不同变体，例如bama变体2(如seqidno：2所示)接触。在一些实施方式中，供者动物已经用表达含表位片段的一种变体(例如，bama变体1(在seqidno：1中列出))的靶微生物感染，并且从供者动物获得的细胞组合物在导入免疫受损动物用于体内富集之前与来自靶微生物的含表位片段的不同变体，例如bama变体2(如seqidno：2所示)接触。在一些实施方式中，bama变体3(在seqidno：5中列出)和/或bama变体4(在seqidno：6中列出)可以在任一步骤中使用。在一些实施方式中，bama的任何已知变体或临床分离物可用于免疫和/或体内富集。
在一些实施方式中，任何一种或多种其它变体，来自靶微生物的其它变体(例如，不同的临床分离物或不同的血清型)的相应的表位结合性片段的任何其它变体，或来自相关但不同的微生物的相应的表位结合性片段，可以在体内富集之前，以任何顺序和/或以任何组合用于接触供者动物和刺激产抗体细胞。例如，在一些实施方式中，含变体表位的片段包含具有seqidno：1，2，5，6或31中所示的氨基酸序列或其片段、区域或结构域的bama变体。在一些实施方式中，包含变体表位的片段包含与seqidno：1，2，5，6或31中所示氨基酸序列或片段，区域或结构域包含至少90％序列同一性，例如至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
利用含表位片段的不同变体进行供者暴露和体内富集，允许特异性刺激产生靶向由所用不同变体共有的表位的抗体的细胞。因此，这可以导致鉴定靶向保守表位的抗体，所述保守表位可以有效对抗广泛的靶微生物变体，例如不同血清型的靶微生物或靶微生物物种。
在一些实施方式中，含表位片段经生成并制备用于在体内稀有细胞富集步骤中与候选产抗体细胞接触和/或孵育。在一些实施方式中，使用一种或多种去污剂或表面活性剂来制备含表位片段，用于蛋白质的溶解和/或再折叠。具体地，对于膜蛋白，可能需要溶解和/或再折叠步骤。在一些实施方式中，可以使用制剂中的去污剂或表面活性剂使含表位片段溶解，变性和/或再折叠。在一些实施方式中，溶解的和/或变性的制剂可以例如在去污剂或表面活性剂的存在下再折叠或变性。在一些实施方式中，去污剂或表面活性剂选自月桂基二甲基氧化胺(ldao)，2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)，两亲高分子，两亲高分子a8-35，c8e4，曲通x-100，辛基葡糖苷，dm(正癸基-β-d-吡喃麦芽糖苷)，ddm(正十二烷基-β-d-吡喃麦芽糖苷，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(chaps)和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(chapso)。
在一些实施方式中，制剂经历去污剂交换，用两亲性聚合物或表面活性剂(例如两亲高分子，例如两亲高分子a8-35)代替制剂中的一些或全部去污剂和/或表面活性剂。在一些实施方式中，在含表位片段的制剂与产抗体细胞混合之前，从含表位片段的制剂中除去或减少过量的去污剂或表面活性剂至对产抗体细胞无毒和/或不诱导产抗体细胞裂解的水平或量。在一些实施方式中，使用凝胶过滤柱去除去污剂。
在一些实施方式中，所述方法可包括从免疫受损动物的脾中分离候选产抗体细胞，例如b细胞和/或浆母细胞，从而获得富含浆母细胞的浆母细胞群，所述浆母细胞对所述微生物中含表位片段具有特异性。在一些实施方式中，可以使用本文提供的任何方法对这些候选细胞进行包封和鉴定。
iv.抗体
提供了结合靶微生物的含表位片段(例如抗原或表位)的抗体。在一些实施方式中，提供了结合细菌外膜(om)蛋白的抗体。在一些实施方式中，提供了结合鲍氏不动杆菌bama的抗体。在一些实施方式中，提供的抗体结合靶微生物中的表位。在一些实施方式中，提供了与靶微生物或其含表位片段的至少一个保守区(即在微生物或其含表位片段(例如，抗原或表位)的不同变体间保守的区域)中存在的表位结合的抗体。在一些实施方式中，抗体是使用本文提供的方法鉴定的抗体。
在一些实施方式中，提供了与存在于革兰氏阴性细菌的om蛋白的至少一个保守区中的表位结合的抗体。提供了抗体或其抗原结合片段，其结合存在于革兰氏阴性细菌的至少一个保守区域或结构域中的表位。在一些实施方式中，提供了与存在于不动杆菌物种中bama的至少一个保守区中的表位结合的抗体。在一些实施方式中，提供了与至少一个保守区中存在的表位，例如，在鲍氏不动杆菌bama的一种或多种变体或分离物中保守的一个或多个保守氨基酸结合的抗体。在一些实施方式中，提供了与来自鲍氏不动杆菌atcc19606和鲍氏不动杆菌atcc17978的bama间保守的区域结合的抗体。在一些实施方式中，抗体结合来自鲍氏不动杆菌菌株1440422，鲍氏不动杆菌菌株msp4-16和/或鲍氏不动杆菌菌株1202252的bama间保守的区域。
在一些实施方式中，表位是或包含连续的氨基酸序列。在一些实施方式中，表位是或包含非连续的氨基酸序列。在各种鲍氏不动杆菌中保守的示例性区域可包括seqidno：11中列出的鲍氏不动杆菌atcc19606bama序列的氨基酸残基423-438，440-460，462-502，504-533，537-544，547-555，557-561，599-604，606-644，646-652，659-700，702-707，718-723，735-747，749-760，784-794，798-804，806-815和817-841。在一些实施方式中，在各种鲍氏不动杆菌中保守的保守区域包括seqidno：12-30中所示的任何一种或多种氨基酸序列或其任何片段。在一些实施方式中，提供的抗体结合部分或完全包含保守区域内的表位。
所述抗体包括分离的抗体。在一些实施方式中，所述提供的抗体是人抗体。在一些实施方式中，提供的抗体是人源化抗体，例如其中所有或基本上所有互补决定区(cdr)氨基酸残基衍生自非人cdr且全部或基本上所有框架区(fr)氨基酸残基衍生自人fr的抗体。在一些实施方式中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体由人源化动物，例如经基因工程改造以产生人源化抗体的动物的细胞产生。在一些实施方式中，抗体由来自转基因小鼠或转基因鸡的细胞产生，其经工程改造以产生人源化或部分人源化抗体，例如trianni转基因小鼠和转基因鸡(例如来自晶体生物科学公司的humab鸡)。
在一些实施方式中，所提供的抗体能够以至少一定的亲和性结合靶微生物的含表位片段，如通过许多已知方法中的任一种所测量的。在一些实施方式中，亲和性由平衡解离常数(kd)表示。在一些实施方式中，所提供的抗体与靶微生物的含表位片段或其中的表位以等于或大于105m-1的亲和性或ka(即，以1/m为单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数；等于该结合反应的结合速率[kon或ka]与解离速率[koff或kd]的比率，假设双分子相互作用)结合，例如特异性结合。在一些实施方式中，所提供的抗体与靶微生物的含表位片段或其中的表位以等于或小于10-5m的kd(即，以m为单位的特定结合相互作用的平衡解离常数；等于该结合反应的解离速率[koff或kd]与结合速率[kon或ka]的比率，假设双分子相互作用)结合，例如特异性结合。例如，平衡解离常数kd的范围为10-5m至10-13m，例如10-7m至10-11m，10-8m至10-10m，或10-9m至10-10m。在某些实施方式中，抗体与靶细胞的含表位片段的kd等于或小于约400nm，300nm，200nm，100nm，50nm，40nm，30nm，25nm，20nm，19nm，18nm，17nm，16nm，15nm，14nm，13nm，12nm，11nm，10nm，9nm，8nm，7nm，6nm，5nm，4nm，3nm，2nm或1nm或更低。
在一些实施方式中，所述提供的抗体是重组产生的。在一些实施方式中，将含有编码鉴定的抗体或其片段的核酸序列的多核苷酸引入细胞中。在一些实施方式中，抗体在哺乳动物细胞或细胞中产生，用于重组表达，例如，进入细菌细胞或酵母细胞。在一些实施方式中，多核苷酸包括与编码另一部分的多核苷酸操作性连接的序列，例如亲和标签，可检测标记物，蛋白酶切割序列和/或柔性接头。在一些实施方式中，多核苷酸编码所提供的抗体或其片段和另一部分，例如亲和标签，可检测标记物和/或蛋白酶切割序列的融合蛋白。在一些实施方式中，可检测标记物是荧光蛋白，发光蛋白，色蛋白或酶。
在一些实施方式中，提供的抗体是功能性抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体包括单结构域抗体，其包含重链(vh)可变区，它在不与轻链抗原结合位点(例如，轻链可变(vl)区)配对和/或不具有任何其它抗体结构域或结合位点的情况下能够特异性结合至靶微生物的含表位片段或其中的表位。抗体之中也包括多结构域抗体，如含有vh结构域和vl结构域的抗体，其包含单结构域抗体的vh结构域或其抗原结合位点。在一些实施方式中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，例如scfv。抗体包括特异性结合靶微生物的含表位片段或其中表位的抗体。
在某些实施方式中，所述抗体经改变以增加或减少该抗体糖基化的程度，例如，通过移除或插入一个或多个糖基化位点，这通过改变氨基酸序列和/或通过修饰连接至糖基化位点的寡糖(例如，采用某些细胞系)来进行。在一些实施方式中，去除或插入n-连接糖基化，其是在共有序列-asn-xaa-ser/thr中的天冬酰胺处出现的糖基化位点。
例如，在一些实施方式中，所提供的抗体包括fc区中具有一个或多个氨基酸修饰的那些，例如，具有在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人fc区序列或恒定区的其它部分(例如，人igg1、igg2、igg3或igg4fc区)的那些。可进行所述修饰，例如，以改善半衰期，改变与一种或多种类型的fc受体的结合，和/或改变效应物功能。其它修饰包括半胱氨酸工程，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基取代，以在可及位点产生反应性的巯基基团，例如，用于与试剂和接头-试剂偶联，以产生免疫偶联物。经半胱氨酸工程改造的抗体描述于，例如，美国专利号7,855,275和7,521,541。
在一些实施方式中，修饰抗体(例如，抗原结合片段)以包含额外的非蛋白质部分，包括水溶性聚合物，例如聚乙二醇(peg)。所述聚合物可具有任何分子量，并且可以是支化或非支化的。与抗体连接的聚合物的数量可以变化，并且可以连接一种或多种不同的聚合物。
v.示例性实施方式
下文进一步详述了本发明的这些和其它方面的说明性实施方式。然而，本发明并不限定于这些具体实施方式。
1.一种鉴定结合靶微生物的抗体的方法，包括：
(a)获得多个候选产抗体细胞；
(b)将所述多个候选产抗体细胞与靶微生物包封在凝胶微滴中；和
(c)确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生结合靶微生物的抗体，从而鉴定特异性结合靶微生物的抗体。
2.如实施方式1所述的方法，其中：
步骤(b)进一步包括在微滴中包封靶微生物的含表位片段或其变体；和
步骤(c)包括确定被鉴定为结合靶微生物的抗体是否也在同一凝胶微滴中结合其含表位片段。
3.一种鉴定结合靶微生物的抗体的方法，包括：
(a)获得多个候选产抗体细胞；
(b)将所述多个候选产抗体细胞与靶微生物和所述靶微生物的含表位片段或其变体包封在凝胶微滴中；和
(c)确定凝胶微滴中的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段相结合的抗体，从而鉴定特异性结合靶微生物或其含表位片段的抗体。
4.如实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述含表位片段与固体支持物结合。
5.如实施方式4所述的方法，其中所述固体支持物是珠。
6.如实施方式1-5中任一项所述的方法，其中靶微生物是细菌，真菌，寄生虫或病毒。
7.如实施方式6所述的方法，其中靶微生物是细菌或真菌。
8.如实施方式6或实施方式7所述的方法，其中所述微生物是多重耐药性微生物。
9.如实施方式6-8中任一项所述的方法，其中所述微生物是细菌，其为革兰氏阴性细菌。
10.如实施方式9所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌是变形菌。
11.如实施方式6-10中任一项所述的方法，其中所述微生物是选自下组的细菌：不动杆菌，蛭弧菌，伯克霍尔德氏菌，衣原体，肠杆菌，埃希氏菌，弗朗西斯菌，嗜血杆菌，螺杆菌，克雷伯氏菌，军团菌，莫拉氏菌，奈瑟菌，泛菌，假单胞菌，沙门氏菌，志贺氏菌，寡养单胞菌，弧菌和耶尔森氏菌。
12.如实施方式6-11中任一项所述的方法，其中所述微生物选自：蜂属不动杆菌(acinetobacterapis)，鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)，百利不动杆菌(acinetobacterbaylyi)，贝杰不动杆菌(acinetobacterbeijerinckii)，贝齐不动杆菌(acinetobacterbereziniae)，布赫不动杆菌(acinetobacterbohemicus)，波希不动杆菌(acinetobacterboissieri)，布菲不动杆菌(acinetobacterbouvetii)，布瑞不动杆菌(acinetobacterbrisouii)，乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)，简德不动杆菌(acinetobactergandensis)，简瑞不动杆菌(acinetobactergerneri)，广东不动杆菌(acinetobacterguangdongensis)，瑰丽不动杆菌(acinetobacterguillouiae)，吉伦伯不动杆菌(acinetobactergyllenbergii)，溶血不动杆菌(acinetobacterhaemolyticus)，哈尔滨不动杆菌(acinetobacterharbinensis)，印度不动杆菌(acinetobacterindicus)，约氏不动杆菌(acinetobacterjohnsonii)，琼氏不动杆菌(acinetobacterjunii)，库奇不动杆菌(acinetobacterkookii)，鲁氏不动杆菌(acinetobacterlwoffii)，拿氏不动杆菌(acinetobacternectaris)，诺氏不动杆菌(acinetobacternosocomialis)，巴基斯坦不动杆菌(acinetobacterpakistanensis)，帕尔乌斯不动杆菌(acinetobacterparvus)，彼特不动杆菌(acinetobacterpitii)，皮特不动杆菌(acinetobacterpittii)，濮阳不动杆菌(acinetobacterpuyangensis)，清风不动杆菌(acinetobacterqingfengensis)，抗辐不动杆菌(acinetobacterradioresistans)，抗辐射不动杆菌(acinetobacterradioresistens)，鲁迪斯不动(acinetobacterrudis)，辛德勒不动杆菌(acinetobacterschindleri)，塞氏不动杆菌(acinetobacterseifertii)，索利不动杆菌(acinetobactersoli)，坦氏不动杆菌(acinetobactertandoii)，提氏不动杆菌(acinetobactertjernbergiae)，塔氏不动杆菌(acinetobactertowneri)，乌氏不动杆菌(acinetobacterursingii)，可变不动杆菌(acinetobactervariabilis)，温氏不动杆菌(acinetobactervenetianus)，大肠杆菌(escherichiacoli)，流感嗜血菌(haemophilusinfluenzae)，肺炎克雷伯氏菌(kilbsiellapneumoniae)，绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，鲍氏志贺氏菌(shigellaboydii)，痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae)，弗氏志贺氏菌(shigellaflexneri)，索氏志贺氏菌(shigellasonnei)，霍乱弧菌(vibriocholera)和鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)。
13.如实施方式12所述的方法，其中所述微生物是鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)。
14.如实施方式6-8中任一项所述的方法，其中所述微生物是细菌，其为革兰氏阳性细菌。
15.如实施方式14所述的方法，其中所述微生物选自葡萄球菌和链球菌物种。
16.如实施方式6-8中任一项所述的方法，其中所述微生物是真菌，其是曲霉物种或念珠菌物种。
17.如实施方式6或实施方式8所述的方法，其中所述微生物是寄生虫，其是球虫或疟原虫物种。
18.如实施方式1-17中任一项所述的方法，其中所述多个候选产抗体细胞获自已经暴露于靶微生物或靶微生物的含表位片段或其变体的供者。
19.如实施方式1-18中任一项所述的方法，其中通过包括以下操作的方法获得所述多个候选产抗体细胞：
(i)通过将含有产抗体细胞的细胞组合物导入免疫受损动物中来扩增从已经暴露于靶微生物或靶标微生物的含表位片段或其变体的供者获得的产抗体细胞；并且
(ii)回收扩增的产抗体细胞，从而获得多个候选产抗体细胞。
20.如实施方式19所述的方法，其中含有产抗体细胞的细胞组合物包括从供者的脾和/或淋巴结获得的细胞。
21.如实施方式19或实施方式20所述的方法，其中所述细胞组合物包含t细胞。
22.如实施方式19-21中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物包含外周血单核细胞(pbmc)，其包含产抗体细胞。
23.如实施方式19-22中任一项所述的方法，其中免疫受损动物是scid小鼠。
24.如实施方式19-23中任一项所述的方法，其中将含有产抗体细胞的细胞组合物经静脉内或通过移植到免疫受损动物的脾中而被导入免疫受损动物。
25.如实施方式19-24中任一项所述的方法，其中：
所述产抗体细胞来自暴露于靶微生物的第一变体或其含表位片段的供者，并且
在将含有产抗体细胞的细胞组合物导入免疫受损动物之前，该方法包括将产抗体细胞与靶微生物的第二变体或其含表位片段混合或孵育，其中导入的细胞组合物包括与靶微生物的第二变体或其含表位片段复合的产抗体细胞。
26.如实施方式1-25中任一项所述的方法，其中所述含表位片段包含靶微生物的必需蛋白质或必需蛋白质的片段。
27.如实施方式1-26中任一项所述的方法，其中所述含表位片段包括源自所述靶微生物的细菌外膜(om)蛋白，膜蛋白，包膜蛋白，细胞壁蛋白，细胞壁组分，表面脂质，糖脂，脂多糖，糖蛋白，表面多糖，荚膜，表面附属物，鞭毛，纤毛或菌毛，单分子表面层，或s-层或其片段。
28.如实施方式1-27中任一项所述的方法，其中所述含表位片段包含来自靶微生物表面的脂质。
29.如实施方式28所述的方法，其中所述含表位片段包括脂多糖(lps)或脂蛋白。
30.如实施方式1-27中任一项所述的方法，其中所述含表位片段包含外膜(om)蛋白。
31.如实施方式30所述的方法，其中所述om蛋白选自bama，lptd，adec，adek，btub，fadl，feca，fepa，fhac，fhua，lamb，mepc，mexa，nalp，nmpc，nspa，nupa，omp117，omp121，omp200，omp71，ompa，ompc，ompf，ompg，ompt，ompw，opca，opra，oprb，oprf，oprj，oprm，oprn，osta，pagl，pagp，phoe，plda，pora，porb，pord，porp，smec，smef，srpc，sucy，tolc，ttgc和ttgf。
32.如实施方式31所述的方法，其中所述om蛋白是bama或lptd。
33.如实施方式25-27和30-32中任一项所述的方法，其中通过溶解om蛋白或其片段来制备所述含表位片段。
34.如实施方式33所述的方法，其中通过添加一种或多种去污剂或表面活性剂进行溶解。
35.如实施方式33或实施方式34所述的方法，还包括在与产抗体细胞混合或孵育之前再折叠含表位片段。
36.如实施方式35所述的方法，其中再折叠在一种或多种去污剂或表面活性剂的存在下进行。
37.如实施方式34-36中任一项所述的方法，其中所述去污剂或表面活性剂选自月桂基二甲基氧化胺(ldao)，2-甲基-2,4-戊二醇(mpd)，两亲高分子，两亲高分子a8-35，c8e4，曲通x-100，辛基葡糖苷，dm(正癸基-β-d-吡喃麦芽糖苷)，ddm(正十二烷基-β-d-吡喃麦芽糖苷，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(chaps)和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(chapso)。
38.如实施方式34-37中任一项所述的方法，还包括用两亲性聚合物或表面活性剂替代制备中的一些或全部去污剂和/或表面活性剂。
39.如实施方式34-38中任一项所述的方法，其中在与产抗体细胞混合或孵育之前，从含表位片段的制备中除去或减少过量的去污剂或表面活性剂至对产抗体细胞无毒和/或不诱导产抗体细胞裂解的水平或量。
40.如实施方式25-39中任一项的方法，其中第一和第二变体各自独立地包括靶微生物的含表位片段。
41.如实施方式25-40中任一项所述的方法，其中第一和第二变体共享至少一个保守区域或结构域。
42.如实施方式41所述的方法，其中第一和第二变体各自包含彼此不同的至少一个区域或结构域。
43.如实施方式25-42中任一项所述的方法，其中第一和第二变体包括衍生自相同微生物的两种不同临床分离物的om蛋白或其片段。
44.如实施方式25-43中任一项所述的方法，其中第一变体和/或第二变体是全长om蛋白，且第一和/或第二变体中的另一个是om蛋白的片段，其包括om蛋白的免疫显性表位或环之缺失。
45.如实施方式41-44中任一项所述的方法，其中鉴定的抗体结合靶微生物的至少一个保守区域或结构域。
46.如实施方式18-45中任一项所述的方法，其中所述供者已经用靶微生物或靶微生物的含表位片段或其变体免疫或被其感染。
47.如实施方式18-46中任一项所述的方法，其中所述供者是免疫的动物或感染的动物。
48.如实施方式18-47中任一项所述的方法，其中所述供者是哺乳动物或鸟。
49.如实施方式18-48中任一项所述的方法，其中供者是人，小鼠或鸡。
50.如实施方式18-49中任一项的方法，其中供者是被微生物感染的人供者。
51.如实施方式18-50中任一项所述的方法，其中所述供者是遗传修饰的非人动物，其产生部分人或完全人抗体。
52.如实施方式1-51中任一项所述的方法，其中产抗体细胞包含外周血单核细胞(pbmc)，b细胞，浆母细胞或浆细胞。
53.如实施方式1-52中任一项所述的方法，其中产抗体细胞包含b细胞，浆母细胞或浆细胞。
54.如实施方式18-53中任一项所述的方法，其中通过正选择或负选择从供者中选择多个候选产抗体细胞以分离或富集b细胞。
55.如实施方式54所述的方法，其中b细胞是浆母细胞或浆细胞。
56.如实施方式55所述的方法，其中所述选择是基于选自以下一种或多种的细胞表面标志物的表达的正选择：cd2，cd3，cd4，cd14，cd15，cd16，cd34，cd56，cd61，cd138，cd235a(血型糖蛋白a))和fceria。
57.如实施方式52-56中任一项所述的方法，其中，所述产抗体细胞包含cd138+细胞。
58.如实施方式52-57中任一项所述的方法，其中至少或至少约50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％或更多的细胞是浆细胞或浆母细胞和/或是cd138+细胞。
59.如实施方式1-58中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗体或其抗原结合片段。
60.如实施方式1-59中任一项所述的方法，其中通过基于微流体的方法产生凝胶微滴。
61.如实施方式1-60中任一项所述的方法，其中所述凝胶微滴包括选自以下的材料：琼脂糖，角叉菜胶，藻酸盐，藻酸盐-聚赖氨酸，胶原，纤维素，甲基纤维素，明胶，壳聚糖，细胞外基质，葡聚糖，淀粉，菊粉，肝素，透明质酸，纤维蛋白，聚乙烯醇，聚(n-乙烯基-2-吡咯烷酮)，聚乙二醇，聚(甲基丙烯酸羟乙酯)，丙烯酸酯聚合物和聚丙烯酸钠，聚二甲基硅氧烷，顺式聚异戊二烯，puramatrixtm，聚二乙烯基苯，聚氨酯或聚丙烯酰胺或其组合。
62.如实施方式61所述的方法，其中凝胶微滴包含琼脂糖。
63.如实施方式62所述的方法，其中琼脂糖是低胶凝温度的琼脂糖。
64.如实施方式62或实施方式63所述的方法，其中琼脂糖的胶凝温度低于约35℃，约30℃，约25℃，约20℃，约15℃，约10℃或约5℃。
65.如实施方式62或实施方式63所述的方法，其中琼脂糖的胶凝温度为约5℃至约30℃，约5℃至约20℃，约5℃至约15℃，约8℃至约17℃或约5℃至约10℃。
66.如实施方式1-65中任一项所述的方法，其中步骤(b)还包括在包封后将凝胶微滴在约0℃至约5℃的温度下孵育约1分钟至约10分钟。
67.如实施方式5-66中任一项所述的方法，其中所述珠的平均直径为约100nm至约100μm，或约3μm至约5μm。
68.如实施方式1-67中任一项所述的方法，其中候选产抗体细胞与凝胶微滴的平均比率小于1或小于约1。
69.如实施方式1-68中任一项所述的方法，其中候选产抗体细胞与凝胶微滴的平均比率为约0.05至约1.0，约0.05至约0.5，约0.05至约0.25，约0.05至约0.1，约0.1至约1.0，约0.1至约0.5，约0.1至约0.25，约0.25至约1.0，约0.25至约0.5或0.5至约1.0，各自包括端值。
70.如实施方式69所述的方法，其中候选产抗体细胞与微滴的平均比率为0.1或约0.1。
71.如实施方式1-70中任一项所述的方法，其中微生物与凝胶微滴的平均比率为约50至约150或约50至约100。
72.如实施方式5-71中任一项所述的方法，其中珠与凝胶微滴的平均比率为约2至约10或约3至约5。
73.如实施方式5-72中任一项所述的方法，其中候选细胞与微生物与珠的平均比率为约0.1:100:10。
74.如实施方式1-73中任一项所述的方法，其中凝胶微滴包含生长培养基并被非水性环境包围。
75.如实施方式74所述的方法，其中所述非水性环境包含油。
76.如实施方式75所述的方法，其中油是气体透过性的。
77.如实施方式1-76中任一项所述的方法，进一步包括在步骤(c)之前在37℃或约37℃的温度下孵育凝胶微滴。
78.如实施方式77所述的方法，其中凝胶微滴在生长培养基中孵育。
79.如实施方式1-78中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之前，将结合抗体的试剂引入凝胶微滴中，所述试剂包括可检测部分。
80.如实施方式79所述的方法，其中所述试剂包含对由包封的产抗体细胞产生的抗体具有特异性的二抗。
81.如实施方式79或实施方式80所述的方法，其中确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与靶微生物，例如存在于相同凝胶微滴中的病原体和/或其含表位片段相结合的抗体包括检测复合物的存在，该复合物包含：(i)靶微生物或其含表位片段；(ii)产抗体细胞产生的抗体；和(iii)包含结合的可检测部分的试剂，其中该复合物的存在表明抗体特异性结合靶微生物或其含表位片段。
82.如实施方式1-78中任一项所述的方法，其中确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段相结合的抗体包括确定抗体的存在是否修饰相同凝胶微滴中靶微生物的表型特征，其中经修饰的表型特征的存在表明抗体特异性结合靶微生物或其含表位片段。
83.如实施方式82所述的方法，其中经修饰的表型特征选自细胞生长，细胞死亡，结合，转录，翻译，表达，蛋白质转运，细胞或膜结构，粘附，运动，细胞应激，细胞分裂，细胞活力和/或行为的改变。
84.如实施方式82或实施方式83所述的方法，其中确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段相结合的抗体包括检测由报告分子产生的信号，其中该信号在存在经修饰的表型特征的情况下产生。
85.如实施方式84所述的方法，其中所述微生物包含编码报告分子的多核苷酸。
86.如实施方式85所述的方法，其中所述多核苷酸包括与编码报告分子的序列操作性连接的调节区，其中调节区对经修饰的表型特征具有响应性。
87.如实施方式86所述的方法，其中所述调节区包含启动子。
88.如实施方式82-87中任一项所述的方法，其中修饰的表型特征包括细胞应激，并且所述信号在细胞应激的存在下产生。
89.如实施方式83-88中任一项所述的方法，其中细胞应激包括对细菌的外膜(om)的应激。
90.如实施方式84-89中任一项所述的方法，其中用可检测部分检测由报告分子产生的信号。
91.如实施方式84-90中任一项所述的方法，其中由报告分子产生的信号包括荧光信号，发光信号，色度信号，化学发光信号或放射性信号。
92.如实施方式84-91中任一项的方法，其中所述报告分子是荧光蛋白，发光蛋白，色蛋白或酶。
93.如实施方式1-78中任一项所述的方法，其中确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶微生物和/或其含表位片段相结合的抗体包括确定抗体的存在是否杀伤相同凝胶微滴中的靶微生物，其中对于靶微生物的杀伤表明抗体特异性结合靶微生物或其含表位片段。
94.如实施方式93所述的方法，其中凝胶微滴包含指示细胞死亡的可检测部分。
95.如实施方式79-81、90-92和94中任一项所述的方法，其中所述可检测部分包括一种或多种可检测标记物，其选自发色团部分，荧光部分，磷光部分，发光部分，光吸收部分，放射性部分和过渡金属同位素质量标签部分。
96.如实施方式1-95中任一项所述的方法，还包括：
(d)分离包含产生鉴定的抗体的细胞的微滴，或分离编码被鉴定为特异性结合靶微生物或其含表位片段的抗体的多核苷酸。
97.如实施方式96所述的方法，其中使用显微操纵器或自动分选器进行分离。
98.如实施方式1-97中任一项所述的方法，还包括：
(e)确定编码鉴定的抗体的核酸的序列。
99.如实施方式98所述的方法，其中利用核酸扩增和/或测序来确定核酸的序列。
100.如实施方式98或实施方式99所述的方法，其中利用单细胞pcr和/或核酸测序来确定核酸的序列。
101.如实施方式98-100中任一项所述的方法，还包括：
(f)将含有编码鉴定的抗体或其片段的核酸的序列的多核苷酸导入细胞中。
102.如实施方式1-101中任一项所述的方法，其中所述方法在步骤(a)完成后的约60天，50天，40天，30天，20天，19天，18天，17天，16天，15天，14天，13天，12天，11天，10天，9天，8天，7天，6天，5天，4天，3天，2天或1天内完成。
103.如实施方式102所述的方法，其中所述方法在步骤(a)完成后的约30天，20天，19天，18天，17天，16天，15天，14天，13天，12天，11天，10天，9天，8天，7天，6天，5天，4天，3天，2天或1天内完成。
104.通过实施方式1-103中任一项所述的方法鉴定的抗体或其抗原结合片段。
105.如实施方式104所述的抗体或其抗原结合片段，其与存在于革兰氏阴性细菌的bama(β-桶组装机器)的至少一个保守区域或结构域中的表位相结合。
106.一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与存在于革兰氏阴性细菌的bama(β-桶组装机器)的至少一个保守区域或结构域中的表位相结合。
107.如实施方式105或实施方式106所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述革兰氏阴性细菌是不动杆菌物种。
108.如实施方式105-107中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述革兰氏阴性细菌是鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaummannii)。
109.如实施方式105-108中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中保守区域或结构域是来自鲍氏不动杆菌atcc19606和鲍氏不动杆菌atcc17978的bama之间共有的保守区域或结构域。
110.如实施方式109所述的抗体或其抗原结合片段，其中保守区域或结构域包括seqidno：11中所示的鲍氏不动杆菌bama序列氨基酸残基423-438，440-460，462-502，504-533，537-544，547-555，557-561，599-604，606-644，646-652，659-700，702-707，718-723，735-747，749-760，784-794，798-804，806-815和817-841。
111.如实施方式110所述的抗体或其抗原结合片段，其中保守区或结构域包含seqidno：12-20中所示的序列。
112.如实施方式105-111中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中表位是保守区域或结构域的连续或非连续序列。
113.如实施方式104-112中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人抗体或抗原结合片段。
114.如实施方式104-112中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体。
115.如实施方式114所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段由产抗体细胞产生，所述产抗体细胞来自经工程改造以产生人源化抗体的转基因动物。
116.如实施方式104-115中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是重组的。
117.如实施方式104-116中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单克隆的。
118.如实施方式104-117中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是抗原结合片段。
119.如实施方式104-118中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段还包含亲和标签，可检测蛋白，蛋白酶切割序列，接头或非蛋白质部分。
120.如实施方式104-11911中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：
所述抗体或抗原结合片段对鲍氏不动杆菌bama的平衡解离常数(kd)是或小于或小于约400nm，300nm，200nm，100nm，50nm，40nm，30nm，25nm，20nm，19nm，18nm，17nm，16nm，15nm，14nm，13nm，12nm，11nm，10nm，9nm，8nm，7nm，6nm，5nm，4nm，3nm，2nm或1nm。
121.编码如实施方式104-120中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
122.一种包含如实施方式104-120中任一项所述的抗体的组合物。
123.如实施方式122所述的组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
124.一种包含多个微滴的组合物，每个微滴包含：
候选产抗体细胞；和
靶微生物。
125.如实施方式124所述的组合物，其中每个微滴还含有与固体支持物结合的靶微生物或其含表位片段或其变体。
126.如实施方式124或实施方式125所述的组合物，其中靶微生物包含编码报告分子的多核苷酸。
127.微滴文库，每个微滴包括：
候选产抗体细胞；和
靶微生物。
128.如实施方式127所述的文库，每个微滴还含有与固体支持物结合的靶微生物或其含表位片段或其变体。
129.如实施方式127或实施方式128所述的文库，其中靶微生物包含编码报告分子的多核苷酸。
130.一种鉴定特异性结合靶病原体或其含表位片段的抗体的方法，包括：
(a)通过将产抗体细胞导入免疫受损动物中来扩增从用靶病原体或其含表位片段感染或免疫的动物获得的产抗体细胞；
(b)按步骤(a)获自免疫受损动物的产抗体细胞与靶病原体和/或其含表位片段一起包封在凝胶微滴中，其中多个凝胶微滴仅包含一个产抗体细胞；并且
(c)确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与同一凝胶微滴中存在的靶病原体和/或其含表位片段结合的抗体，从而鉴定出与靶病原体或其含表位片段特异性结合的抗体。
131.如实施方式130所述的方法，进一步包括分离编码被鉴定为特异性结合靶病原体或其含表位片段的抗体的多核苷酸。
132.如实施方式130或实施方式131所述的方法，其中用靶病原体或其含表位片段感染或免疫的动物是被该病原体感染的人供者。
133.如实施方式130或实施方式131所述的方法，其中用靶病原体或其含表位片段感染或免疫的动物是经遗传修饰的非人动物，其产生部分人或完全人抗体。
134.如实施方式130-133中任一项所述的方法，其中，所述病原体是微生物。
135.如实施方式134所述的方法，其中微生物是细菌或真菌。
136.如实施方式130-135中任一项所述的方法，其中免疫受损动物是scid小鼠。
137.如实施方式130-136中任一项所述的方法，其中将包含产抗体细胞的pbmc导入免疫受损动物中。
138.如实施方式130-137中任一项所述的方法，其中将产抗体细胞经静脉内或通过移植到免疫受损动物的脾中导入免疫受损动物中。
139.如实施方式130-138中任一项所述的方法，其中凝胶微滴包含结合抗体的可检测部分。
140.如实施方式139所述的方法，其中所述可检测部分是对由包封的产抗体细胞产生的抗体具有特异性的带标记的二抗。
141.如实施方式139或实施方式140所述的方法，其中确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与靶微生物，例如存在于相同凝胶微滴中的靶病原体和/或其含表位片段相结合的抗体包括检测复合物的存在，该复合物包含：(i)靶病原体，或其含表位片段；产抗体细胞产生的抗体；和(iii)可检测部分，其中该复合物的存在表明抗体特异性结合靶病原体或其含表位片段。
142.如实施方式130-138中任一项所述的方法，其中确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶病原体和/或其含表位片段相结合的抗体包括确定抗体的存在是否修饰相同凝胶微滴中靶病原体的表型特征，其中经修饰的表型特征的存在表明抗体特异性结合靶病原体或其含表位片段。
143.如实施方式142所述的方法，其中经修饰的表型特征是细胞生长或细胞死亡。
144.如实施方式130-138中任一项所述的方法，其中确定凝胶微滴内的产抗体细胞是否产生与存在于相同凝胶微滴中的靶病原体和/或其含表位片段相结合的抗体包括确定抗体的存在是否杀伤相同凝胶微滴中的靶病原体，其中对于靶病原体的杀伤表明抗体特异性结合靶病原体或其含表位片段。
145.如实施方式144所述的方法，其中凝胶微滴包含指示细胞死亡的可检测部分。
vi.实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。
实施例1：凝胶包封和筛选的示例性方法
该实施例描述了根据所提供的方法的凝胶包封和筛选的说明性方法。
将活的哺乳动物产抗体细胞(在这种情况下，使用杂交瘤细胞，也可以使用浆细胞)与表达感兴趣抗原bama的细菌细胞和偶联有bama，一种感兴趣的示例性蛋白质(抗原)的珠一起包封在琼脂糖颗粒(直径约100μm)中。杂交瘤细胞是分泌已知与活细菌细胞表面上的bama结合的抗体或对照抗体的细胞，以测试包封筛选能否用于快速区分产生与感兴趣抗原结合的抗体的细胞和其它细胞。
为了产生琼脂糖颗粒，将琼脂糖(储存在4℃)在水浴中加热至70℃，然后冷却至37℃。在300μl体积(在培养基中)制备含有b细胞，感兴趣细菌病原体和与示例性bama蛋白偶联的珠的样品，并温热至37℃持续5分钟。向样品中加入约300μl的4％琼脂糖并充分混合。缓慢地，在37℃下将600μl分散相加入到16ml200厘斯托克(cst)的二甲基聚硅氧烷(dmps)油中，然后快速搅拌2分钟。将其转移至冰浴中并缓慢搅拌5分钟以固化，向其上倒入约15ml培养基。通过在2600rpm(约1800×g)下离心9分钟沉淀琼脂糖颗粒。将琼脂糖颗粒在15ml杂交瘤培养基中洗涤，将每个样品重悬于30ml生长培养基中，转移至t75烧瓶中并在37℃下在co2中振荡孵育3小时。将琼脂糖颗粒在生长培养基中孵育以使哺乳动物细胞分泌抗体。
洗涤琼脂糖颗粒并用荧光检测剂(即二抗，活/死染剂)染色。具体地，将琼脂糖颗粒沉淀，在冷pbs中洗涤一次，并将每个样品重悬于含有20μg/ml山羊抗小鼠(gam)(h+l)-af488标记的二抗和2μm
使用倒置荧光显微镜筛选琼脂糖颗粒，寻找在相同通道中发荧光的细菌或珠(即绿色荧光)。来自包封的示例性图像显示在图3中。如图3所示，含有用杂交瘤细胞包封的细菌病原体细胞的琼脂糖颗粒，“指定的病原体抗体捕获物(pat)”，其对荧光信号呈阳性，表明包封的杂交瘤细胞分泌与珠和细菌表面上bama结合的抗体。图3还显示，在较大的视场图像中，可以容易地检测抗原阳性琼脂糖颗粒。
挑选“命中”颗粒并将其沉积在pcr管中用于单细胞克隆。来自单细胞rt-pcr的所得dna将在tbd瞬时转染表达系统中表达。
实施例2：稀有b细胞富集方法
该实施例显示了富集产生针对高度保守表位的抗体的稀有b细胞的方法。该方法可用于寻找针对必需革兰氏阴性蛋白，例如鲍氏不动杆菌的bama和lptd上的高度保守表位的稀有抗体。此外，富集的b细胞可用于所提供的方法中以快速发现针对任何感染性疾病靶标上的重要和保守表位的抗体。
a.鲍氏不动杆菌的bama作为靶标
进行实验以评估bama是否是鲍氏不动杆菌中用于通过基于抗体的发现方法进行靶向的选定感兴趣靶标。使用bama蛋白质消耗分析显示bama对鲍氏不动杆菌存活至关重要。bama蛋白位于外膜中，因此可被抗体接近。为了确认可及性，产生了一组bama特异性抗体，其可以结合鲍氏不动杆菌临床分离物表面上的靶标。
为了了解具有最高保守性的bama表位，对超过一百种鲍氏不动杆菌临床分离物进行蛋白质序列分析。评估共有序列并将其映射到bama的结构模型上以说明高度保守的区域。有趣的是，虽然膜包埋的β-链和周质环在所有分离物中高度保守，但是少数胞外抗体可及的环显示出显著的多样性(图4)。具体而言，环4似乎是高度可变的。有趣的是，上述用于验证bama可及性的抗体组显示与可变环4结合。使用传统的杂交瘤技术产生该组抗体，表明针对环4的抗体主导针对bama的宿主免疫应答。环4当从蛋白质中被删除时不影响功能，这符合低保守的蛋白质区域通常对功能不重要的一般概念。为了进一步证实其对功能的影响，显示与该可变环结合的抗体不抑制bama功能。低保守性，缺乏功能重要性和宿主免疫优势使得环4成为经典的免疫系统诱饵。
然而，鉴定了bama的抗体可及表面上的高度保守的表位，其将适合抗体结合(图4，例如带圆圈的区域)。保守表位的存在与病原体经常产生高度可变的诱饵表位和保护最重要的高度保守表位的能力相一致。因为bama能改变构象以执行基本功能，所以与该高度保守的表位结合的抗体可以阻断功能并导致细菌细胞死亡。
b.阶段1：稀有b细胞富集
上述研究表明，bama是富集与高度保守表位相结合的稀有抗体的良好靶标。产生了两种不同的鲍氏不动杆菌bama蛋白变体，其在环4内的氨基酸水平上显著不同。这些变体还经工程改造以带有n末端avi-10his-tev标签。将bama变体1工程改造以带有n-末端avi-10his-tev标签，并删除含有5个串联的球状potra亚结构域的n-末端周质结构域，该序列如seqidno：3所示。n-末端缺失旨在帮助使b细胞富集偏向产生针对细菌表面上的保守表位的抗体的b细胞。bama变体2经工程改造以带有n-末端6xhis标签，序列如seqidno：4所示。经工程改造的bama变体2保留了n-末端周质结构域。
为了产生起始产抗体细胞库，用bama-变体1免疫balb/c小鼠。显示产生的绝大多数抗体与环4结合。接下来，那些b细胞经历稀有b细胞富集阶段。从免疫小鼠的淋巴结收获b细胞并与bama变体2混合以仅向那些具有识别保守bama表位的表面抗体的b细胞提供存活信号。因此，所有产生环4抗体的b细胞应该从群体中被耗尽，因为环4在原始免疫原(bama-变体1)和扩增抗原(bama-变体2)之间不是保守的。因为在被重组表达时，需进行溶解以从膜中纯化bama，所以在将bama与b细胞混合之前也进行实验以除去去污剂，因为去污剂的存在会影响b细胞的活力。下面的实施例6描述了除去去污剂的示例性方法。
在bama变体2刺激后，将b细胞注射到近期经辐照的scid/beige小鼠的脾脏中，使其繁殖10天。作为对照，未用bama变体2刺激的起始b细胞群的一半也被注射到scid脾中，但没有抗原刺激。在scid小鼠中进行10天抗原特异性扩增后，收获b细胞并进行elispot分析以确定接受bama-变体2刺激的b细胞是否具有更高频率的针对保守表位的抗体。bama变体2刺激产生显著数量的产生针对保守表位的抗体的b细胞，而模拟处理的细胞通过elispot显示与bama变体2没有交叉反应性(图5)。
实施例3：用于筛选抗体的病原体抗体捕获(pat)
该实施例证明了所提供的方法的实施，以针对与感兴趣靶标的结合筛选大量b细胞，以及通过单b细胞克隆和转染方案进行的抗体分离。该方法可用于在爆发期间快速鉴定针对细菌或其它微生物的抗体。
a.功能性抗体选择
从用bama-变体1(在seqidno：3中所示)免疫的balb/c小鼠筛选抗体分泌性b细胞。将单个b细胞与表达bama-变体1的细菌细胞和用bama-变体2(在seqidno：4中列出)包被的珠共同包封。在一些实验中，通常如下文实施例4中所述包封抗体分泌细胞，珠和细胞。然后允许这些b细胞将一抗分泌到颗粒中。
为了观察一抗与细菌或珠的结合，将荧光二抗浸入颗粒中。观察到各种结合模式。图6示出了代表性研究。如图6所示，通过荧光珠和荧光细菌的存在鉴定了产生针对bama上保守的表面暴露表位的抗体的b细胞。其它颗粒仅在细菌或珠上显示荧光信号，鉴定分别与bama的表面暴露的可变区或非表面暴露的保守区域相结合的抗体。这些不同的结合模式允许对在包封的颗粒中观察到的结合模式与最终重组抗体的抗体结合的结合模式之间的相关性进行评估。
在第一次筛选中，在一天内筛选出20,000个分泌抗体的b细胞，并鉴定了在bama-变体2包被的珠上具有荧光信号的10个颗粒。在第二天，筛选50,000个分泌抗体的b细胞，并选择具有荧光细菌和珠的两个颗粒(图6)和具有细菌荧光信号的14个颗粒。这些选择的颗粒经选择用于单b细胞克隆。
b.单b细胞克隆
然后处理上面选择的颗粒用于对编码抗体的重链和轻链基因的pcr和单细胞逆转录(rt)。在表达具有针对bama的保守区域的表位的抗体的10个b细胞中，产生来自6个b细胞的重链和轻链基因的pcr产物。
将编码抗体的线性pcr产物转染到哺乳动物细胞中以产生重组抗体，其通过elisa测试bama结合，针对与bama变体1(如seqidno：3所示)，bama变体3(如seqidno：7所示)，和bama变体4(如seqidno：8所示)的制备物的结合：这些重组抗体中的5种结合bama上高度保守的表位(图7)。如图7所示，通过elisa证实了这些抗体在三种不同的bama变体(bama变体1，3和4)上的抗体结合，这些bama变体在环4和其它可变的胞外环的序列方面均显著不同。
实施例4：微生物包封和颗粒筛选
该实施例描述了制备产抗体细胞样品的示例性方法，包封产抗体细胞与微生物和/或珠并筛选颗粒以快速且有效地鉴定产生针对感兴趣的免疫原例如bama或其它细菌外膜蛋白或免疫原的抗体的细胞。
a.制备产抗体细胞
用感兴趣的免疫原，例如用鲍氏不动杆菌细菌细胞或纯化的bama蛋白或其变体免疫小鼠，例如balb/c小鼠。数周后，取出免疫小鼠的脾脏和/或淋巴结。使用泛b细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司，目录号130-095-813)分离产抗体细胞，然后使用easyseptmcd138+细胞分离试剂盒(干细胞技术公司(stemcelltechnologies))分离cd138+细胞。泛b细胞制备物含有约10％的产抗体细胞，并且还获得无组织碎片和未知垃圾的细胞制备物。进一步的cd138+细胞分离进一步使产抗体细胞富集超过3倍。在该步骤中，产抗体细胞的高度富集可以通过减少筛选的总颗粒的数量来增加筛选的效率以找到感兴趣的颗粒(命中)，这是有利的，因为在一些情况下，筛选期间的细胞活力可能随着筛选时间的延长而降低。
b.包封
将包含产抗体细胞的分离的细胞与包被有免疫原或感兴趣靶标(例如bama或实施例4中描述的其它外膜蛋白质)的珠(平均直径：3-5μm)和待筛选的微生物(例如鲍氏不动杆菌细菌细胞)(平均大小：0.5-1μm)包封。
在包封之前，将磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的4％超低胶凝温度琼脂糖(西格玛奥德里奇公司，目录号a5030)的制剂在70℃下熔化15分钟，然后冷却至37℃，用于包封活产抗体细胞。超低胶凝温度琼脂糖使琼脂糖在低得多的温度下保持液态，从而允许包封活细胞。
将待包封的各个组分离心并重新悬浮至所需浓度以进行包封。将含有产抗体细胞的分离细胞离心并重悬于包封培养基(伊氏改良达氏培养基(imdm)和optipreptm密度梯度培养基(西格玛奥德里奇公司，目录号d1556)的组合)中。包括密度梯度介质以防止包封期间产抗体细胞的沉降，这可以提高颗粒中单细胞包封的效率。将抗原包被的珠和细菌细胞离心并重悬于2xoptipreptm密度梯度培养基中。对于每个琼脂糖凝胶颗粒，以约0.1:5:100的比率组合产抗体细胞，珠和细菌细胞。基于每个琼脂糖凝胶颗粒的每种组分的细胞活力和潜在荧光信号的优化来确定该比率。在一些情况下，发现每个颗粒过多的珠会导致聚集的珠，其捕获荧光抗体并发射非特异性荧光信号。此外，在一些方面，发现每个颗粒少于3个珠会减少荧光信号，在一些情况下，这使得珠在筛选期间更难以被观察。在细菌(或其它微生物)的情况下，过多或过少细菌的存在在某些情况下会使细胞观察更加困难。在某些方面，太多的细菌也意味着将缺乏足够的抗体分泌以包被或结合所有细菌。
将含有所有组分的合并样品加热至37℃保持5分钟。将约125μl熔化的琼脂糖溶液加入到含有所述组分的培养基中，并按照制造商的说明将约100μl的包封混合物加载到μencapsulator(白云石微流体公司)芯片上，以在非水性环境中产生包封的颗粒。收集包封的颗粒并在冰上孵育5-10分钟以使琼脂糖凝胶化。将凝胶化的包封颗粒转移到含有1ml3mtmnovectm7500(作为非水性气体渗透性油)的6孔培养皿中，并在37℃下振荡孵育1小时，以使b细胞分泌抗体。气体渗透性油的存在允许液滴的物理分离并确保分泌的抗体不会逃逸到非水性环境中，从而在微滴中产生足够高浓度的抗体以提高筛选方法的效率。然后将样品转移到管中，乳液用pico-break(白云石微流体公司)破乳，并用pbs中的2％胎牛血清(fbs)洗涤。
将颗粒样品与20μg/mligg(亚类1+2a+2b+3)，与绿色荧光团偶联的fcγ片段特异性二抗(山羊抗小鼠fc-af488；杰克逊免疫研究公司(jacksonimmunoresearch)，目录号102646-750，在冰上用10％fbs/pbs稀释)在冰上避光孵育30分钟，用于观察产生的抗体。然后将样品在2％fbs/pbs中洗涤并储存在冰上直至准备筛选。将体积为约300-500μl(或至多1ml，取决于密度)的颗粒置于圆盖玻片底筛选皿(飞世尔科学公司(fisherscientific)，目录号14035-20)上。与较厚的成像表面相比，盖玻片底筛选皿允许更亮的高分辨率成像和荧光信号的可视化。加入过滤的pbs至总体积不超过2ml，使颗粒沉降至皿底部。通过使用荧光显微镜观察荧光信号对颗粒进行成像并筛选抗体结合。检测到与荧光珠和/或荧光细菌和产抗体细胞共同包封的颗粒。使用显微操纵针(origio公司，目录号c140819)选择来自对信号呈阳性的颗粒的产抗体细胞。
实施例5：在针对破坏革兰氏阴性菌细胞包膜的抗体的基于微颗粒的筛选中使用鲍氏不动杆菌报告细胞
使用实施例4中基本描述的方法将外膜(om)应激转录报告鲍氏不动杆菌细胞与产抗体细胞包封，不同之处在于含有产抗体细胞(分泌诱导细菌表型变化的抗体)的颗粒通过在调节区域的可操作控制下诱导细菌细胞中的荧光报告分子来鉴定，所述调节区域响应经修饰的表型变化(涉及对于外膜的细胞应激)。
为了鉴定对外膜应激具有响应性的调节区域，通过消耗bama(一种必需的om生物合成因子)或通过在多粘菌素b九肽(pmbn)(已知破坏或透化革兰氏阴性细菌的外膜的物质)的存在下生长，在鲍氏不动杆菌中诱导外膜应激。使用rna-seq评估基因表达的变化。作为对引起经修饰的表型改变的因素之一两者的响应，大约790种基因的表达上调超过2倍或更多。作为对引起经修饰的表型改变的因素之一或两者的响应，大约640种基因的表达下调超过2倍或更多。
产生示例性报告构建体，其含有被鉴定为上调超过10倍的示例性基因上游的转录调节区。将每个基因的开放阅读框(orf)上游的dna序列与荧光报告分子偶联。通过组装将融合多肽纳入表达载体中并导入鲍氏不动杆菌中以产生报告细菌细胞。
通过用鲍氏不动杆菌ab307-0294免疫balb/c小鼠来产生产抗体细胞库。基本上如实施例4中所述，在基本如实施例4中所述的两步细胞纯化过程中从免疫的balb/c动物的脾和淋巴结细胞中分离产生抗体的b细胞。首先，使用泛b细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司，目录号130-095-813)收获并纯化脾和淋巴结细胞，以去除组织碎片和其它物质。然后，使用easyseptmcd138+细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)进一步纯化细胞制备物，以获得b细胞制备物。
如实施例4中所述，将单b细胞与报告细菌细胞共同包封，除了在该示例性实验中，抗原包被的珠未共同包封。而且，因为细菌细胞表达报告分子，所以省略了与二抗孵育以检测分泌的抗体的操作。
通过使用荧光显微镜观察荧光信号对颗粒进行成像并筛选抗体结合。检测到与荧光细菌和产抗体细胞共同包封的颗粒。如图11a-11c所示，观察到含有荧光细菌的颗粒，表明存在分泌抗体的b细胞，该细胞分泌以破坏外膜和/或诱导外膜应激的方式与细胞结合的分子。然后使用显微操纵针(origio公司，目录号c140819)选择该b细胞用于单细胞抗体克隆。
实施例6：用于免疫的抗原的纯化和制备
该实施例描述了产生、纯化和制备示例性外膜蛋白作为免疫抗原的方法，以获得针对免疫蛋白的产抗体细胞。
a.纯化抗原：bama
为了产生和纯化鲍氏不动杆菌bama的桶部分，用编码包含n末端avi-10his-tev标签的鲍氏不动杆菌bama的桶部分的质粒(例如，编码seqidno：3所示的bama变体)转化大肠杆菌bl21-de3细胞。培养大肠杆菌细胞，通过加入异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)诱导蛋白质的表达。收获细胞并通过将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液(每50ml中50mmtrisph8，150mmnacl，20μldna酶i(25μg/μl)，1mmpmsf，1罗氏完全蛋白酶抑制剂)和溶菌酶中裂解，并且另用lm-10微流化器(马萨诸塞州威斯特伍德的微流化公司(microfluidics))在18,000psi下使细胞均质化三次。
将均质化的样品离心并在洗涤缓冲液(50mmtrisph8，150mmnacl，0.1mmpmsf，1mmdtt，0.5％曲通-x100，罗氏完全蛋白酶抑制剂)中洗涤数次，并在8m尿素，50mmtrisph8，150mmnacl中在室温下过夜孵育以溶解。然后将样品离心并通过预填装的3mlco2+柱(热科学公司(thermoscientific)，prod#89969)，在unia缓冲液(8m尿素，50mmtrisph7.4，150mmnacl)中洗涤数次，然后用unib缓冲液(150mm咪唑，8m尿素，50mmtrisph7.4，150mmnacl)洗脱。使用8m尿素，50mmtrisph7.4，150mmnacl，1mmdtt和具有10kda截留分子量(密理博公司(millipore))的amiconultra-15装置进行缓冲液交换和样品浓集。
通过将1份蛋白质样品加入9份1.1x再折叠缓冲液(55mmtrisph8，165mmnacl，66mmsds，1.65mpd)中，混合并在室温下孵育3天，使制备的蛋白质样品再折叠。使用截留分子量为10kda的amiconultra-15装置(millipore)浓集再折叠的蛋白质样品，并在aktapure(ge医疗公司)上使用跑动缓冲液(10mmhepesph8.0，150mmnacl，0.8％c8e4)通过superdex200increase10/30尺寸排阻柱(宾夕法尼亚州匹兹堡ge医疗公司)。在sds-page凝胶上验证样品，合并并进一步浓集。
b.用于免疫的制备
将如上所述产生的膜蛋白制剂中的去污剂或表面活性剂替换为两亲性表面活性剂两亲高分子，以为免疫做准备。在蒸馏水中制备一种两亲高分子a8-35的溶液，其浓度为蛋白质:两亲高分子比例为1:4(例如，每mg蛋白质4mg两亲高分子)。将每种抗原以2mg/ml蛋白质浓度溶解在两亲高分子溶液中，并在4℃温和搅拌下孵育4小时。将蛋白质/两亲高分子混合物上样到在凝胶过滤缓冲液(20mmhepesph8.0，150mmnacl)中平衡的hiprep16/60s-300凝胶过滤柱上，用凝胶过滤缓冲液洗脱蛋白质，以除去多余的未结合的两亲高分子或任何剩余的未结合的去污剂或表面活性剂。在sds-page凝胶上验证样品，合并蛋白质/两亲高分子复合物，并使用截留分子量为10kda的amiconultra-15装置(密理博公司)进一步浓集。
实施例7：用于鉴定结合至lptd的抗体的示例性方法
从用lptd免疫的小鼠获得产生针对鲍氏不动杆菌lptd的抗体的杂交瘤细胞。用纯化的lptd/lpte复合物免疫balb/c小鼠。lpte是lptd正确再折叠所必需的。从小鼠脾脏中收获产抗体细胞，显示对纯化的lptd/lpte的多克隆血清反应。进行电融合以从离散的产抗体细胞产生杂交瘤。以细胞培养上清液形式收集由杂交瘤分泌的抗体。
通过elisa测试从杂交瘤细胞获得的抗体与纯化的lptd/lpte之结合和与阴性对照抗原bama之结合。以1:50和1:250mab稀释度测试lptd/lpte，并以1:50mab稀释度测试阴性对照bama。图12显示了9个独立杂交瘤系的结果。结果显示，基于添加的mab的量，结合活性是可滴定的。结果显示所有9种单克隆抗体均显示出与lptd/lpte的结合，但不显示与阴性对照抗原bama的结合，显示出抗原特异性结合活性。
将产生针对lptd的抗体的杂交瘤细胞与表达lptd的细菌细胞，并与偶联有lptd变体的珠一起包封在琼脂糖微滴中，如上文根据实施例4所述。
实施例8：针对bama的保守区域的人源化抗体
用鲍氏不动杆菌bama免疫经遗传修饰以产生人源化抗体的转基因小鼠。八(8)个人源化抗体产生型trianni小鼠(trianni公司)用10μg纯化的seqidno：3所示的bama变体1的桶部分的制备物免疫，其如上文实施例6中所述产生。使用环状二核苷酸作为佐剂，并将抗原制备物注射到足垫中。通过足垫和皮下注射进行超免疫。
在免疫后第21天和终止时(末端出血)从每只小鼠获得含有多克隆抗体的血清。为了测试trianni供者小鼠是否产生针对bama的保守区域的抗体，测试d21血清和/或末端出血是否存在与不同bama变体结合的抗体。产生在表面上条件性表达bama变体5(seqidno：31中所示)的鲍氏不动杆菌测试株。bama变体5是bama变体1的修饰形式，其中胞外环4(在bama的不同分离物和变体之间高度可变的环)被bama变体2的胞外环4序列替换。如果获自用bama变体1免疫的抗体也与bama变体5结合，则可将非保守的高变环4从抗体识别的表位中排除。
将来自d21的40倍稀释的多克隆血清和/或来自8只免疫小鼠的末端出血与不表达bama的鲍氏不动杆菌对照(低)或表达bama变体5的鲍氏不动杆菌测试株(高)一起孵育。使用荧光标记的二抗检测结合的抗体。图13a显示了，对于8只小鼠中每一只与不表达bama的对照鲍氏不动杆菌的结合，与d21和终末出血多克隆血清孵育后的荧光信号的叠加直方图。图13b显示了，对于8之小鼠中每一只与表达bama变体5(高)的鲍氏不动杆菌测试株，在与末端出血多克隆血清一起孵育后的荧光信号的叠加直方图。表1显示了就与bama变体5的细胞结合而言，来自每只小鼠的末端出血血清的平均荧光强度信号除以来自对照的背景荧光信号。如其所示，末端出血响应显示出与bama的非环4区域的富集的结合信号，表明与胞外部分的保守区域结合。
表1.针对bama变体5的细胞结合响应
本发明并不旨在限于特定公开的实施方式的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和主旨的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开的范围内。
序列
序列表
<110>尔察祯有限公司(achaogen,inc.)
l·r·司维姆(swem,lee,robert)
r·瑟兹(cirz,ryan)
m·施瓦茨(schwartz,monica)
k·本德(bender,kristina)
武爽(wu,shuang)
f·芬德森(findeisen,felix)
m·坎努斯瓦米(kannuswamy,malavika)
d·里奇(ricci,dante)
a·帕特尔(patel,ami)
<120>鉴定结合细胞表面表位的抗体的筛选方法
<130>757832000140
<140>未指定
<141>同时附上
<150>62/288,729
<151>2016-01-29
<160>31
<170>fastseqforwindowsversion4.0
<210>1
<211>414
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>bama变体1(n-末端缺失)
<400>1
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202530
ileprothrsergluasnleutyrpheglnglyalasergluglugln
354045
hisserglythrthrthrleualavalglytyrserglnserglygly
505560
ilethrpheglnalaglyleuserglnthrasnphemetglythrgly
65707580
asnargvalalaileaspleuserargsergluthrglnasptyrtyr
859095
asnleuservalthraspprotyrphethrileaspglyvalserarg
100105110
glytyrasnvaltyrtyrarglysthrlysleuasnaspasptyrasn
115120125
valasnasntyrvalthraspserpheglyglyserleuserphegly
130135140
tyrproileaspgluasnglnserleuseralaservalglyvalasp
145150155160
asnthrlysvalthrthrglyprotyrvalserthrtyrvalargasp
165170175
tyrleuleualaasnglyglylysalathrglylyssersertrpcys
180185190
prothrglylysasngluvalaspprolysthrglnglnproilepro
195200205
asnthrcysgluglyglyphegluprotyrgluseralapheglugly
210215220
gluphephethrtyrasnleuasnleuglytrpsertyrasnthrleu
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asnargproilepheprothrserglymetserhisargvalglyleu
245250255
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260265270
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glytyrglylysleuglytyrglyasnaspleuprophetyrlysasn
290295300
phetyralaglyglytyrglyservalargglytyraspasnserthr
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leuglyprolystyralaservalasnleuglngluthrlysglnasn
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aspglyserproglugluvalglyglyasnalaleuvalglnphegly
340345350
thrgluleuvalleuprometprophelysglyasptrpthrarggln
355360365
valargprovalleuphealagluglyglyglnvalpheaspthrlys
370375380
cysasnileaspasnthrvaltyrglyasplysglymetlysileasn
385390395400
glyglnthrilethraspvalarglystyrcysgluaspasntyrgly
405410415
pheaspleuglyasnleuargtyrservalglyvalglyvalthrtrp
420425430
ilethrmetileglyproleuserleusertyralapheproleuasn
435440445
asplysproglyaspgluthrlysgluileglnphegluileglyarg
450455460
thrphe
465
<210>9
<211>45
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>avitag-10xhis-tev
<400>9
metserglyleuasnaspilepheglualaglnlysileglutrphis
151015
gluglyalahishishishishishishishishishisasptyrasp
202530
ileprothrsergluasnleutyrpheglnglyalaser
354045
<210>10
<211>24
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>6xhis
<400>10
metglyserserhishishishishishisserserglyleuvalpro
151015
argglyserhismetalaserala
20
<210>11
<211>841
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606全长包括信号序列
<400>11
metarghisthrhispheleumetproleualaleuvalseralamet
151015
alaalavalglnglnalatyralaalaaspaspphevalvalargasp
202530
ileargvalasnglyleuvalargleuthrproalaasnvaltyrthr
354045
metleuproileasnserglyaspargvalasngluprometileala
505560
glualaileargthrleutyralathrglyleupheaspaspilelys
65707580
alaserlysgluasnaspthrleuvalpheasnvalilegluargpro
859095
ileileserlysleugluphelysglyasnlysleuileprolysglu
100105110
alaleugluglnglyleulyslysmetglyilealagluglygluval
115120125
phelyslysseralaleuglnthrilegluthrgluleugluglngln
130135140
tyrthrglnglnglyargtyraspalaaspvalthrvalaspthrval
145150155160
alaargproasnasnargvalgluleulysileasnpheasnglugly
165170175
thrproalalysvalpheaspileasnvalileglyasnthrvalphe
180185190
lysaspsergluilelysglnalaphealavallysgluserglytrp
195200205
alaservalvalthrargasnaspargtyralaargglulysmetala
210215220
alaserleuglualaleuargalamettyrleuasnlysglytyrile
225230235240
asnpheasnileasnasnserglnleuasnilesergluasplyslys
245250255
hisilepheilegluvalalavalaspgluglyserglnphelysphe
260265270
glyglnthrlyspheleuglyaspalaleutyrlysproglugluleu
275280285
glnalaleulysiletyrlysaspglyaspthrtyrserglnglulys
290295300
valasnalavallysglnleuleuleuarglystyrglyasnalagly
305310315320
tyrtyrphealaaspvalasnilevalproglnileasnasngluthr
325330335
glyvalvalaspleuasntyrtyrvalasnproglyglnglnvalthr
340345350
valargargileasnphethrglyasnserlysthrseraspgluval
355360365
leuargargglumetargglnmetgluglyalaleualaserasnglu
370375380
lysileaspleuserlysvalargleugluargthrglyphephelys
385390395400
thrvalaspilelysproalaargileproasnserproaspglnval
405410415
aspleuasnvalasnvalglugluglnhisserglythrthrthrleu
420425430
alavalglytyrserglnserglyglyilethrpheglnalaglyleu
435440445
serglnthrasnphemetglythrglyasnargvalalaileaspleu
450455460
serargsergluthrglnasptyrtyrasnleuservalthrasppro
465470475480
tyrphethrileaspglyvalserargglytyrasnvaltyrtyrarg
485490495
lysthrlysleuasnaspasptyrasnvalasnasntyrvalthrasp
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serleuseralaservalglyvalaspasnthrlysvalthrthrgly
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565570575
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580585590
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595600605
glytrpsertyrasnthrleuasnargproilepheprothrsergly
610615620
metserhisargvalglyleugluileglyleuproglyseraspval
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asptyrglnlysvalthrtyraspthrglnalaphepheproilegly
645650655
serthrglyphevalleuargglytyrglylysleuglytyrglyasn
660665670
aspleuprophetyrlysasnphetyralaglyglytyrglyserval
675680685
argglytyraspasnserthrleuglyprolystyrproservalasn
690695700
leuglngluthrlysglnasnaspserserproglugluvalglygly
705710715720
asnalaleuvalglnpheglythrgluleuvalleuprometprophe
725730735
lysglyasptrpthrargglnvalargprovalleuphealaglugly
740745750
glyglnvalpheaspthrlyscysasnileaspasnservaltyrgly
755760765
asnlysglymetlysileasnglyglnthrilethraspvalarglys
770775780
tyrcysgluaspasntyrglypheaspleuglyasnleuargtyrser
785790795800
valglyvalglyvalthrtrpilethrmetileglyproleuserleu
805810815
sertyralapheproleuasnasplysproglyaspgluthrlysglu
820825830
ileglnphegluileglyargthrphe
835840
<210>12
<211>16
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基423-438
<400>12
glugluglnhisserglythrthrthrleualavalglytyrsergln
151015
<210>13
<211>21
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基440-460
<400>13
glyglyilethrpheglnalaglyleuserglnthrasnphemetgly
151015
thrglyasnargval
20
<210>14
<211>41
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基462-502
<400>14
ileaspleuserargsergluthrglnasptyrtyrasnleuserval
151015
thraspprotyrphethrileaspglyvalserargglytyrasnval
202530
tyrtyrarglysthrlysleuasnasp
3540
<210>15
<211>30
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基504-533
<400>15
tyrasnvalasnasntyrvalthraspserpheglyglyserleuser
151015
pheglytyrproileaspgluasnglnserleuseralaser
202530
<210>16
<211>8
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基537-544
<400>16
aspasnthrlysvalthrthrgly
15
<210>17
<211>9
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基547-555
<400>17
valserthrtyrvalargasptyrleu
15
<210>18
<211>5
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基557-561
<400>18
alaasnglyglylys
15
<210>19
<211>6
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基599-604
<400>19
glygluphephethrtyr
15
<210>20
<211>39
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基606-644
<400>20
leuasnleuglytrpsertyrasnthrleuasnargproilephepro
151015
thrserglymetserhisargvalglyleugluileglyleuprogly
202530
seraspvalasptyrglnlys
35
<210>21
<211>7
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基646-652
<400>21
thrtyraspthrglnalaphe
15
<210>22
<211>42
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基659-700
<400>22
glyphevalleuargglytyrglylysleuglytyrglyasnaspleu
151015
prophetyrlysasnphetyralaglyglytyrglyservalarggly
202530
tyraspasnserthrleuglyprolystyr
3540
<210>23
<211>6
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基702-707
<400>23
servalasnleuglnglu
15
<210>24
<211>6
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基718-723
<400>24
valglyglyasnalaleu
15
<210>25
<211>13
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基735-747
<400>25
prophelysglyasptrpthrargglnvalargproval
1510
<210>26
<211>12
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基749-760
<400>26
phealagluglyglyglnvalpheaspthrlyscys
1510
<210>27
<211>11
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基784-794
<400>27
lystyrcysgluaspasntyrglypheaspleu
1510
<210>28
<211>7
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基798-804
<400>28
argtyrservalglyvalgly
15
<210>29
<211>10
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基806-815
<400>29
thrtrpilethrmetileglyproleuser
1510
<210>30
<211>25
<212>prt
<213>鲍氏不动杆菌（acinetobacterbaumannii）
<220>
<223>鲍氏不动杆菌atcc19606bama残基817-841
<400>30
sertyralapheproleuasnasplysproglyaspgluthrlysglu
151015
ileglnphegluileglyargthrphe
2025
<210>31
<211>414
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>bama变体5(n-末端缺失)
<400>31
glugluglnhisserglythrthrthrleualavalglytyrsergln
151015
serglyglyilethrpheglnalaglyleuserglnthrasnphemet
202530
glythrglyasnargvalalaileaspleuserargsergluthrgln
354045
asptyrtyrasnleuservalthraspprotyrphethrileaspgly
505560
valserargglytyrasnvaltyrtyrarglysthrlysleuasnasp
65707580
asptyrasnvalasnasntyrvalthraspserpheglyglyserleu
859095
serpheglytyrproileaspgluasnglnserleuseralaserval
100105110
glyvalaspasnthrlysvalthrthrglyprotyrvalserthrtyr
115120125
valargasptyrleuleualaasnglyglylysalathrserlysgly
130135140
thrtyrcysprothraspalaasnglyaspserglntyraspthrglu
145150155160
lysglyglucyslysvalproglugluthrtyraspasnalapheglu
165170175
glygluphephethrtyrasnleuasnleuglytrpsertyrasnthr
180185190
leuasnargproilepheprothrserglymetserhisargvalgly
195200205
leugluileglyleuproglyseraspvalasptyrglnlysvalthr
210215220
tyraspthrglnalaphepheproileglyserthrglyphevalleu
225230235240
argglytyrglylysleuglytyrglyasnaspleuprophetyrlys
245250255
asnphetyralaglyglytyrglyservalargglytyraspasnser
260265270
thrleuglyprolystyralaservalasnleuglngluglulyslys
275280285
asnaspserserproglugluvalglyglyasnalaleuvalglnphe
290295300
glythrgluleuvalleuprometprophelysglyasptrpthrarg
305310315320
glnvalargprovalleuphealagluglyglyglnvalpheaspthr
325330335
lyscysaspvalargsertyrsermetilemetasnglyglnglnile
340345350
seraspalalyslystyrcysgluaspasntyrglypheaspleugly
355360365
asnleuargtyrservalglyvalglyvalthrtrpilethrmetile
370375380
glyproleuserleusertyralapheproleuasnasplysprogly
385390395400
aspgluthrlysgluileglnphegluileglyargthrphe
405410