α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸的制作方法

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背景技术：
：本发明涉及α-淀粉酶变体(即，具有α-淀粉酶活性的多肽)、编码该α-淀粉酶的核酸、生产该α-淀粉酶的方法、包含该α-淀粉酶的组合物以及使用该α-淀粉酶的方法。相关技术说明α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.1)由一组酶构成，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。α-淀粉酶在工业上用于若干种已知应用的用途具有悠久历史，这些应用如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，例如在高果糖糖浆的制备中或用作从淀粉生产乙醇的一部分。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用了衍生自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。芽孢杆菌α-淀粉酶例如特妙(termamyl)aa560(seqidno:2；还参见wo2000/060060)和sp707(seqidno:8；还参见tsukamoto等人，1988，biochem.biophys.res.comm.[生物化学和生物物理研究通讯]151:25-31)形成特定的、已经用于洗涤剂中的α-淀粉酶的组。已经对这些淀粉酶进行修饰以改进其在洗涤剂中的稳定性。例如，wo96/23873披露了α-淀粉酶sp690、sp722(seqidno:5)和sp707(seqidno:8)的缺失型突变体(还参见wo96/23873的seqidno:1、2和7)以改进这些淀粉酶的稳定性。wo96/23873进一步披露了取代型突变体，以针对氧化来稳定淀粉酶。具有改进的特性的另外的α-淀粉酶突变体披露于wo2006/002643和wo01/66712中。因而，修饰天然存在的淀粉酶来改进某些特性是已知的。本发明的目的是提供具有α-淀粉酶活性的多肽(α-淀粉酶)，该多肽具有改进的洗涤性能，尤其是用于自动洗涤机和/或餐具洗涤机。技术实现要素：本发明涉及对应于衍生自芽孢杆菌属的α-淀粉酶的变体具有α-淀粉酶活性的多肽。具体而言，本发明的多肽包含seqidno:1的氨基酸序列或由其组成，其中这些氨基酸中的一个或多个发生突变(例如，通过取代或缺失)，使得该多肽展现增强的洗涤性能(尤其在自动洗涤机和/或餐具洗涤机中)。本发明还涉及编码变体α-淀粉酶多肽的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及生产这些变体α-淀粉酶多肽的方法。本发明还涉及包含这些变体α-淀粉酶多肽的洗涤剂组合物，以及这些洗涤剂组合物在家庭和工业清洗过程(如衣物清洗和餐具洗涤)中的用途。附图说明图1示出了seqidno:1和seqidno:2的比对定义α-淀粉酶：术语“α-淀粉酶”(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。出于本发明的目的，根据实例1中所述的程序测定α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的变体具有seqidno:1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。氨基酸：如本文使用的，术语“氨基酸”包括标准二十种遗传编码的氨基酸及其相应的处于“d”型(与天然“l”型进行对比)的立体异构体、ω-氨基酸、其他天然存在的氨基酸、非常规氨基酸(例如α,α-双取代的氨基酸、n-烷基氨基酸等)和化学衍生的氨基酸。可以通过与功能性侧集团反应来实现一个或多个氨基酸的化学衍生物。此类衍生的分子包括例如，其中游离氨基基团已经衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基基团、羧基苯氧基基团、叔丁氧基羰基基团、氯乙酰基基团或甲酰基基团的那些分子。游离羧基基团可以被衍生形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯和酰肼。游离羟基基团可被衍生化以形成o-酰基或o-烷基衍生物。作为化学衍生物还包括那些含有二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如：4-羟脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸并且鸟氨酸取代赖氨酸。只要维持必要的活性，衍生物也包括含有一个或多个添加或缺失的肽。其他包括的修饰是酰胺化、氨基末端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如用氨或甲胺)、和类似的末端修饰。当明确列举氨基酸，例如“丙氨酸”或“ala”或“a”时，除非另有明确说明，否则该术语是指l-丙氨酸和d-丙氨酸。其他非常规氨基酸也可以是本发明多肽的适合组分，只要所需功能特性由多肽保留即可。对于所示的肽，适当时，每个编码的氨基酸残基由单字母代号表示，对应于常规氨基酸的普通名称。在一个实施例中，本发明的多肽包含l-氨基酸或由其组成。cdna：术语“cdna”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺少可以存在于相应基因组dna中的内含子序列。早先的初始rna转录物本是mrna的前体，其在呈现为成熟的剪接的mrna之前要经一系列步骤进行加工，包括剪接。编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(例如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(如taa、tag或tga)结束。编码序列可为基因组dna、cdna、合成dna、或其组合。对照序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的变体的多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。对应于：如在此所使用的术语“对应于”是指确定序列的特定氨基酸的方法，其中参考特定氨基酸序列。例如出于本发明的目的，当参考特定氨基酸位置时，本领域技术人员能够将另一个氨基酸序列与已经参考的所述氨基酸序列进行比对，以便在所述另一氨基酸序列中确定哪个特定氨基酸可能是感兴趣的。已经在本文其他地方描述了另一氨基酸序列与例如seqidno:1或2中所示的序列或在此列出的任何其他序列的比对。可使用可替代的比对方法，并且这些方法为本领域技术人员所熟知。增强的洗涤性能：术语“增强的洗涤性能”或“改进的洗涤性能”意指与seqidno:1的亲本α淀粉酶相比，本发明的多肽在洗涤过程(例如衣物洗涤或餐具洗涤)中提供清洗效果(例如去除污渍)的能力是改进的。可以使用本领域熟知的方法来确定洗涤性能，如使用自动机械应力测定(amsa)或自动餐具洗涤(adw)(参见实例2和3)。本领域技术人员将会理解，仅在一些或者可能所有的洗涤条件下(例如在40℃或更高(例如在40℃和/或在50℃)的洗涤温度下、和/或有或没有漂白剂的存在),可以实现增强的洗涤性能。表达：术语“表达”包括涉及变体的产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状dna分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。片段：术语“片段”意指具有在seqidno:1的成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，片段含有seqidno:1的至少200个连续的氨基酸残基，例如seqidno:1的至少300个连续的氨基酸残基、或至少350个连续的氨基酸残基、或至少400个连续的氨基酸残基、或至少450个连续的氨基酸残基。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰，例如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。本领域内已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。突变：在本发明多肽的上下文中，术语“突变”意指在参考氨基酸序列(即seqidno:1)内的一个或多个氨基酸通过用不同的氨基酸取代或通过缺失而改变。此外，突变可以对应于在参考氨基酸序列内一个或多个额外的氨基酸的插入。核酸构建体:术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。根据……进行编号：如本文使用的，术语“根据……进行编号”是指编号本发明多肽中每个氨基酸残基的方式。即技术人员会知道当，例如，根据seqidno:2对位置202进行编号时，他将知道通过任何其他多肽与seqidno:2的比对，他将能够确定其他多肽中的相应氨基酸残基。本文其他地方已描述了两个或更多个氨基酸序列的比对。可操作地连接：术语“可操作地连接”意思指这样一种配置，在该配置中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，这样使得该控制序列引导编码序列的表达。亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指seqidno:1的α-淀粉酶(通过诺维信公司(novozymesa/s)在商品名“plus”下商品化；参见wo2006/002643)。可替代地，它也可以意指seqidno:2的α-淀粉酶(也称为aa560)。序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在emboss软件包(emboss：theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite[欧洲分子生物学开放软件套件])，rice等人，2000，trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数可以是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。使用needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且计算如下：(同一的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)可替代地，所使用的参数可以是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)取代矩阵。使用needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且计算如下：(同一的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)子序列：术语“子序列”意指多核苷酸，该核苷酸具有一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端的缺失；其中该子序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。变体：术语“变体”意指相对于seqidno:1或seqidno:2的“亲本”α-淀粉酶的位置，在一个或多个(例如，若干个)位置包含突变(即，取代、插入、和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸由不同的氨基酸代替；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有seqidno:1或seqidno:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的α-淀粉酶活性。野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由自然界中发现的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的α-淀粉酶。变体命名规则具有α-淀粉酶活性的本发明的多肽对应于衍生自芽孢杆菌属的α-淀粉酶的变体(如在seqidno:1中显示)(其由诺维信公司(novozymesa/s)，在商品名stainzymeplustm下销售)。本发明多肽中的变体(即突变的氨基酸)通过参考seqidno:2(其对应于枯草芽孢杆菌的成熟蛋白aa560)的氨基酸编号来定义。以下以粗体、下划线显示了相对于seqidno:1的氨基酸序列差异。相应地，seqidno:2中的氨基酸位置1至182对应于seqidno:1中的相同编号，seqidno:2的氨基酸位置183和184在seqidno:1中不存在，并且seqidno:2的氨基酸位置185至485分别对应于seqidno:1的位置183至483。seqidno:1和seqidno:2的比对可以在图1中看到。因此，出于本发明的目的，使用在seqidno:2中披露的成熟多肽来确定另一种α-淀粉酶多肽中的对应氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与seqidno:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，rice等人，2000，trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与seqidno:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口扩展罚分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于muscle(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；edgar，2004，nucleicacidsresearch[核酸研究]32:1792-1797)，mafft(版本6.857或更新版本；katoh和kuma，2002，nucleicacidsresearch[核酸研究]30:3059-3066；katoh等人，2005，nucleicacidsresearch[核酸研究]33:511-518；katoh和toh，2007，bioinformatics[生物信息学]23:372-374；katoh等人，2009，methodsinmolecularbiology[分子生物学方法]537:39-64；katoh和toh，2010，bioinformatics生物信息学26:1899-1900)以及采用clustalw(1.83或更新版本；thompson等人，1994，nucleicacidsresearch[核酸研究]22:4673-4680)的embossemma。当其他α-淀粉酶与seqidno:2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(lindahl和elofsson，2000，j.mol.biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可以应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序采用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，psi-blast程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(atschul等人，1997，nucleicacidsres.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，甚至可以实现更高的敏感度。程序如genthreader(jones,1999,j.mol.biol.[分子生物学杂志]287:797-815；mcguffin和jones,2003,bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(psi-blast、二级结构预测、结构比对谱和溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，gough等人，2000，j.mol.biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于scop数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的scop超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法例如距离比对矩阵(holm和sander,1998,proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(shindyalov和bourne,1998,proteinengineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，holm和park,2000,bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。在描述本发明的α-淀粉酶变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用了已接受的iupac单字母和三字母的氨基酸缩写。取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“thr226ala”或者“t226a”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(g)被精氨酸(r)取代，并且丝氨酸(s)被苯丙氨酸(f)取代。缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“gly195*”或“g195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。插入：对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“gly195glylys”或者“g195gk”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“gly195glylysala”或“g195gka”。在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：亲本：变体：195195195a195bgg-k-a多种改变：包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“arg170tyr+gly195glu”或“r170y+g195e”表示在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。不同改变：在可以在某一位置引入不同的改变的情况下，这些不同的改变由逗号分开，例如“arg170tyr,glu”表示在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”指定以下变体：“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”、和“tyr167ala+arg170ala”。具体实施方式具有α-淀粉酶活性的多肽本发明涉及变体α-淀粉酶多肽，该变体α-淀粉酶多肽在seqidno:1的成熟多肽的氨基酸序列内的一个或多个(例如，若干个)位置处包含突变，其中与seqidno:1的多肽相比，该变体展现增强的洗涤性能；所述变体氨基酸序列包含在氨基酸位置202和/或186处的突变，其中根据seqidno:2进行编号；并且与seqidno:1或2具有至少80％，例如至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性。亲本α-淀粉酶的氨基酸序列显示如下：在一个实施例中，该多肽是seqidno:1的变体氨基酸序列，其中该多肽具有α-淀粉酶活性并且与seqidno:1的亲本多肽相比展现出改进的洗涤性能，该变体氨基酸序列包含对应于位置202和/或186(其中根据seqidno:2进行编号)的氨基酸位置的突变，其条件是位置186的突变不是a186g，并且其中变体与seqidno:1或2具有至少80％的序列同一性。在一个实施例中，多肽是变体氨基酸序列，其包含在氨基酸位置202处(其中根据seqidno:2进行编号)的取代，例如l202m。在一个实施例中，多肽是由取代l202m组成的变体氨基酸序列，其中根据seqidno:2进行编号。在另一个实施例中，多肽变体不包含在位置202但在至少位置186处的突变，其不是取代a186d，以及潜在地是其他位置，其中根据seqidno:2进行编号。在另一个实施例中，多肽是变体氨基酸序列，其包含在氨基酸位置186处(其中根据seqidno:2进行编号)的取代，例如a186d。本发明的多肽代表seqidno:1的亲本α淀粉酶的变体，该变体在家庭和/或工业清洗过程(如衣物清洗和餐具洗涤)中展现增强的洗涤性能。可以使用本领域熟知的方法来确定洗涤性能，如使用自动餐具洗涤(adw)(参见实例5)或自动机械应力测定(amsa)(参见实例6)。在一个实施例中，多肽在高温洗涤过程中展现增强的洗涤性能，例如其中温度是至少40℃，例如至少45℃、以及例如至少50℃。在一个实施例中，使用经淀粉染色的三聚氰胺瓷砖在自动餐具洗涤(adw)测定中评估增强的洗涤性能。用于确定本发明多肽的这种改进的洗涤性能的示例性洗涤条件包括：(a)adw洗涤剂，在40℃，以及10min的洗涤循环；和(b)adw洗涤剂，在50℃以及20min的洗涤循环；其中多肽以0.03或0.24mg/l的浓度存在并且其中该adw洗涤剂包含漂白催化剂、一种或多种非离子型表面活性剂、和磺化的聚合物。除了增强的洗涤性能之外，本领域技术人员将会理解相对于seqidno:1的亲本α淀粉酶，本发明的多肽还可以展现一种或多种以下特性的改进：(i)底物特异性；(ii)底物结合；(iii)比活性；(iv)热稳定性(v)ph稳定性曲线；(vi)ca2+依赖性；(vii)氧化稳定性；(viii)增加的/减少的pi；和/或(ix)对表面活性剂的敏感性。用于确定蛋白质的以上特性的测定描述于wo2006/002643、wo2001/066712和ep2264460a中。本发明的多肽可以比seqidno:1的亲本α-淀粉酶更长或更短。因此，该多肽的长度可以是1000个或更少氨基酸，例如900个、800个、700个、600个、500个、400个、300个、200个、175个、150个、125个、100个或更少氨基酸。在一个实施例中，该多肽的长度是在400个和600个氨基酸之间，例如长度在450个和500个之间、在460个和500个之间、或在470个和490个氨基酸之间。本发明的变体多肽在相对于seqidno:1的‘亲本’α-淀粉酶的一个或多个氨基酸位置处包含突变(即，取代、插入、和/或缺失)。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由h.neurath和r.l.hill,1979,于theproteins[蛋白质],学术出版社(academicpress)，纽约中描述。常见取代为ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly。可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：使得多肽的物理化学性质发生改变。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适ph等。可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(cunningham和wells,1989,science[科学],244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单丙氨酸突变，并测试所得的突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。还参见，hilton等人，1996,j.biol.chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如通过这样的技术确定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如，devos等人，1992，science[科学]255:306-312；smith等人，1992，j.mol.biol.[分子生物学杂志]224:899-904；wlodaver等人，1992，febslett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。在一个实施例中，本发明的多肽是seqidno:1的α-淀粉酶的变体，该变体在对应于位置51、186、202、246和334的一个或多个位置处具有突变(例如取代、缺失、和/或插入)，其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行编号。因此，本发明的变体在对应于位置202和/或186的至少一个位置包含突变，其中根据seqidno:2进行编号并且可以进一步包含在位置51、246和334中的一个或多个处的突变，并且其中在变体在位置202处包含突变的情况下，则它还可以在位置186处(以及潜在地还在任何其他位置)包含突变，反之亦然。即，当变体在位置186处包含突变时，则它还可以在位置202处(以及还潜在地在任何其他位置)包含突变。应当理解，当根据本发明的变体在其他位置包含突变时，其不一定在位置202和位置186处包含突变。在一个具体实施例中，本发明的多肽具有与seqidno:1或2的氨基酸序列至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％，但低于100％的序列同一性。因此，相对于seqidno:2的氨基酸序列，该多肽可以包含以下取代中的一个或多个：a51t、a186d、l202m、t246(i/l/v)和s334t。在一个实施例中，当在包含漂白剂的洗涤剂的amsa中，并且在40℃进行10min评估多肽时，该多肽展现对应于至少1.2的改进因子(if)的增强的洗涤性能(例如，参见实例6)。合适的多肽可以是seqidno:1的变体，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含突变：51、186、202、246和334，其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行氨基酸位置的编号。例如，该多肽可以选自下组，该组由以下组成：具有以下突变的seqidno:1的氨基酸序列的多肽：a51t、a186d、l202m、t246(i/l/v)和s334t，及其具有α淀粉酶活性的其片段，其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行氨基酸位置的编号。本领域技术人员将会理解，本发明多肽的不同实例将与seqidno:1的序列具有不同程度的氨基酸序列同一性。因此，该多肽可以包含氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与seqidno:1具有至少85％序列同一性，例如与seqidno:1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在一个实施例中，相对于seqidno:1的氨基酸序列，在该多肽内的变体的数量是在1个和20个之间，例如，在1个和10个突变之间或在1个和5个突变之间，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个突变。在本发明的多肽的一个具体的子集中，该多肽由具有选自下组的突变的seqidno:1的氨基酸序列、或其具有α淀粉酶活性的片段组成，该组由以下组成：a51t+a186d、a51t+l202m、a51t+t246i、a51t+s334t、a186d+l202m、a186d+t246i、a186d+s334t、l202m+t246i、l202m+s334t、t246i+s334t、a51t+a186d+l202m、a51t+a186d+t246i、a51t+a186d+s334t、a51t+l202m+t246i、a51t+l202m+s334t、a51t+t246i+s334t、a186d+l202m+t246i、a186d+l202m+s334t、a186d+t246i+s334t、l202m+t246i+s334t、a51t+a186d+l202m+t246i、a51t+a186d+l202m+s334t、a51t+a186d+t246i+s334t、a51t+l202m+t246i+s334t、a186d+l202m+t246i+s334t、和a51t+a186d+l202m+t246i+s334t。例如，该多肽可以包含具有选自下组的突变的seqidno:1的氨基酸序列、或由其组成，该组由以下组成：(a)l202m；(b)a186d；(c)l202m+t246i+s334t；(d)l202m+t246l+s334t；(e)a51t+l202m+t246i+s334t；(f)l202m+t246v；和(g)l202m+t246v+s334t；其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行氨基酸位置的编号。本发明的一个示例性多肽由seqidno:3的氨基酸序列组成(其中相对于seqidno:1的突变氨基酸标有下划线)。本发明的多肽的制备可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备本发明的多肽，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。定点诱变是在编码亲本α淀粉酶的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的pcr可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见例如，scherer和davis,1979,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和barton等人,1990,nucleicacidsres.[核酸研究]18:7349-4966。还可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；storici等人，2001，naturebiotechnol.[自然生物技术]19:773-776；kren等人，1998，nat.med.[自然医学]4:285-290；以及calissano和macino，1996，fungalgenet.newslett.[真菌遗传学通讯]43:15-16。任何定点诱变程序可用于本发明。存在许多可以用于制备变体的可商购的试剂盒。合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由tian等人(2004，nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由reidhaar-olson和sauer，1988，science[科学]241:53-57；bowie和sauer，1989，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625。其他可以使用的方法包括易错pcr、噬菌体展示(例如lowman等人，1991，biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；wo92/06204)，以及区域定向诱变(derbyshire等人，1986，gene[基因]46:145；ner等人，1988，dna7:127)。诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(ness等人，1999，naturebiotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的dna分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中个体氨基酸残基的重要性。通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合pcr技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，然而还有其他区域可以进行易错pcr或非易错pcr扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。多核苷酸本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸。因此，本发明涉及编码变体多肽的多核苷酸，该变体多肽包含在氨基酸位置202和/或186处(其中根据seqidno:2进行编号)的突变，并且与seqidno:1或2具有至少80％，例如至少85％、至少90％的序列同一性。核酸构建体本发明还涉及包含编码本发明的变体多肽的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。因此，本发明涉及包含编码变体多肽的多核苷酸的核酸构建体，该变体多肽包含在氨基酸位置202和/或186处的突变，其中根据seqidno:2进行编号，并且与seqidno:1或2具有至少80％，例如至少85％、至少90％的序列同一性，该多核苷酸与一种或多种控制序列可操作地连接，该控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是令人希望的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术在本领域是众所周知的。控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢杆菌xyla和xylb基因、苏云金芽孢杆菌cryiiia基因(agaisse和lereclus,1994,molecularmicrobiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(egon等人,1988,gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(daga)和原核β-内酰胺酶基因(villa-kamaroff等人,1978,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(deboer等人,1983,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述在gilbert等人，1980，scientificamerican[科学美国人]242:74-94的“usefulproteinsfromrecombinantbacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在sambrook等人，1989，见上文中。串联启动子的实例披露于wo99/43835中。用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(wo96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、镶片镰孢daria(wo00/56900)、镶片镰孢quinn(wo00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶iv、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶，以及na2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中未翻译的前导子已经被来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(eno-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(gal1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(adh1、adh2/gap)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(tpi)、酿酒酵母金属硫蛋白(cup1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。romanos等人，1992，yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyl)和大肠杆菌核糖体rna(rrnb)。丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素c(cyc1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由romanos等人，1992(见上文)描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。控制序列还可为启动子下游和基因的编码序列上游的mrna稳定子区域，其增加所述基因的表达。适合的mrna稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryiiiabacillusthuringiensiscryiiia基因(wo94/25612)和枯草芽孢杆菌sp82基因(hue等人，1995，journalofbacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。该控制序列也可以是前导子，即对宿主细胞翻译很重要的mrna的非翻译区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5'-末端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉taka淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。用于酵母宿主细胞的合适的前导子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(eno-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(adh2/gap)。该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3'-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mrna上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在guo和sherman，1995，mol.cellularbiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990中得以描述。控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的n-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可以含有对于编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属ncib11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)和枯草芽孢杆菌prsa。另外的信号肽由simonen和palva,1993,microbiologicalreviews[微生物评论]57:109-137描述。用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶v、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉(rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶。用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。romanos等人(1992，见上文)描述了其他有用的信号肽编码序列。所述控制序列还可以是编码位于变体的n-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下酶的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(apre)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt)、嗜热毁丝霉漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的n-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的n-末端。还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用adh2系统或gal1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉takaα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及包含编码本发明的变体多肽的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，本发明涉及重组表达载体，该重组表达载体包含编码变体多肽的多核苷酸(该变体多肽在氨基酸位置202和/或186处包含突变，其中根据seqidno:2进行编号，并且与seqidno:1或2具有至少80％的序列同一性)、启动子、以及转录和翻译终止信号。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在这样的位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，这样使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。重组表达载体可以是可方便地经受重组dna程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合的环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒一起含有待引入到宿主细胞的基因组中的总dna)或转座子。载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1和ura3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)、pyrg(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sc(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpc(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水链霉菌bar基因。载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。对于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码所述变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合的元件应包含足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列一致性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可为在细胞中有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。细菌复制起点的实例是容许在大肠杆菌中复制的质粒pbr322、puc19、pacyc177和pacyc184的复制起点，以及容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pub110、pe194、pta1060和pamβ1。用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ars1、ars4、ars1与cen3的组合、及ars4与cen6的组合。用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是ama1和ans1(gems等人，1991，gene[基因]98:61-67；cullen等人，1987，nucleicacidsres[核酸研究]15:9163-9175；wo00/24883)。可根据wo00/24883中披露的方法完成ama1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。可以通过将序列的至少一个另外的拷贝整合入宿主细胞基因组中或通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因来获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，sambrook等人,1989，同上)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体多肽的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体多肽的产生。因此，本发明涉及重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含编码变体多肽的多核苷酸，该变体多肽在氨基酸位置202和/或186处(其中根据seqidno:2进行编号)包含突变，并且与seqidno:1或2具有至少80％的序列同一性，该多核苷酸可操作地连接至指导变体多肽产生的一种或多种控制序列。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得所述构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(bacillus)、梭菌属(clostridium)、肠球菌属(enterococcus)、土芽孢杆菌属(geobacillus)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(oceanobacillus)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)和链霉菌属(streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属(campylobacter)、大肠杆菌(e.coli)、黄杆菌属(flavobacterium)、梭杆菌属(fusobacterium)、螺杆菌属(helicobacter)、泥杆菌属(ilyobacter)、奈瑟氏菌属(neisseria)、假单胞菌属(pseudomonas)、沙门氏菌属(salmonella)、以及脲原体属(ureaplasma)。细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)以及苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)细胞。细菌宿主细胞还可为任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌(streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(streptococcusuberis)和马链球菌(streptococcusequi)兽瘟(zooepidemicus)亚种细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、以及变铅青链霉菌细胞。将dna引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，chang和cohen,1979,mol.gen.genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，young和spizizen,1961,j.bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或dubnau和davidoff-abelson,1971,j.mol.biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，shigekawa和dower,1988,biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，koehler和thorne,1987,j.bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将dna引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，hanahan,1983,j.mol.biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，dower等人,1988,nucleicacidsres.[核酸研究]16:6127-6145)。将dna引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，gong等人，2004,foliamicrobiol.(praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，mazodier等人，1989，j.bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)或转导(参见例如，burke等人，2001，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将dna引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，choi等人,2006,j.microbiol.methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，pinedo和smets,2005,appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将dna引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，perry和kuramitsu,1981,infect.immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，catt和jollick，1991，microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，buckley等人，1999，appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见，例如，clewell，1981，microbiol.rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将dna引入宿主细胞中的任何方法。宿主细胞还可以是真核生物，如植物、或真菌细胞。宿主细胞可为真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)、和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由hawksworth等人所定义的，在：ainsworthandbisby'sdictionaryofthefungi[ainsworth和bisby的真菌大词典]，第8版，1995，国际cab，universitypress[大学出版社]，剑桥，英国)。真菌宿主细胞可为酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(fungiimperfecti)(芽孢纲(blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如biologyandactivitiesofyeast[酵母的生物学与活性](skinner、passmore和davenport编辑，soc.app.bacteriol.symposiumseries[应用细菌学学会专题论文集]，1980年第9期)所描述那样定义。酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(candida)细胞、汉逊酵母属(hansenula)细胞、克鲁维酵母属(kluyveromyces)细胞、毕赤酵母属(pichia)细胞、酵母菌属(saccharomyces)细胞、裂殖酵母(schizosaccharomyces)或耶罗维亚酵母属(yarrowia)细胞、例如乳酸克鲁弗酵母(kluyveromyceslactis)细胞、卡尔酵母(saccharomycescarlsbergensis)细胞、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)细胞、糖化酵母(saccharomycesdiastaticus)细胞、道格拉氏酵母(saccharomycesdouglasii)细胞、克鲁弗酵母(saccharomyceskluyveri)细胞、诺地酵母(saccharomycesnorbensis)细胞、卵形酵母(saccharomycesoviformis)细胞或解脂耶罗维亚酵母(yarrowialipolytica)细胞。真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(eumycota)和卵菌门(oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由hawksworth等人，1995，见上文)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(trametes)或木霉属细胞。例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(coprinuscinereus)、毛革盖菌(coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢(fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(phlebiaradiata)、刺芹侧耳(pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(trametesvillosa)、变色栓菌(trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于以下文献中：ep238023，yelton等人，1984，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及christensen等人，1988，bio/technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰刀菌属物种的适合方法在malardier等人，1989，gene[基因]78:147-156和wo96/00787中描述。可使用由如以下文献描述的程序转化酵母：becker和guarente，于abelson，j.n.和simon，m.i.编，guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology[酵母遗传学与分子生物学指南]，methodsinenzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(academicpress,inc.)，纽约；ito等人，1983，j.bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及hinnen等人，1978，proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院刊]75:1920。产生方法本发明还涉及产生变体多肽的方法，这些方法包括：(a)在适合于变体多肽的表达的条件下，培养本发明的宿主细胞；和(b)回收该变体多肽。因此，本发明涉及产生变体多肽的方法，该变体多肽在氨基酸位置202和/或186处(其中根据seqidno:2进行编号)包含突变，并且与seqidno:1或2具有至少80％的序列同一性，该方法包括(a)在适合于表达变体多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收该变体多肽。使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。培养是使用本领域已知的程序，在合适营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可以从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。变体可以使用本领域已知的方法检测。适合的检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定变体的α-淀粉酶活性(参见实例)。变体可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从营养培养基中回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过本领域已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦和尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page或提取(参见例如，proteinpurification[蛋白质纯化],janson和ryden编辑,vchpublishers[vch出版社],纽约,1989)。在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。组合物可以将本发明的α-淀粉酶多肽添加至洗涤剂组合物中并且因此使其成为洗涤剂组合物的组分。因此，本发明涉及包含具有α-淀粉酶活性的并且与seqidno:1的亲本多肽相比展现出改进的洗涤性能的多肽的组合物，该变体多肽在氨基酸位置202和/或186处(其中根据seqidno:2进行编号)包含突变并且与seqidno:1或2具有至少80％的序列同一性。因此，本发明的另外的方面提供洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含本发明的多肽和表面活性剂(如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂)。还提供了用于制备此类洗涤剂组合物的浓缩物或添加剂，该浓缩物或添加剂包含本发明的多肽以及任选地表面活性剂。如以下详细讨论的，该洗涤剂组合物可进一步包含选自下组的一种或多种另外的组分，该组由以下组成：氧化剂、漂白活化剂、填充剂、助洗剂、缓冲剂、结构剂、螯合剂、荧光增白剂、消泡剂、酶、香料、抗再沉积剂、皮肤调理剂、柔软剂、乳化剂、和着色剂。在一个实施例中，该组合物是液体或粉末衣物洗涤剂组合物。在另外的实施例中，该组合物是液体或粉末自动餐具洗涤(adw)洗涤剂组合物。例如，可以将本发明的洗涤剂组合物配制成手洗或机洗洗涤剂组合物，包括适于预处理带有污渍的织物的洗衣用添加剂组合物和漂洗中添加的织物软化剂组合物，或配制成用于在一般性的家居硬表面的清洁操作中使用的洗涤剂组合物，或配制成在手或机洗碗操作中使用的洗涤剂组合物。在具体的方面，本发明提供包含本发明的α-淀粉酶多肽的洗涤剂浓缩物/添加剂。该洗涤剂浓缩物/添加剂、连同洗涤剂组合物可以包含一种或多种其他酶，如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解酶，例如另一种α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、cgt酶和/或纤维素酶、甘露聚糖酶(如mannawaytm，来自诺维信公司(novozymes)，丹麦)、果胶酶、果胶裂合酶、角质酶和/或漆酶。一般来说，选定酶的特性应与选择的洗涤剂相容，(即，ph最适，与其它酶和非酶成份等相容)，且该酶应当以有效量存在。蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是衍生自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶novo、枯草杆菌蛋白酶carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(在wo89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)以及在wo89/06270和wo94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。有用的蛋白酶的实例是如wo92/19729、wo98/20115、wo98/20116和wo98/34946所描述的变体，特别是在下述位置中的一个或多个处发生取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。优选的可商购的蛋白酶包括(seqidno:3)、和(来自(诺维信公司(novozymesa/s))、maxacal、purafect(杰能科国际公司(genencorinternationalinc.))。脂肪酶：适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(humicola)(与嗜热丝孢菌属(thermomyces)同义)，例如来自如ep258068和ep305216描述的疏棉状腐质霉(h.lanuginosa)(细毛嗜热霉(t.lanuginosus))或来自如wo96/13580中描述的特异腐质霉(h.insolens)的脂肪酶；假单胞菌属(pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(p.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(p.pseudoalcaligenes)(ep218272)、洋葱假单胞菌(p.cepacia)(ep331376)、施氏假单胞菌(p.stutzeri)(gb1,372,034)、萤光假单胞菌(p.fluorescens)、假单胞菌属物种株系sd705(pseudomonassp.strainsd705)(wo95/06720和wo96/27002)、威斯康星假单胞菌(p.wisconsinensis)(wo96/12012)；芽孢杆菌属(bacillus)脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(b.subtilis)(dartois等人，(1993)，biochemicaetbiophysicaacta[生物化学与生物物理学报]，1131:253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)(jp64/744992)或短小芽孢杆菌(b.pumilus)(wo91/16422)。脂肪酶变体的其他实例例如在wo92/05249、wo94/01541、ep407225、ep260105、wo95/35381、wo96/00292、wo95/30744、wo94/25578、wo95/14783、wo95/22615、wo97/04079以及wo97/07202中描述的那些。优选的可商购的脂肪酶包括lipolase<tm>和lipolaseultra<tm>(诺维信公司(novozymesa/s))。淀粉酶：适合的淀粉酶(α-和/或β-淀粉酶)包含细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于gb1,296,839中)获得的α-淀粉酶。有用的α-淀粉酶的实例是在wo94/02597、wo94/18314、wo96/23873、以及wo97/43424中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位置上具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。可商购的α-淀粉酶是duramyl<tm>、liquezymetm、termamyl<tm>、natalase<tm>、fungamyl<tm>和ban<tm>(诺维信公司(novozymesa/s))、preferenzs100、preferenzs110、preferenzs1000(seqidno:11)、excellenzs110、excellenzs1000、excellenzs2000、rapidase<tm>和purastar<tm>(来自杰能科国际公司(genencorinternationalinc.))。纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在us4,435,307、us5,648,263、us5,691,178、us5,776,757以及wo89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是在ep0495257、ep0531372、wo96/11262、wo96/29397、wo98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在wo94/07998、ep0531315、us5,457,046、us5,686,593、us5,763,254、wo95/24471、wo98/12307以及pct/dk98/00299中描述的那些。可商购的纤维素酶包括和(诺维信公司(novozymesa/s))、和(杰能科国际公司(genencorinternationalinc.))和kac-(花王株式会社(kaocorporation))。过氧化物酵/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(例如来自灰盖鬼伞)的过氧化物酶、及其变体，如在wo93/24618、wo95/10602、以及wo98/15257中描述的那些。可商购的过氧化物酶包括(诺维信公司(novozymesa/s))。可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂(即单独添加剂或组合添加剂)可配制为例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定的液体；或浆液。非尘化的颗粒可以例如如在us4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是具有平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，peg)；具有从16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；具有从12个至20个碳原子并且存在15个至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在gb1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据ep238216中披露的方法制备。本发明的洗涤剂组合物可以呈任何便利的形式，如棒状、片剂、粉、颗粒、糊状或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地包含至多70％的水和0-30％的有机溶剂，或可以是非水性的。所述洗涤剂组合物包括一种或多种表面活性剂，表面活性剂可以是非离子型(包括半极性)和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表面活性剂典型地以按重量计0.1％至60％的水平存在。当包含在其中时，洗涤剂通常将包含约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、a-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。当包含在所述洗涤剂中时，洗涤剂通常包含从约0.2％到约40％的非离子型表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酰胺、或葡糖胺的n-酰基n-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。该洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙二胺三氨基五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐、或层状硅酸盐(例如，来自赫斯特(hoechst)的sks-6)。该洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-n-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗涤剂可以含有漂白系统，其可以包含h2o2源，例如过硼酸或过碳酸，其可以与形成过酸的漂白活化剂(例如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐)组合。可替代地，漂白系统可以包含过酸，例如酰胺、亚胺或砜类型的过酸。可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如wo92/19709和wo92/19708中所描述配制该组合物。该洗涤剂还可以包含其他的常规洗涤剂成分，像例如织物调理剂，这些织物调理剂包括粘土、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂、或香料。目前期望在洗涤剂组合物中加入任何酶，特别是本发明的α淀粉酶多肽，添加量相当于每升洗涤液添加0.01mg-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液加0.05mg-5mg酶蛋白，特别优选每升洗涤液加0.1mg-1mg酶蛋白。另外，本发明的α淀粉酶多肽可以掺入wo2006/002643(将其通过引用结合在此)中所披露的洗涤剂配制品中。本发明的餐具洗涤剂组合物的实例可以将本发明的α-淀粉酶多肽用于包括以下的餐具洗涤剂组合物中：(a)粉末自动餐具洗涤组合物(b)粉末自动餐具洗涤组合物(c)粉末自动餐具洗涤组合物(d)粉末自动餐具洗涤组合物(e)粉末自动餐具洗涤组合物(f)具有清洗表面活性剂系统的粉末和液体餐具洗涤组合物(g)非水性液体自动餐具洗涤组合物(h)非水性液体餐具洗涤组合物(i)触变的液体自动餐具洗涤组合物(j)液体自动餐具洗涤组合物(k)含有保护的漂白剂颗粒的液体自动餐具洗涤剂组合物(l)如在(a)、(b)、(c)、(d)、(f)和(j)中描述的自动餐具洗涤组合物，其中用过碳酸盐替换过硼酸盐。(m)如在(a)至(f)中描述的自动餐具洗涤组合物，其另外地包含锰催化剂。锰催化剂可以例如是以下中描述的化合物之一："efficientmanganesecatalystsforlow-temperaturebleaching[用于低温漂白的高效锰催化剂]",nature[自然]369,1994,第637-639页。用途本发明还针对将本发明的α-淀粉酶多肽用于洗涤剂(特别是衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物)中的方法。因此，本发明涉及使用具有α-淀粉酶活性的并且与seqidno:1的亲本多肽相比展现出改进的洗涤性能的多肽的方法，该多肽在氨基酸位置202和/或186处(其中根据seqidno:2进行编号)包含突变并且与seqidno:1或2具有至少80％的序列同一性。因此，本发明提供本发明的α-淀粉酶多肽或组合物在家庭或工业清洗过程中的用途。在一个实施例中，该用途是织物的清洗，例如衣物洗涤。在另一个实施例中，该用途是陶瓷、塑料或玻璃材料的清洗，例如餐具洗涤。因此，本发明的α-淀粉酶多肽可用作洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁洗涤剂组合物(在家庭或工业环境中)的组分。本发明的α-淀粉酶变体具有允许各种其他工业应用的宝贵特性。例如，本发明的α-淀粉酶多肽可以用于淀粉过程，特别是淀粉转化，尤其是淀粉的液化(参见，例如us3,912,590、欧洲专利申请号252730和63909、wo99/19467、和wo96/28567，所有参考文献通过引用结合在此)。还涵盖用于淀粉转化目的组合物，除了本发明的变体以外，这些组合物还可包含葡糖淀粉酶、支链淀粉酶以及其他α-淀粉酶。此外，本发明α-淀粉酶变体也特别适用于从淀粉或全谷粒中生产甜味剂以及乙醇(参见，例如，美国专利号5,231,017，通过引用结合在此)，如燃料乙醇、饮用乙醇以及工业乙醇。本发明的α-淀粉酶变体还用于纺织品、织物和服装的退浆(参见，例如wo95/21247、美国专利4,643,736、ep119,920，通过引用结合在此)、啤酒制造或酿造、纸浆和纸张生产。淀粉转化常规的淀粉转化过程(例如液化和糖化过程)例如在美国专利3,912,590和欧洲专利公开号252,730和63,909中进行了描述，通过引用结合在此。在一个实施例中，淀粉转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，该方法包括脱支步骤。当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程可以由例如预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所需最终产物，任选地异构化过程。(i)天然淀粉的预处理天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在此“糊化(gelatinization)”过程中，粘度有显著地增加。由于典型工业方法中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被操作。如今主要是通过酶降解而获得粘度的降低。(ii)液化在液化步骤中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及直链的较短单元(麦芽糊精)。液化过程在105℃-110℃进行5至10分钟，随后在95℃进行1-2小时。ph值在5.5和6.2之间。为了确保在这些条件下最佳的酶稳定性，添加1mm钙(40ppm游离的钙离子)。在这个处理之后，液化的淀粉将具有10-15的“右旋糖当量”(de)。(iii)糖化在液化过程之后，通过添加葡糖淀粉酶(例如amg)和脱支酶(如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶(例如promozymetm)美国专利号4,560,651)将麦芽糖糊精转化为右旋糖。在该步骤之前，将ph降低至低于4.5的值，维持高温(高于95℃)以使液化α-淀粉酶失活以减少称为“潘糖前体”的短寡糖的形成，该短寡糖不能被脱支酶适当地水解酶。将温度降至60℃，并添加葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化过程进行24-72小时。通常，在液化步骤后使α-淀粉酶变性时，约0.2％-0.5％的糖化产物是不能被支链淀粉酶降解的支化三糖6<2>-α-葡糖基麦芽糖(潘糖)。如果在糖化过程中存在来自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，则该水平可以高达1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。(iv)异构化当所希望的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可被转化为果糖。糖化过程之后，将ph值增加至6-8范围内的值，优选地ph7.5，并且通过离子交换去除钙。然后，使用例如固定化葡糖异构酶(如sweetzyme<tm>it)将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。乙醇生产总体上，从全谷粒来生产醇(乙醇)可分成4个主要步骤-研磨-液化-糖化-发酵(i)研磨谷粒经过研磨以便打开结构并且允许进一步处理。所使用的两个过程是湿式或干式研磨。在干式研磨中，将完整谷粒研磨并且用于该过程的其余部分中。湿式研磨可很好地分离胚芽(germ)和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)，除少数情况外湿式研磨在平行生产糖浆时的多个位置使用。(ii)液化在液化过程中，淀粉颗粒通过水解来溶解成dp大部分高于4的麦芽糊精。水解可通过酸处理来执行或由α-淀粉酶来酶法执行。酸水解有限地使用。原材料可以是研磨的全谷粒或来自淀粉处理的侧流。酶法液化典型地以三步热浆液方法进行。浆液加热至60℃-95℃(优选地，80℃-85℃)之间，并且添加一种或多种酶。然后将浆液在95℃-140℃(优选地，105℃-125℃)之间喷射蒸煮、冷却至60℃-95℃并且添加更多酶以获得最终水解。液化方法在ph4.5-6.5、典型地在5与6之间的ph进行。研磨并且液化的谷粒又称为醪液(mash)。(iii)糖化为了生产可被酵母代谢的低分子糖dp1-3，液化过程中的麦芽糖糊精必须进一步水解。典型地通过葡糖淀粉酶进行酶水解，可替代地，可以使用α-葡糖苷酶或酸性α-淀粉酶。全糖化步骤可以持续72小时，然而，通常只进行典型的40-90分钟的预糖化，并且然后在发酵期间完成糖化(ssf)。糖化典型地在从30℃-65℃、典型地约60℃的温度下并在ph4.5下进行。(iv)发酵将典型地来自酵母属的酵母添加至醪液中并且发酵持续24-96小时，如典型地35-60小时。温度在26℃-34℃之间，典型地在约32℃，并且ph是从ph3-6，优选地，约ph4-5。请注意，最广泛使用的过程是同步糖化和发酵(ssf)过程，其中没有糖化的持续阶段，这意味着酵母和酶添加在一起。在进行ssf时，通常在发酵之前在高于50℃的温度下引入预糖化步骤。(v)蒸馏发酵后，将醪液蒸馏以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或工业乙醇。(vi)副产品来自发酵的剩余物是酒糟，它典型地用于液体或干燥形式的动物饲料。关于如何完成液化、糖化、发酵、蒸馏以及回收乙醇的进一步细节是本领域技术人员熟知的。根据本发明的方法，糖化以及发酵可同时或单独地执行。纸浆以及纸张生产本发明的碱性α-淀粉酶多肽还可用于从淀粉增强废纸以及纸板来生产木质纤维素材料如纸浆、纸张以及纸板，尤其当再浆化在高于7的ph下发生以及当淀粉酶经由增强淀粉的降解来促进废弃材料的分解时。本发明的α-淀粉酶尤其适用于从淀粉包衣的印刷纸来生产造纸纸浆的过程。该工艺可如wo95/14807描述来执行，包括以下步骤：a)使纸张分解以产生纸浆，b)在步骤a)之前、期间或之后用淀粉降解酶进行处理，并且c)在步骤a)和b)之后，从纸浆中分离油墨颗粒。本发明的α-淀粉酶还可非常适用于对淀粉进行改性，其中酶改性的淀粉与碱性填充剂如碳酸钙、高岭土以及粘土一起用于造纸。用本发明的碱性α-淀粉酶有可能在填充剂存在下将淀粉改性，从而允许一种更简单的整合过程。纺织品、织物以及服饰的退浆本发明的α-淀粉酶在纺织品，织物或衣服脱浆中也非常有用。在纺织加工工业中，传统上使用α-淀粉酶作为脱浆过程中的助剂，以促进在织造过程中作为纬纱上的保护涂层的含淀粉胶料的去除。织造之后彻底去除胶料涂层对于确保后续过程(其中所述织物被擦洗、漂白和染色)中的最佳效果是至关重要的。酶法淀粉分解是优选的，因为它不对纤维材料产生任何有害的作用。为了减少加工成本并增加研磨机处理量，有时将脱浆过程与擦洗和漂白步骤结合。在这类情况下，非酶助剂如碱或氧化剂典型用于分解淀粉，因为传统α-淀粉酶并不与高ph水平以及漂白剂非常相容。由于使用具有相当腐蚀性的化学品，因此淀粉胶料的非酶分解导致一些纤维损伤。因此，希望使用本发明的α-淀粉酶，因为它们在碱性溶液中具有改进的性能。在使含纤维素的织物或纺织品脱浆时，α-淀粉酶可单独或与纤维素酶组合使用。退浆以及漂白过程在本领域中是熟知的。例如，这类工艺描述于例如wo95/21247、美国专利4,643,736、ep119,920(通过引用结合在此)中。用于退浆的可商购的产品包括和ultra(来自诺维信公司(novozymesa/s))。啤酒制造本发明的α-淀粉酶在啤酒制造工艺中也可以是非常有用的；在醪液形成(mashing)工艺期间，典型地添加α-淀粉酶。通过以下实例进一步描述本发明，所述实例不应理解为对本发明的范围进行限制。本申请中描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在说明本发明的若干方面。任何等同方面意欲在本发明的范围之内。实际上，除了在此所示和描述的那些之外，对于本领域的技术人员而言本发明的各种修改将从前述的说明书变得显而易见。这样的修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露内容为准。实例实例1：如seqidno:1中所示的亲本多肽的构建具有seqidno:1所示氨基酸序列(亲本多肽)的多肽的构建已描述于(wo2006/002643)中。该多肽是经修饰的α-淀粉酶(ec3.2.1.1)，该α-淀粉酶属于糖苷水解酶gh13家族，亚家族5。实例2：根据本发明的变体的产生已通过定点诱变产生本发明的变体。使用由在pel基因座处含有淀粉酶基因的有机体制备的基因组dna作为用于产生定点突变体的模板。使用正向诱变引物和lbei1303(5'-caatccaagagaaccctgatacggatg-3'-seqidno:4)反向诱变引物产生约2.4-3.8kb片段。该片段与lbei1302(gatgtatacgtcttagctcacgacgatgac-seqidno:5)正向引物一起用作大引物，得到6.1kb插入盒。为了通过转化时的双交换实现在pel基因座中的整合，连同淀粉酶和cat基因，该盒在末端包含上游和下游pel序列。在含有氯霉素的lb琼脂上进行选择，并且通过淀粉酶基因的dna测序确认突变。产生变体的文库，其中在以下位置进行改变的不同组合：seqidno:2的a51、a186、l202、t246、和s334。产生的变体由具有选自下组的突变的seqidno:1的氨基酸序列组成，该组由以下组成：(a)l202m；(b)a186d；(c)l202m+t246i+s334t；(d)l202m+t246l+s334t；(e)a51t+l202m+t246i+s334t；(f)l202m+t246v；和(g)l202m+t246v+s334t；其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行氨基酸位置的编号。实例3：使用测定产生的变体的性能为了评估缓冲液中变体的淀粉酶活性，使用(生命技术公司(lifetechnologies)，目录号e33651)在提供的测定缓冲液中进行测定实验。将表达变体的枯草芽孢杆菌转化体接种于1ml合适的培养基中，并在37℃下生长3天。将培养物以1013g离心10min，并分离上清液并储存在-18℃。使用针对兔中的stainzymeplus产生的多克隆抗体(ab83)归一化变体酶。将ab83在硫酸铵中沉淀并以31.57mg/ml重新溶解于pbst缓冲液(10mm磷酸盐缓冲液ph7.4、2.7mmkcl、140mmnacl、0.05％20)+0.02％硫柳汞中。将ab83在pbs缓冲液(10mm磷酸盐缓冲液ph7.4、2.7mmkcl、140mmnacl)中稀释约2000倍至大约15μg/ml。maxisorp微量滴定板(mtp)(nunc，目录号44-2404-21)在室温和800rpm下用100μl稀释的抗体溶液涂覆1h。弃去抗体溶液，并用3x200μlpbst缓冲液洗涤mtp。将每种转化体的上清液在pbst缓冲液中稀释10倍，并将100μl一式四份添加到mtp中。将stainzymeplus用作参考，并遵循与测试的变体相同的程序。在测定缓冲液中用获得的变体与参考的相对活性列于表1。表1本发明的示例性淀粉酶多肽的淀粉酶活性淀粉酶相对活性参考(seqidno:1)1.00seqidno:1+l202m1.03seqidno:1+a186d1.02seqidno:1+l202m+t246i+s334t1.09seqidno:1+l202m+t264l+s334t1.14seqidno:1+a51t+l202m+t246i+s334t1.17seqidno:1+l202m+t246v1.09seqidno:1+l202m+t246v+s334t1.02如表1示出的，淀粉酶至少在与亲本多肽相同的水平上清楚地证明了α-淀粉酶活性。实例4：α-淀粉酶活性的替代性测定1.phadebas测定通过采用片剂作为底物的方法可以确定α-淀粉酶活性。phadebas片剂(淀粉酶测试物(amylasetest)，由法玛西亚诊断公司(pharmaciadiagnostic)提供)包含交联的不溶性蓝色淀粉聚合物，它已与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并压片。对于每一单次测量，将一片悬浮于包含5ml50mm伯瑞坦-罗宾森(britton-robinson)缓冲液(50mm乙酸，50mm磷酸，50mm硼酸，0.1mmcacl2，用naoh调节ph至感兴趣的值)的管中。于感兴趣的温度下在水浴中进行该测试。在xml的50mm伯瑞坦-罗宾森缓冲液中稀释待测试的α-淀粉酶。将1ml此α-淀粉酶溶液添加至5ml50mm伯瑞坦-罗宾森缓冲液中。通过α-淀粉酶水解淀粉，从而给出可溶性蓝色片段。在620nm处用分光光度计测量所得到的蓝色溶液的吸光度，其是α-淀粉活性的函数。重要的是在10或15分钟的孵育(测试时间)后测量的620nm吸光度在620nm的0.2-2.0的吸光度单位的范围内。在此吸光度范围内，在活性和吸光度之间存在线性关系(朗伯-比尔(lambert-beer)定律)。因此，必须调节酶的稀释以适合该标准。在一组指定的条件(温度、ph、反应时间、缓冲液条件)下，1mg给定的α-淀粉酶将水解某一量的底物并将产生蓝色。在620nm测量颜色强度。在给定组的条件下，所测量的吸光度与α-淀粉酶的比活性(纯的α-淀粉酶蛋白的每毫克活性)成正比。2.pnp-g7测定α-淀粉酶活性通过采用pnp-g7底物的方法来确定。pnp-g7是对硝基苯基-α,d-麦芽庚糖苷的缩写，它是可以由内切淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶消化底物以释放自由pnp分子，该分子具有黄色并且因而可以通过可见分光光度法在λ＝405nm(400nm-420nm)下测量。含有pnp-g7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由勃林格-曼海姆公司(bohringer-mannheim)制造(目录号1054635)。为了制备试剂溶液，将10ml底物/缓冲溶液添加至由制造商推荐的50ml酶/缓冲溶液中。通过将20μl样品转移至96孔微量滴定板并在25℃孵育来进行测定。添加预平衡至25℃的200μl试剂溶液。将溶液混合并预孵育1分钟，并在elisa读取器中在od405nm处每隔30秒经4分钟测量吸光度。在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率与所讨论的α-淀粉酶的活性成正比例。实例5：使用自动餐具洗涤(adw)评估本发明的α-淀粉酶多肽的洗涤性能为了评估本发明的多肽在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可以使用全规模自动餐具洗涤(adw)进行洗涤实验。全规模adw装备用于测试模拟常规消费者装备的测试条件下多肽的洗涤性能。在本研究中，测试条件是使用mieledishwashermieleg4300scu机器的常规50℃洗涤程序和短40℃程序。洗涤性能总体描述。按照如下说明，将用淀粉玷污的三聚氰胺瓷砖(来自测试材料中心bv(邮箱120，3133kt，弗拉尔丁恩，荷兰)的cs-28)用作测试材料，并使用7.68°dh的水在40℃和50℃下在设定程序下进行洗涤。机器程序开始后3分钟，添加15.53g/洗涤的洗涤剂、如下所述的p&g混合洗涤剂、和浓度为2.55mg酶/洗涤或5.12mg酶/洗涤的本发明的淀粉酶多肽。在流动自来水下彻底漂洗并在黑暗中干燥后，随后评估污染的瓷砖的光反射值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/l的测试用作空白并且对应于来自单独洗涤剂的贡献。全规模洗涤性能实验在下面指定的实验条件下进行：表2实验条件表3adw洗涤剂组分克活性材料固体成分碳酸钠4.00mgda6.00过碳酸钠2.00磺化聚合物1.20漂白催化剂0.009杂项平衡至15.53液体成分lutensolto71.165lf2240.5826杂项平衡至1.8mgda由basf提供的三钠甲基甘氨酸二乙酸酯漂白催化剂五胺乙酸钴(iii)硝酸盐lf224basf提供的非离子表面活性剂磺化聚合物陶氏化学公司(dowchemicals)提供的acusol588lutensolto7basf提供的非离子表面活性剂通过将自来水和去离子水混合到测试系统将水硬度调节至7.68°dh。在洗涤之后，将三聚氰胺瓷砖用自来水洗并干燥。将洗涤性能作为反射差来测量。使用用于获取光谱和进行反射差和/或色差计算的color-eye7000(ce7000)进行反射值测量。在460nm处(发光体中没有uv光)测量反射值。将本实验的术语“改进的洗涤性能”定义为显示改变，这种改变是指本发明的变体的洗涤性能相对于具有如seqidno:1所阐述的氨基酸序列的多肽的洗涤性能的改变,这种改变可以(例如)被视为增加的污渍去除。如上所述确定改进的洗涤性能。如果改进因子(if)在以上列出的一种或多种条件(即在40℃或50℃)下至少为1.0，优选地至少为1.2，则洗涤性能被认为得到了改进；。通过全规模洗涤获得的根据本发明的变体的洗涤性能如下；表4本发明的示例性多肽的adw改进因子*其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行编号*其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行编号实例6：使用自动机械应力测定(amsa)评估本发明的α-淀粉酶多肽的洗涤性能为了评定本发明的变体在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可以使用自动机械应力测定(amsa)进行洗涤实验。使用amsa测试，可以检查大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。amsa盘具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的纺织品小块布样或三聚氰胺瓷砖对所有缝开口强力挤压。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品/三聚氰胺瓷砖和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品/三聚氰胺瓷砖接触并以规则、周期性振荡方式施加机械应力。关于进一步描述，参见wo02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。洗涤性能总体描述制备包含水(7.68°dh)、2.88g/l洗涤剂、如上所述的p&g混合洗涤剂、和本发明的酶的测试溶液，其浓度如表8、9、和10中所列。添加被淀粉玷污的织物三聚氰胺瓷砖(来自测试材料中心bv的cs-28和dm-277，邮政信箱120，3133kt，弗拉尔丁恩，荷兰)并且将他们在40℃和50℃洗涤10或20分钟，如下文说明。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的织物的光强度值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/l的测试用作空白并且对应于来自洗涤剂的贡献。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物和瓷砖一起振摇、转动或搅拌的形式施加。amsa洗涤性能实验在以下详细说明的实验条件下进行：表5实验条件表6adw洗涤剂组分克活性材料固体成分碳酸钠4.00mgda6.00过碳酸钠2.00磺化聚合物1.20漂白催化剂0.009杂项平衡至15.53液体成分lutensolto71.165lf2240.5826杂项平衡至1.8mgda由basf提供的三钠甲基甘氨酸二乙酸酯漂白催化剂五胺乙酸钴(iii)硝酸盐lf224basf提供的非离子表面活性剂磺化聚合物陶氏化学公司(dowchemicals)提供的acusol588lutensolto7basf提供的非离子表面活性剂通过向测试系统添加cacl2、mgcl2和nahco3(ca2+:mg2+:hco3-＝2:1:4.5)，将水硬度调节至7.68°dh。在洗涤之后，将织物和三聚氰胺瓷砖用自来水冲洗并干燥。洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品被沾污时，其反射光的强度低于干净样品的反射光强度。因此，反射光的强度可以用来衡量洗涤性能。使用专业平板扫描仪(epsonexpression10000xl,epson)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。为了从扫描图像中提取光强度的值，将来自图像的4824位彩色像素值转化为红色、绿色和蓝色(rgb)的值。通过将rgb值作为向量进行加和并且然后取所得向量的长度来计算强度值(int)：通过amsa获得的根据本发明的变体的洗涤性能如下；对于下面的每个条件，该值是用4种不同酶剂量测量的性能改进因子的平均值。表7平均amsa性能改进因子(if)*其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行编号洗涤剂：p&gadw混合物1temp＝如所示cs28：纺织品dm277：有大米和玉米淀粉的混合物的瓷砖表8amsa数据集i(40℃-10分钟-cs28)*其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行编号表9amsa数据集ii(50℃-20分钟-cs28)*其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行编号表10amsa数据集iii(40℃-10分钟-dm277)*其中根据seqidno:2中所示的氨基酸序列进行编号序列表<110>诺维信公司<120>α-淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸<130>13192-wo-pct<160>5<170>patentin版本3.5<210>1<211>483<212>prt<213>枯草芽孢杆菌<400>1hishisasnglythrasnglythrleumetglntyrpheglutrptyr151015leuproasnaspglyasnhistrpasnargleuargseraspalaser202530asnleulysasplysglyileseralavaltrpileproproalatrp354045lysglyalaserglnasnaspvalglytyrglyalatyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrileargthrlystyrgly65707580thrargasnglnleuglnalaalavalasnalaleulysserasngly859095ileglnvaltyrglyaspvalvalmetasnhislysglyglyalaasp100105110alathrglumetvallysalavalgluvalasnproasnasnargasn115120125glngluvalserglyglutyrthrileglualatrpthrlyspheasp130135140pheproglyargalaasnthrhisserasnphelystrpargtrptyr145150155160hispheaspglyvalasptrpaspglnserarglysleuasnasnarg165170175iletyrlyspheargthrlysalatrpasptrpgluvalaspthrglu180185190pheglyasntyrasptyrleuleutyralaaspileaspmetasphis195200205progluvalvalasngluleuargasntrpglyvaltrptyrthrasn210215220thrleuglyleuaspglypheargileaspalavallyshisilelys225230235240tyrserphethrargasptrpileasnhisvalargseralailegly245250255lysasnmetphealavalalagluphetrplysasnaspleuglyala260265270ilegluasntyrleuasnlysthrasntrpasnhisservalpheasp275280285valproleuhispheasnleutyrtyralaserlysserglyglyasn290295300tyraspmetargglnilepheasnglythrvalvalglnlyshispro305310315320thrhisalavalthrphevalaspasnhisaspserglnprogluglu325330335serleugluserphevalargglutrpphelysproleualatyrala340345350leuthrleuthrarggluglnglytyrproservalphetyrglyasp355360365tyrtyrglyileprothrhisglyvalproalametlysserlysile370375380aspproileleuglualaargglnlystyralatyrglyargglnasn385390395400asptyrleuasphishisasnileileglytrpthrarggluglyasn405410415thralahisproasnserglyleualathrilemetseraspglyala420425430glyglyasnlystrpmetphevalglyargasnlysalaglyglnval435440445trpthraspilethrglyasnlysalaglythrvalthrileasnala450455460aspglytrpglyasnpheservalasnglyglyservalseriletrp465470475480valasnlys<210>2<211>485<212>prt<213>枯草芽孢杆菌<400>2hishisasnglythrasnglythrmetmetglntyrpheglutrptyr151015leuproasnaspglyasnhistrpasnargleuargseraspalaser202530asnleulysasplysglyileseralavaltrpileproproalatrp354045lysglyalaserglnasnaspvalglytyrglyalatyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrileargthrlystyrgly65707580thrargasnglnleuglnalaalavalasnalaleulysserasngly859095ileglnvaltyrglyaspvalvalmetasnhislysglyglyalaasp100105110alathrglumetvalargalavalgluvalasnproasnasnargasn115120125glngluvalserglyglutyrthrileglualatrpthrlyspheasp130135140pheproglyargglyasnthrhisserasnphelystrpargtrptyr145150155160hispheaspglyvalasptrpaspglnserarglysleuasnasnarg165170175iletyrlyspheargglyaspglylysglytrpasptrpgluvalasp180185190thrgluasnglyasntyrasptyrleumettyralaaspileaspmet195200205asphisprogluvalvalasngluleuargasntrpglyvaltrptyr210215220thrasnthrleuglyleuaspglypheargileaspalavallyshis225230235240ilelystyrserphethrargasptrpileasnhisvalargserala245250255thrglylysasnmetphealavalalagluphetrplysasnaspleu260265270glyalailegluasntyrleuasnlysthrasntrpasnhisserval275280285pheaspvalproleuhistyrasnleutyrasnalaserlyssergly290295300glyasntyraspmetargglnilepheasnglythrvalvalglnarg305310315320hispromethisalavalthrphevalaspasnhisaspserglnpro325330335gluglualaleugluserphevalgluglutrpphelysproleuala340345350tyralaleuthrleuthrarggluglnglytyrproservalphetyr355360365glyasptyrtyrglyileprothrhisglyvalproalametlysser37037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