用于纯化和激活肉毒杆菌神经毒素的方法与流程
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序列表
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本发明涉及神经毒素的治疗用途领域。
背景技术：
肉毒杆菌神经毒素(botulinumneurotoxin)(bont)是人类已知的毒性最大的物质。已经鉴定出bont的七种血清型(a-g)；每种血清型内都有许多亚型。bont是由细菌肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)的不同菌株产生的约150kda蛋白质(montal2010)。这些毒素导致动物肉毒杆菌中毒，这是一种严重的神经系统疾病，表现为极度弛缓性麻痹和可能的死亡。这种毒性的分子基础在于bont结合并进入运动神经元并且将其酶促结构域释放到胞质溶胶中的能力，所述酶促结构域裂解负责神经肌肉接头(nmj)处的突触囊泡融合的细胞机制，并通过阻断乙酰胆碱释放来抑制神经传递。
bont的神经抑制功能被探究作为许多肌肉病症的治疗策略，从斜视到控制多发性肌张力障碍(masuyer等人2014)，更不用说bont(a)的用于诱导面部肌肉的弛缓性麻痹以抚平皱纹的化妆品用途急剧增加。bont的市场接近20亿美元并且仍在快速增长。
目前在bont产品中存在若干挑战。bont需要在细菌中产生并从细菌裂解物中分离。目前的治疗性bont仍然使用类似于源于50年前的那些方法的老方法生产和分离，在50年之前描述了第一批实验室制备的bont/a(bonventre和kempe1959；pickett2014)。这些方法通常涉及对产生这些毒素的天然细菌菌株(孢子形成梭菌菌株)的长期孵育/发酵和许多随后的劳动密集型色谱步骤。除了工程和封闭挑战之外，这些方法还可能损害bont制剂的最终产率、功效和再现性。
近年来已经探究了由工业中用于蛋白质生产的常见宿主系统(诸如大肠杆菌和昆虫细胞)重组表达bont。通常将亲和标签(诸如his-6(seqidno:1)或gst)与bont融合以有利于通过亲和纯化进行的纯化。尽管用亲和标签分离重组bont简化了纯化步骤，但它引入了新的问题。标签可能不利地影响毒素的生物活性和/或具有不期望的抗原性。因此，必须在纯化后除去标签，其涉及额外的酶处理和纯化步骤。此外，通常存在从裂解标签留下的附着到毒素的其他残基，产生非天然的n-或c-末端，其可影响患者中的活性或促进患者中的免疫学结果。
对天然形式的bont的分离是非常优选的，但仍然是劳动和时间密集型过程。
纯化的bont必须在使用前通过有限的蛋白水解进一步激活。重组bont通常通过与蛋白内切酶(诸如胰蛋白酶)一起孵育而在纯化后激活。这种激活可引起非特异性降解，并且需要额外的纯化步骤以除去激活蛋白内切酶，这两者都会损害毒素活性和产率。
技术实现要素：
对于阅读本公开的本领域技术人员显而易见的是，本发明涵盖对用于生产、纯化和/或激活肉毒杆菌神经毒素(bont)或其部分或片段的组合物和方法的问题的认识。尤其是，本发明鉴定了提供有利于具有所需特征(例如，相对未损害的生物活性；不期望的抗原性的有限引入；有限的污染物，诸如不期望的蛋白内切酶和/或降解产物；以及所需bont的高质量、效力和/或再现性)的bont的生产、纯化和/或激活，同时减少现有方法的限制(例如，有限的生产效率、耗时和/或费力的步骤和/或恶劣的条件)的材料和程序的挑战。
本发明的一方面涉及分子，其包含与异源亲和部分共价连接的非毒非血凝素(ntnha)多肽。在一个实施方案中，ntnha和亲和部分表达为融合蛋白。在本文公开的组合物的一个实施方案中，亲和部分位于选自由以下项组成的组的位置处：ntnha氨基酸序列的n末端、ntnha氨基酸序列的c末端和在ntnha氨基酸序列的内部。在本文公开的组合物的一个实施方案中，亲和部分在约ph6至约ph8的条件下有效结合结合靶标。在本文公开的组合物的一个实施方案中，亲和部分选自由以下项组成的组：谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、c-myc标签、几丁质结合结构域、链霉亲和素结合蛋白(sbp)、纤维素结合结构域、钙调蛋白结合肽、s标签、strep标签ii、fla、蛋白a、蛋白g、组氨酸亲和标签(hat)、多聚组氨酸和麦芽糖结合蛋白(mbp)。在本文公开的组合物的一个实施方案中，ntnha来自血清型a、b、c1、d、e、f或g。在本文公开的组合物的一个实施方案中，ntnha来自血清型b。在本文公开的组合物的一个实施方案中，所述分子与相容的肉毒杆菌神经毒素(bont)或包含其受体结合结构域的多肽处于复合体中。在本文公开的组合物的一个实施方案中，bont或多肽包含肉毒梭菌血清型b(b-hc)的经修饰的受体结合结构域。在本文公开的组合物的一个实施方案中，所述分子通过亲和部分进一步与结合靶标结合。在本文公开的组合物的一个实施方案中，结合靶标稳定地附着到基质。
本发明的另一方面涉及包含本文所述分子中的一种的水溶液。
本发明的另一方面涉及编码本文所述的功能性ntnha和亲和部分融合蛋白中的一种的核酸。
本发明的另一方面涉及表达载体，其包含编码本文所述的功能性ntnha和亲和部分融合蛋白中的一种的核酸。
本发明的另一方面涉及宿主细胞，其包含并表达编码本文所述的功能性ntnha和亲和部分融合蛋白中的一种的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞还表达相容的肉毒杆菌神经毒素(bont)。在本文所述宿主细胞的一个实施方案中，bont包含肉毒梭菌血清型b(b-hc)的经修饰的受体结合结构域。在本文所述宿主细胞的一个实施方案中，宿主细胞是原核的或真核的。
在本文所述宿主细胞的一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或两栖动物细胞。
本发明的另一方面涉及纯化肉毒杆菌神经毒素(bont)的方法，其包括使bont与相容的非毒非血凝素(ntnha)在适于ntnha与bont结合的条件下接触，从而形成ntnha-bont复合体。在一个实施方案中，bont处于溶液中，并且ntnha附着到基质，由此使溶液与基质接触，从而使bont与ntnha接触。在本文所述方法的一个实施方案中，所述方法还包括洗涤基质从而除去未结合的物质，并且通过使基质与将bont从ntnha-bont复合体解离的水溶液接触来从基质中洗脱bont。在本文所述方法的一个替代实施方案中，在使bont溶液与ntnha基质接触后，所述方法还包括洗涤基质从而除去未结合的物质；在保持ntnha-bont复合体并且适于裂解ntnha-bont复合体内的bont的条件下使基质与蛋白酶接触；洗涤基质从而除去蛋白酶和未结合的物质；并且通过使基质与将bont从ntnha-bont复合体解离的水溶液接触来从基质中洗脱bont。在本文所述方法的一个实施方案中，ntnha与亲和部分共价连接，基质与亲和部分的结合靶标连接，并且通过亲和部分和结合靶标的相互作用使ntnha与基质非共价结合。在本文所述方法的一个实施方案中，ntnha与基质共价连接。在本文所述方法的一个实施方案中，bont包含肉毒梭菌血清型b(b-hc)的经修饰的受体结合结构域。在本文所述方法的一个实施方案中，将bont从ntnha-bont复合体解离的水溶液具有≥7.5的ph。在本文所述方法的一个实施方案中，包含bont的溶液是来自表达bont的细胞的澄清细胞提取物。在本文所述方法的一个实施方案中，澄清细胞提取物还包含1mm的苯甲基磺酰氟(pmsf)。在本文所述方法的一个实施方案中，适于结合的条件包括在具有生理离子强度和<7.5ph的结合缓冲液的背景下使bont接触。在本文所述方法的一个实施方案中，洗涤是用具有生理离子强度和<7.5ph的洗涤缓冲液。在本文所述方法的一个实施方案中，结合缓冲液和/或洗涤缓冲液在100-200mmkcl或nacl之间。在本文所述方法的一个实施方案中，结合缓冲液和/或洗涤缓冲液具有约6的ph。在本文所述方法的一个实施方案中，结合缓冲液和/或洗涤缓冲液包含50mmmes，150mmnacl，ph6。在本文所述方法的一个实施方案中，将bont从ntnha-bont复合体解离的水溶液是约50mmtris，150mmnacl的洗脱缓冲液。在本文所述方法的一个实施方案中，水溶液是约ph8的洗脱缓冲液。在本文所述方法的一个实施方案中，亲和部分选自由以下项组成的组：谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、c-myc标签、几丁质结合结构域、链霉亲和素结合蛋白(sbp)、纤维素结合结构域、钙调蛋白结合肽、s标签、strep标签ii、fla、蛋白a、蛋白g、组氨酸亲和标签(hat)、多聚组氨酸和麦芽糖结合蛋白(mbp)。
在本文所述方法的一个实施方案中，亲和部分是gst，并且结合靶标是谷胱甘肽。
在本文所述方法的一个实施方案中，ntnha以与bont约1:1至约10:1的，例如与bont约2:1、3:1、4:1或5:1的摩尔比存在。在本文所述方法的一个实施方案中，bont和ntnha在相同的宿主细胞(例如大肠杆菌)中共表达。在本文所述方法的一个实施方案中，bont和ntnha在不同的宿主细胞中表达。在本文所述方法的一个实施方案中，bont以重组方式在异源宿主细胞诸如大肠杆菌中产生。在本文所述方法的一个实施方案中，bont在其天然梭菌细胞中产生。在本文所述方法的一个实施方案中，ntnha以重组方式在异源宿主细胞诸如大肠杆菌中产生。在本文所述方法的一个实施方案中，ntnha在其天然梭菌细胞中产生。
在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、lys-c蛋白内切酶、lys-n蛋白内切酶、精氨酰肽链内切酶、纤溶酶、omptin和如ep2524963中所述的梭菌蛋白酶。在优选的实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶或lys-c蛋白内切酶。在一个实施方案中，蛋白酶是裂解bont非天然(即外源性)裂解位点的蛋白酶。在此类梭菌毒素中，天然蛋白酶裂解位点(也称为激活位点)被对于此梭菌毒素为非天然的蛋白酶裂解位点修饰或替换。可采用的非天然蛋白酶包括肠激酶(ddddk↓(seqidno:2))、因子xa(iegr↓(seqidno:3)/idgr↓(seqidno:4))、tev(烟草蚀纹病毒)(enlyfq↓g(seqidno:5))、凝血酶(lvpr↓gs(seqidno:6))和prescission(levlfq↓gp(seqidno:7))。
在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶以与ntnha约1:2至约1:1000，优选与ntnha约1:5至约1:100，例如约1:10、1:20、1:30、1:40或1:50的摩尔比添加。在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶以与bont约1:2至约1:1000，优选与bont约1:5至约1:100，例如约1:10、1:20、1:30、1:40或1:50的摩尔比添加。所用特定蛋白酶的适当条件将由本领域技术人员确定。暴露于蛋白酶的时间长度也随蛋白酶、使用浓度和温度而变化。在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶在约2℃至约40℃，优选约4℃至约37℃，例如4℃、16℃、20℃或37℃的温度下与基质接触。在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶在室温(约20℃-22℃)下与基质接触。在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶与基质接触约10分钟至约18小时，优选约30分钟至约5小时，例如约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或5小时。在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶在约5.5至约8.5，优选约6至8的ph下，例如在约6、7或8的ph下与基质接触。在一个实施方案中，蛋白酶选自蛋白酶：胰蛋白酶和lys-c蛋白内切酶，并在室温下、在6与7之间的ph下与基质接触约30分钟至2小时。
在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶以与ntnha约1:10的摩尔比添加。在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶在室温下与基质接触。在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶与基质接触约30分钟至12小时。
本发明的另一方面涉及纯化肉毒杆菌神经毒素(bont)的方法，其包括使包含bont的澄清细胞提取物与谷胱甘肽包被的基质在ph为约6的结合缓冲液中接触，所述基质具有附着到其上的与谷胱甘肽-s-转移酶融合的相容的非毒非血凝素(ntnha)，从而形成ntnha-bont复合体；用ph为约6的洗涤缓冲液洗涤基质从而除去未结合的物质；使基质与蛋白酶在ph为约6的缓冲液中接触从而裂解ntnha-bont复合体内的bont；用ph为约6的洗涤缓冲液洗涤基质从而除去蛋白酶和未结合的物质；并且通过使基质与ph≥7.5的洗脱缓冲液接触从而将bont从ntnha-bont复合体解离来从基质中洗脱bont。在本文所述方法的一个实施方案中，bont包含肉毒梭菌血清型b(b-hc)的经修饰的受体结合结构域。在本文所述方法的一个实施方案中，结合缓冲液和/或洗涤缓冲液包含50mmmes，150mmnacl。在本文所述方法的一个实施方案中，结合缓冲液还包含1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)。在本文所述方法的一个实施方案中，洗脱缓冲液包含50mmtris，150mmnacl，并且具有约8的ph。在本文所述方法的一个实施方案中，谷胱甘肽包被的基质是谷胱甘肽连接的琼脂糖珠粒。在本文所述方法的一个实施方案中，谷胱甘肽包被的基质是柱。在本文所述方法的一个实施方案中，谷胱甘肽包被的基质具有约5mg/ml结合的ntnha。在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶或lys-c蛋白内切酶。
本发明的另一方面涉及纯化包含肉毒杆菌神经毒素的受体结合结构域的多肽(hc多肽)的方法，其包括以下步骤：使包含hc多肽的溶液与具有附着到其上的相容的非毒非血凝素(ntnha)的基质在适于ntnha与hc多肽结合的条件下接触从而形成ntnha-hc多肽复合体；洗涤基质从而除去未结合的物质，并且通过使基质与将hc多肽从ntnha-hc多肽复合体解离的水溶液接触来从基质中洗脱hc多肽。在本文所述方法的一个实施方案中，hc多肽的受体结合结构域是肉毒梭菌血清型b(b-hc)的经修饰的受体结合结构域。在本文所述方法的一个实施方案中，hc多肽是肉毒杆菌神经毒素(bont)多肽。在本文所述方法的一个实施方案中，hc多肽是嵌合的肉毒杆菌神经毒素(bont)多肽。
本发明的另一方面涉及本文所述分子在用于纯化肉毒杆菌神经毒素(bont)多肽的方法中的用途。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅以彩色绘制出的绘图。在提出请求并支付必要费用后，本事务所将提供具有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。
图1a和图1b是如本文所述的bont的纯化原理和方案的实施方案的图解。图1a)bont和ntnha的ph依赖性双分子复合的示意图。lc：轻链，hn：转位结构域，hcn、hcc：分别是受体结合结构域的n末端和c末端区段。ntnha具有与bont相同的结构域内含物，其被示出为固定在谷胱甘肽-琼脂糖树脂上的gst(谷胱甘肽-s-转移酶)融合蛋白。图1b)描述了使用天然结合配偶体ntnha的bont的综合性纯化、激活和洗脱方案的流程图。
图2a和图2b是凝胶分级蛋白质的图像。实验结果表明以bont的模型复合体形式使用ntnha/b成功纯化了bont/b。图2a)使用针对bont/b的单克隆抗体来沿着图1b中描述的每个纯化步骤监测bont/b的存在(不同的是这里的样品没有用胰蛋白酶处理)。图2b)用考马斯法染色的所选样品的sds-page凝胶示出了如图a中所述纯化的bont/b的纯度。在洗脱级分中观察到对应于bont/b的主要条带(约150kda)。
图3a和图3b是两组凝胶分级蛋白质的图像。实验结果表明，bont/b在ntnha/b·bont/b复合体中高效激活。图3a)通过胰蛋白酶进行的ntnha结合的bont/b激活的代表性免疫印迹，胰蛋白酶将bont/b分成两个片段(分别为100kda和50kda)。bont/b的两个片段通过单个二硫键保持彼此连接。当添加dtt以还原二硫键时，它们彼此分开。图3b)考马斯法染色的洗脱级分显示出对应于裂解的毒素片段的毒素条带(分别在100和50kda处)。150kda条带是保持待裂解的全长毒素的部分。
图4是凝胶分级蛋白质的图像。实验结果确立使用ntnha/b成功纯化了嵌合bont/a1b毒素。使用针对bont/a的多克隆抗体来追踪嵌合毒素bont/a1b的纯化步骤，所述嵌合毒素bont/a1b由bont/a1轻链和转位结构域构成，具有来自bont/b的受体结合结构域。使用ntnha/b成功纯化并洗脱全长bont/a1b(洗脱级分中的150kda条带)。我们注意到100kda的显著条带是这种嵌合毒素的降解产物，所述嵌合毒素可能被大肠杆菌中的内源性蛋白酶切割。
图5a-5i(seqidno.22-30)是各种ntnha血清型及其变体的氨基酸序列的列表。
图6a-6c是如本文所述的bont的纯化原理和方案的实施方案的图解。图6a)bont和ntnha的ph依赖性双分子复合的示意图。lc：轻链，hn：转位结构域，hcn、hcc：分别是受体结合结构域的n末端和c末端区段。ntnha具有与bont相同的结构域内含物并且示出为可以固定在谷胱甘肽-琼脂糖树脂上的gst(谷胱甘肽-s-转移酶)融合蛋白。微酸性条件下(例如，约ph6)的bont与ntnha之间的相互作用可以通过将缓冲条件朝向中性-碱性ph操纵来破坏。图6b)bont分离和激活方案。描述使用ntnha从粗裂解物中纯化、激活和洗脱标记和未标记的bont的策略的流程图。图6c)使用固定在谷胱甘肽琼脂糖珠粒上的gst-ntnha/b从澄清大肠杆菌裂解物中对无活性bont(bont/b(ry))进行典型分离的sds-page分析。在ph6下进行结合和洗涤步骤，并且通过将缓冲液更换为ph8来洗脱。
图7a和图7b示出使用固定化ntnha分离的bont/b是纯的并且结合其经典神经元受体。图7a)sds-page分析(左)示出合并且浓缩的三个洗脱级分(泳道5)。将针对bont/b的单克隆抗体用于在所有步骤中检测毒素(wb，右)。洗脱的级分含有未激活的bont/b，其作为约150kda的主要条带，对应于单链bont/b(ry)毒素。图7b)各向异性检测的结合：洗脱的全长毒素显示出与其经典突触囊泡受体突触结合蛋白1(syt1)的fitc标记片段类似的亲和力，因为其重组hc结构域；bont/ahc不与syt结合。误差棒表示3个样品的平均值+sem。
图8a-8c示出复合的bont被高效激活但被保护免受非特异性裂解。图8a)胰蛋白酶介导的bont/b(ry)激活(裂解)在8％sds-page上可视化。单链(sc)毒素的时程裂解产生两个片段：通过单个二硫键连接的重链(hc)和轻链(lc)。图8b)wb分析显示，在与ntnha/b复合的同时激活bont/b保护其免受非特异性胰蛋白酶消化，同时允许高效洗涤和除去蛋白内切酶。图8c)lys-c蛋白内切酶也可用作特异性激活剂，以使用该方法产生活性的双链毒素。
图9示出使用ntnha/b对嵌合bont/a1b1毒素的分离。使用针对bont/a的多克隆抗体来跟踪对由与bont/bhc结构域融合的bont/a(lc(ry)，hn)构成的嵌合毒素的纯化。洗脱级分含有约150kda的未激活的bont/a1b1蛋白。约70kda的显著条带可能是被多克隆抗体识别的ntnha/b的片段。
具体实施方式
肉毒杆菌神经毒素(bont)是由携带孢子的肉毒梭菌产生的高效蛋白质毒素。在过去的几十年中，已经发现这些致命的药剂可通过阻断注射肌肉中的神经递质释放而用于治疗许多神经肌肉病症和用于美学应用。现确立的治疗剂bont被世界各地的几家制造商大规模生产。现有数据表明，制造程序依赖于利用孢子形成菌株的数十年前的方法，并且通过许多费力且低效的大量纯化步骤实现毒素分离。需要用于直接纯化和激活治疗性bont的改进方法。
肉毒杆菌神经毒素(bont)是人类已知的毒性最大的物质。已经鉴定出bont的七种血清型(a-g)蛋白质为细菌肉毒梭菌的不同菌株的约150kda产物(montal2010)。这些毒素导致动物肉毒杆菌中毒，这是一种严重的神经肌肉疾病，表现为极度弛缓性麻痹。这种毒性的分子基础在于毒素有效结合神经肌肉接头(nmj)处的运动神经元上的受体、通过内吞作用内化，并穿过内体膜以将其酶链释放到胞质溶胶中的能力。然后释放的蛋白酶裂解负责nmj处的突触囊泡融合的细胞机制(snare蛋白)，从而通过阻断乙酰胆碱释放来抑制神经传递(blasi等人1993；bordenlacy等人1998；rossetto等人2014)。
肉毒杆菌神经毒素(bont)也可用作局部控制肌肉活动，尤其是由于肌痉挛引起的不受控制的活动或异常的工具(masuyer等人2014)。bont的神经抑制功能被探究作为许多肌肉病症的治疗策略，包括斜视和控制多发性肌张力障碍和下尿路功能障碍(lutd)(jankovic和brin1991；truong和jost2006；visco等人2012；jiang等人2015)。作为治疗剂和/或美容剂，bont可用于使面部肌肉麻痹以抚平皱纹(hexsel等人2011)。毒素的另外应用旨在缓解抑郁症和预防性治疗偏头痛(finzi和rosenthal2014；jackson等人2012)。毒素的临床用途受到大量的公众关注(sifferlin2017)。
肉毒杆菌神经毒素(bont)可以从孢子形成梭菌菌株的生长中分离，随后纯化成最终产物(pickett2014)。关于bont生产过程和分离的现有数据表明，生产者利用与源于几十年前的那些方法类似的在天然菌株中的培养和生长条件的方法(pickett和perrow2009；snipe和sommer1928；duff,wright等人1957；duff,klerer等人1957；bonventre和kempe1959；schantz和johnson1992；pickett2014)。此类方法受到天然梭菌菌株可以产生毒素的效率的限制，并且通常涉及毒素的天然来源(产孢子梭菌菌株)的长期发酵期，然后是常常在恶劣条件下进行费力的毒素分离程序，所述毒素分离程序涉及若干次酸/醇沉淀、结晶和/或多个色谱步骤(dasgupta和boroff1967；tse等人1982；schantz和johnson1992；malizio等人2000)。
重组产生标记的bont是可行的，所述标记的bont包含亲和标签(例如his6x或gst融合)以有助于使用亲和色谱法进行的毒素纯化。然而，此类方法例如在使用bont作为治疗性生物制剂中具有缺点。例如，亲和标签可能不利地影响毒素的生物活性和/或具有不期望的抗原性。纯化后除去标签还需要额外的酶促和纯化步骤，同时在最终产物中产生非天然n末端或c末端。此外，重组bont需要通过蛋白内切酶进行纯化后激活，以获得功能性和有效的双链毒素。该蛋白水解步骤导致非特异性降解，这需要额外的纯化步骤以除去蛋白内切酶和/或降解产物。除了对于由孢子形成菌株产生毒素和随后纯化的工程和封闭挑战(malizio等人2000；pickett2014)之外，这些重组方法可能损害最终产物的大多数特性，从质量和效力到高效的再现性。安全且高效地分离活性治疗性bont的新策略将有利于bont的大规模生产和容易分离。
关于梭菌神经毒素获得进入神经元细胞溶胶的生化特性和细胞机制的研究提供了对梭菌神经毒素的结构、分子和机制功能的一些了解(blasi等人1993；bordenlacy等人1998；dong等人2006；rossetto等人2014)。食源性肉毒杆菌中毒需要细菌的完整毒素和其他产物通过宿主的胃肠道。直到最近，当称为“前体毒素复合体(progenitortoxincomplex)”(ptc)的较大复合体被表征为构成靶生物体遇到的全部毒性剂时，这种避免降解的能力的分子和结构基础仍然是个谜。除蛋白水解活性毒素外，这些多蛋白复合体通常由血清型特异性非毒非血凝素(ntnha)蛋白和三种血凝素蛋白(ha)组成(lee等人2014)。先前被认为有助于毒素功能(schantz和johnson1992)，现在已知ptc物理屏蔽和保护bont免受恶劣的胃肠环境的影响，从而安全地到达目的地：首先是上皮屏障，随后是nmj，在nmj处它可以通过突触囊泡再循环机制被内化到胞质溶胶中。在一项结构研究(gu等人2012)中，gu和同事在原子细节中指出了bont/a:ntnha/a的非共价复合体中的最低效的ptc(m-ptc)。毒素:ntnha复合体的共晶结构表明ph依赖性复合体形成。据报道，bont/a和ntnha/a能够在微酸性条件(约ph6)下形成具有纳摩尔级亲和力的紧密复合体。然而，据说这种复合体形成不在中性-碱性ph下发生。
本文公开了与bont的纯化有关的组合物和方法，其利用bont分子对非毒非血凝素(ntnha)蛋白的天然亲和力。bont与ntnha伴侣蛋白天然形成二聚体复合体，并且被保护以在胃肠道中免受蛋白酶和酸性降解。结合是可逆的并且取决于ph，在ph<7时结合，并且在ph>7.4时解离。在促进结合的ph下将ntnha蛋白质添加到含有bont的混合物。通过将ntnha固定在复合体中，将bont:ntnha复合体与混合物的其他组分分离。洗涤后，然后通过升高ph以促进解离来将bont从复合体释放。因为该方法不依赖于bont的亲和修饰，所以可以纯化未标记形式的毒素。
本文所述的纯化方法还可以在bont:ntnha复合体中的同时激活bont。激活后，bont可从复合体释放，从而产生纯化的激活形式的毒素。
本发明的方面涉及纯化bont的方法。通常，bont在含有污染性组分的水溶液，诸如细胞提取物的背景下。所述方法包括在适于bont与ntnha结合的条件下将溶液与ntnha分子混合。实际上，这可以包括将ntnha分子与水溶液(例如，细胞提取物或澄清细胞提取物)混合。可以借助ntnha分子分离bont。通常，这通过将ntnha固定在基质上来完成。例如，通过洗涤基质(例如，使用3-4倍基质体积的洗涤缓冲液量)从复合体中除去未结合的物质。洗涤后，例如，通过从基质结合的ntnha中洗脱使bont从复合体释放，以产生纯化的多肽。
bont可以在从复合体释放之前通过用蛋白酶消化进行激活。这可以通过在适于裂解bont但不会在其他方面破坏复合体(例如，保持所需的ph)的条件下使基质结合的复合体与蛋白酶接触来完成。通过洗涤基质(例如，用洗涤缓冲液)将蛋白酶与其他未结合的物质一起除去。然后可以通过使基质与将bont从ntnha复合体解离的水溶液(例如，与洗脱缓冲液)接触来洗脱激活的、纯化的bont。在一些实施方案中，不需要或不期望激活多肽。
所述方法中使用的ntnha必须与bont相容。当用于提及ntnha和bont时，术语相容的是指所述分子能够彼此形成紧密且稳定的复合体。在一个实施方案中，bont和ntnha是相同的天然存在的bont血清型蛋白质复合体的组分。当bont和ntnha编码序列来自相同操纵子时，会发生这种情况。由于术语“血清型”在本文中用于描述ntnha分子，因此“来自血清型”是指衍生自编码特定bont血清型的操纵子的ntnha分子。相容的还可以是指具有与ntnha相容的区(例如，hc区)的bont或嵌合多肽。在一个实施方案中，ntnha和bont的hc区均衍生自相同的天然存在的bont血清型复合体。
可以在结合bont之前或之后将ntnha固定到基质。在一个实施方案中，将ntnha连接到基质并且将包含bont的溶液添加到基质从而使hc多肽与ntnha接触并促进复合体形成。在一个实施方案中，ntnha和bont在将ntnha附着到基质之前处于复合体中。
在一个实施方案中，将亲和部分引入到ntnha蛋白上(例如，通过表达为融合蛋白)，并且使用标记的蛋白质来在促进bont:ntnha结合的条件下结合和分离bont。通过亲和纯化复合体内的ntnha来分离bont:ntnha复合体。
结合缓冲液、孵育缓冲液、洗涤缓冲液和蛋白酶消化缓冲液将促进适于形成和保持hc-ntnha复合体的条件。这包括但不限于具有促进复合体形成的ph。通常，这将是小于7.5，例如小于6的ph。在一个实施方案中，缓冲液ph为2-8。在一个实施方案中，缓冲液ph为5-7。在一个实施方案中，ph为约5、约6或约7。结合缓冲液、孵育缓冲液和洗涤缓冲液均可以高度相似或相同。缓冲液还可含有除本文指明的那些之外的附加组分。在一个实施方案中，缓冲液还含有bont多肽的稳定剂(例如，血清白蛋白、多糖、海藻糖或表面活性剂)。可以针对其中的各种组分在指定范围内优化缓冲液的ph。本领域技术人员将理解，缓冲液ph应保持总体蛋白质结构，避免接近可能使蛋白质沉淀的蛋白质pi的ph。
缓冲液优选具有生理离子强度(例如，在100-200mmkcl或nacl的范围内)。有多种盐可用于产生所需的离子强度。过高的盐浓度可能由于极性/离子干扰而破坏相互作用。在一个实施方案中，盐浓度为400mm或更低。也预期低盐的条件充分起作用。在一个实施方案中，盐浓度为150mm。在一个实施方案中，缓冲液包含50mmmes，150mmnacl，并且具有ph6。在一个实施方案中，发生结合的缓冲液(结合缓冲液)还包含一种或多种蛋白酶抑制剂(例如苯甲基磺酰氟(pmsf))。在一个实施方案中，结合缓冲液包含浓度为约0.1至1mm的pmsf。在一个实施方案中，pmfs为约1mm。
可以例如使用洗涤缓冲液进行洗涤。用于洗涤的典型量是3-4倍的基质体积。
bont分子含有若干个结构域并且通过其受体结合结构域(在其他方面称为hc结构域)与ntnha分子结合。因此，本文所述的方法适用于纯化包含肉毒杆菌神经毒素的受体结合结构域(hc多肽)的任何多肽(例如，包含hc多肽的全长bont或其片段，或包含hc结构域的嵌合多肽)。
在本文所述方法的一个实施方案中，ntnha以与bont或其受体结合结构域约1:1至约10:1的，例如与bont或其受体结合结构域约2:1、3:1、4:1或5:1的摩尔比存在。
通过使bont:ntnha复合体(例如，当与基质结合时)与适当的蛋白酶接触来实现结合的bont或其片段的激活。在一个实施方案中，蛋白酶在赖氨酸残基后裂解蛋白质。在一个实施方案中，蛋白酶是但不限于胰蛋白酶、胃蛋白酶、lys-c内切蛋白酶、lys-n蛋白内切酶、精氨酰肽链内切酶、纤溶酶、omptin或如ep2524963中所述的梭菌蛋白酶。优选的条件将使得ntnha、任何缔合的亲和部分或其结合靶标无实质降解。适于裂解的条件包括蛋白酶的适当浓度，和针对蛋白酶活性的适当条件(例如温度、培养时间、缓冲组分等)。此类条件可以通过使用适当的蛋白酶消化缓冲液来实现。所用蛋白酶的量可以通过ntnha分子的量或bont分子的量来确定。在一个实施方案中，蛋白酶以与ntnha分子约1:2至约1:1000的摩尔比存在。在一个实施方案中，蛋白酶以与ntnha分子约1:5至约1:100，例如约1:10、1:20、1:30、1:40或1:50的摩尔比存在。在本文所述方法的一个实施方案中，蛋白酶以与bont约1:2至约1:1000(例如与bont约1:5至约1:100)，或约1:10、1:20、1:30、1:40或1:50的摩尔比添加。
所用特定蛋白酶的适当条件将由本领域技术人员确定。暴露于蛋白酶的时间长度也随蛋白酶、使用浓度和温度而变化。在一个实施方案中，蛋白酶在2℃与40℃之间，优选在4℃与37℃(例如，4℃、16℃、20℃或37℃)之间的温度下接触。在一个实施方案中，蛋白酶在室温下接触(约20℃-22℃)。
在一个实施方案中，使蛋白酶接触约10分钟至约18小时，优选30分钟至5小时(例如，约30分钟、1小时、2、3、4或5小时)。在一个实施方案中，使蛋白酶接触约4小时。在一个实施方案中，蛋白酶是lys-c内切蛋白酶并且孵育时间为约30分钟。
在一个实施方案中，蛋白酶在约5.5至约8.5的ph下与基质接触。在一个实施方案中，蛋白酶在约6至约8(例如，约6、7或8)的ph下与基质接触。
在一个实施方案中，蛋白酶选自蛋白酶胰蛋白酶和lys-c蛋白内切酶，并在室温下、在6与7之间的ph下与基质接触约30分钟至2小时。
使用具有促进复合体解离的ph的水溶液(在本文中称为洗脱缓冲液)完成bont从bont-ntnha复合体的洗脱。优选地，洗脱缓冲液通过具有适当的ph来破坏bont-ntnha复合体，同时在其他方面基本上保持hc多肽的完整性并基本上保持ntnha的固定(例如，保持ntnha与基质的结合)。洗脱缓冲液还优选具有生理离子强度。多种可得缓冲液适合使用(例如，tris、mops、hepes、磷酸盐缓冲液等)。在一个实施方案中，洗脱缓冲液与结合和/或洗涤缓冲液相同，仅在ph方面不同。在一个实施方案中，洗脱缓冲液是约50mmtris，150mmnacl，具有本文讨论的适当ph(例如，ph8)。
使用的洗脱缓冲液(例如，本文所述的那些)可以是约ph7至约ph11。在一个实施方案中，ph为7.5或更大。在一个实施方案中，ph为约8。洗脱缓冲液还可含有除本文指明的那些之外的附加组分。可以针对其中的各种组分优化洗脱缓冲液的ph。
通常，从细胞提取物中纯化bont。在一个实施方案中，细胞提取物是澄清细胞提取物。术语“澄清细胞提取物”是指提取物基本上不含所有颗粒物，例如当通过离心和/或过滤除去时。
bont和ntnha可以在相同的宿主细胞，例如大肠杆菌中共表达。所述方法可以利用其中与bont一起表达的ntnha。另选地，bont和ntnha可以在不同的宿主细胞中表达。相应的细胞提取物可用于产生/分离相应的蛋白质。bont可以以重组方式在异源宿主细胞(诸如大肠杆菌)中产生，或在其天然梭菌细胞中产生。ntnha可以以重组方式在异源宿主细胞(诸如大肠杆菌)中，或在其天然梭菌细胞中产生。
如本文所用，“纯化”或“纯化的”是指相对于制剂的其他组分(例如，其他多肽)的“基本上纯的”bont或其片段。它可以是指相对于其他组分至少约50％、60％、70％或75％，优选至少约85％、更优选至少约90％且最优选至少约95％纯度的bont或片段。重新改写，即关于bont或片段的术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指含有少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、7％，最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的一种或多种其他组分(例如，其他多肽或细胞组分)的制剂。
本发明的其他方面涉及本文所述方法中使用的组分。本发明的一个方面涉及用于结合bont的ntnha多肽。ntnha多肽可以是全长ntnha或其功能片段。ntnha的功能片段被认为保持与相容的bonthc结构域的结合特性，并且保护bont免受降解，同时允许激活。ntnha多肽还可包含另外的异源氨基酸。当在本文使用时，术语异源是指不同来源的分子。例如，异源亲和部分不同于天然存在于ntnha分子中的任何内部亲和部分。
异源序列可以与ntnha共价连接(例如，通过表达为融合蛋白或通过对ntnha分子的翻译后修饰)。在一个实施方案中，另外的异源氨基酸序列是异源亲和部分。
异源氨基酸序列可以存在于n末端、c-末端或内部。当存在时，此类序列应被设计成保持ntnha与bonthc结构域的相互作用。在一个实施方案中，异源序列是亲和部分并且在亲和部分与ntnha序列之间不存在间插序列。在一个实施方案中，异源氨基酸位于ntnha的n末端。
在一个实施方案中，异源氨基酸缺乏功能性蛋白质裂解位点，诸如通常用于从融合蛋白质中除去亲和标签的那些。在一个实施方案中，本发明排除了包含与n末端融合的myc-标签的ntnha多肽，例如ntnha-a1(gu等人,science335:977-981(2012))。
在本发明的一方面，ntnha多肽稳定地附着到基质。稳定附着是指不受本文所述的各种缓冲液的条件破坏的附着。与基质的附着可以通过共价或非共价相互作用。在一个实施方案中，与基质的附着是通过ntnha多肽上的异源亲和部分与基质上的对应结合部分(例如，ntnha上的gst亲和部分与基质上存在的谷胱甘肽)的相互作用。
在一个实施方案中，本文所述的各种形式的ntnha多肽(例如，与亲和部分连接和/或稳定地附着到基质)进一步与相容的bont或包含其受体结合结构域的多肽(hc)处于复合体中。在一个实施方案中，bont或hc是天然蛋白质。在一个实施方案中，bont或hc是经遗传修饰的受体结合结构域(例如，对特异性受体具有增加的结合)。
在一个实施方案中，包含亲和部分的ntnha多肽通过亲和部分的结合进一步与结合靶标结合。结合靶标可以进一步稳定地附着到基质。
本发明的另一方面涉及含有本文所述的ntnha多肽的水溶液。溶液内的ntnha多肽可以是具有本文所述的任何形式，诸如与亲和部分连接、稳定地附着到基质，和/或通过亲和部分与结合靶标结合，其中任何一种可以进一步结合相容的bont。
本发明还涵盖了编码本文所述的ntnha和亲和部分融合蛋白的核酸序列。编码蛋白质的核酸序列可以针对大肠杆菌表达进行优化。在一个实施方案中，核酸序列在载体(例如表达载体)的背景下。载体应与意图在其中增殖和/或表达核酸的宿主细胞相容。
ntnha
ntnha是由肉毒梭菌合成的140kda蛋白质。ntnha基因发生在编码特定血清型bont蛋白的操纵子内。由相同操纵子产生的bont和ntnha是相同的天然存在的bont蛋白质复合体的组分，并且彼此形成紧密稳定的复合体。ntnha以大约30.8nm的kd以1:1的化学计量结合bont(shenyan等人,science335:977-981(2012))。优选地，ntnha衍生自相同的肉毒梭菌菌株，其产生被纯化的bont或hc片段的该血清型(和亚型)(a、a1、a2、a3、a4-a、a4-b、型b、c、c1、d、e、f或g)。可以预期血清型之间的结合的一些重叠。本领域技术人员可获得不同ntnha蛋白的氨基酸序列，编码核酸序列也是如此，诸如衍生自编码bont血清型的操纵子的ntnha蛋白：a1(yp_001253341.1)、a2(wp_012704905)、b(wp_003404192.1)、c1(yp_398515.1)、d(baa75083.1)、e(wp_003409842)、f(yp_001390122.1)和g(caa61228.1)。在一个实施方案中，本发明排除了ntnha/a(ntnha/a1)分子和编码核酸的使用。
bont
肉毒杆菌神经毒素的不同血清型(a-g)在本领域中是已知的，并且还存在许多亚型(a1、a2、a3、a4-a、a4-b)。本文所述的方法可用于纯化天然bont(由梭菌细菌产生)或重组蛋白。重组bont可以在任何其他类型的宿主，诸如其他原核细胞、真核细胞、组织或生物体中产生。
还可以分离bont的突变变体(例如，由氨基酸取代、插入或缺失产生)。在一个实施方案中，变体具有增加的毒性(例如，通过具有增加的与细胞受体的结合)。此类突变变体可包含“经修饰的受体结合结构域”或“经修饰的hc”。当在本文使用时，术语经修饰的hc具有一个或多个非天然存在的取代突变，其增强所包含的肉毒梭菌神经毒素分子与位于靶细胞表面上的肉毒梭菌神经毒素的受体的结合。这种分子通常通过遗传重组技术产生。经修饰的hc对肉毒梭菌神经毒素的受体具有比其野生型对应物更强的结合活性。经修饰的受体结合结构域的实例公开于美国申请2015/166972中，所述申请的内容以引用的方式并入本文。本发明还可用于分离具有或保留肉毒杆菌毒素的生物活性的任何分子，诸如肉毒杆菌毒素的融合(或嵌合)蛋白、截短蛋白、蛋白质片段或突变变体，诸如具有一个或多个添加、缺失或替换的氨基酸的蛋白质。
在一个实施方案中，通过本文所述方法分离的bont具有毒性活性。bont的活性可以通过测量适当底物上的蛋白水解活性来确定。a型和e型毒素的肉毒杆菌毒素裂解蛋白snap-25。b、d、f和g型肉毒杆菌毒素裂解囊泡相关膜蛋白(vamp，称为小突触泡蛋白)。c1型肉毒杆菌毒素裂解snap25和蛋白质突触融合蛋白。可用于确定该活性的测定在本领域中是已知的，诸如wo95/33850中所述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
亲和部分
ntnha可以附着到亲和部分。亲和部分在本文所述方法的条件(例如，约ph6至约ph8)下特异性结合结合靶标。多种亲和部分在本领域中是已知的并且可用于本发明。亲和部分可以是特异性结合对的成员，例如由抗体特异性识别的表位。当表位用作亲和部分时，抗体用作结合靶标。许多这种亲和部分:抗体组合在本领域中是已知的并且可商购获得。实例包括但不限于c-myc(roth等人(1991)j.cellbiol.115:587-596)、myc(eqkliseedl(seqidno:8)；evangi等人(1985)mol.cellbiol.5:3610-3616；munros.和pelhamhrb,(1987)cell48:899-907；borjiginj.和nathansj.,(1994)269:14715-14727；smithdj,(1997)biotechniques23:116-120)、flag.rtm.(美国专利号4,703,004；4,851,341和5,011,912)、ha，衍生自流感血凝素蛋白(wilsonia等人,(1984)cell,37:767；fieldj.等人mol.cellbiol.(1988)8:2159-2165；xuy等人(2000)molcellbiol.20:2138-2146)、irs(ryirs(seqidno:9)；liangtc等人(1996)329:208-214；luow等人(1996)arch.biochem.biophys.329:215-220)、au1和au5((dtyryi(seqidno:10)和tdflyk(seqidno:11))；limps等人(1990)j.infect.dis.162:1263-1269；goldsteindj等人(1992)190:889-893；koralnikij等人(1993)j.virol.67:2360-2366)、glu-glu(来自多瘤病毒媒介t抗原的9氨基酸表位(eeeeympme(seqidno:12))；grussenmeyer,t.等人(1985)pnas.usa82:7952-7954；rubinfeld.b.等人(1991)cell65:1033-1042)、kt3(来自sv40大t抗原的11氨基酸表位(kpptpppepet(seqidno:13))；macarthurh.和walterg.(1984)j,virol.52:483-491；martinga等人(1990)63:843-849；dipaolog等人(1997)272:5175-5182)、t7(来自t7主衣壳蛋白的11氨基酸前导肽(masmtggqqmg(seqidno:14)))、s-tag，hsv(来自单纯性疱疹病毒糖蛋白d的11氨基酸肽(qpelapedpedc(seqidno:15)))、vsv-g(来自疱疹性口炎病毒糖蛋白的羧基末端的11氨基酸表位(ytdiemnrlgk(seqidno:16))；kreist.(1986)emboj.5:931-941；turnerjr等人(1996)271:7738-7744)、anti-xpress(8氨基酸表位(dlydddk(seqidno:17)))，和vs(来自paramoxyvirussv5的14氨基酸表位(gkpipnpllgldst(seqidno:18)))。
通常用作亲和部分的另一表位是flag.rtm.。该序列通常由dykddddk(seqidno:19)组成，但3至6个天冬氨酸或谷氨酸残基的任何组合也被认为是flag.rtm.序列。flag.rtm.亲和标签已有效地用于纯化重组融合蛋白的各种表达系统中(brizzard等人(1994)biotechniques16:730-735；lee等人(1994)nature372:739-746；xu等人(1993)development117:1223-1237；dent等人(1995)mol.cellbiol.15:4125-4135；ritchie等人(1999)biochemjournal338:305-10.)。
还存在许多不基于表位的亲和部分，并且这些也可以用于本发明。gst(谷胱甘肽-s-转移酶)是设想用于本发明的亲和部分(美国专利号5,654,176；6,303,128和6,013,462)。多聚组氨酸亲和部分是组氨酸氨基酸残基的非天然连续序列，包括美国专利号5,284,933和5,310,663中公开的任何对应的肽。通常，此类序列包含4至10个组氨酸残基(seqidno:20)。
在一个实施方案中，亲和部分是谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、c-myc标签、几丁质结合结构域、链霉亲和素结合蛋白(sbp)、纤维素结合结构域、钙调蛋白结合肽、s标签、strep标签ii、fla、蛋白a、蛋白g、组氨酸亲和标签(hat)、多聚组氨酸或麦芽糖结合蛋白(mbp)。在一个实施方案中，亲和部分不是gst、c-myc标签、几丁质结合结构域、sbp、纤维素结合结构域、钙调蛋白结合肽、s标签、strep标签ii、fla、蛋白a、蛋白g、hat、多聚组氨酸或mbp。在一个实施方案中，亲和部分是avitagtm、v5、myc、t7、flag、hsv、vsv-g、多聚组氨酸(通常为his6(seqidno:1))、生物素或strep(wshpqfek(seqidno:21))。在一个实施方案中，亲和部分不是avitagtm、v5、myc、t7、flag、hsv、vsv-g、polyhis、生物素或strep。
与哺乳动物(人)体相互作用或天然存在于哺乳动物(人)体内的结合对成员，诸如天然结合ntnha的抗体，或被肝脏和/或肾中的转运蛋白识别的分子被排除在本文所述的组合物之外。
亲和部分的结合靶标
结合靶标用于通过结合亲和部分来固定ntnha多肽。结合靶标通常对给定的亲和部分是特异性的。将结合靶标附着到基质上，使得它们对亲和部分的结合亲和力得以保持。例如，表位标签的结合靶标是特异性结合表位标签的抗体。gst的结合靶标是谷胱甘肽。生物素的结合靶标是抗生物素蛋白或链霉亲和素。strep的结合靶标是strep-tactin。polyhis的结合靶标是二价镍或钴离子。蛋白g的结合靶标是igg的fc部分。蛋白a的结合靶标是各种物种的免疫球蛋白的fc部分。
基质
通常用于通过物理附着固定分子的各种惰性物质可用作本发明中的基质。基质，在其他方面也称为基底，可以由多种材料制成并且可以采用多种形式。材料包括但不限于金属、金属合金、聚合物、塑料、纸、玻璃、织物、包装材料、生物材料诸如细胞、组织、水凝胶、蛋白质、肽、核酸及其任何组合。采用的基质形式可以包括但不限于珠(包括聚合物微珠、磁性微珠等)、过滤器、纤维、筛网、网片、管、中空纤维、支架、板、通道及其任何组合。本领域已知的基底基质的其他实例包括但不限于核酸支架、蛋白质支架、脂质支架、树枝状大分子、微粒或微珠、纳米管和微量滴定板。在一个实施方案中，基质组分是呈柱的形式。
在一个实施方案中，ntnha多肽通过ntnha上存在的亲和部分与存在于基质表面上的结合靶标偶联而附着到基质。各种亲和部分和结合靶标可供使用，其实例在本文中讨论。在一个实施方案中，基质用作为结合靶标的谷胱甘肽包被(例如，谷胱甘肽连接的琼脂糖珠粒)。在一个实施方案中，谷胱甘肽包被的基质是呈柱的形式。
在一个实施方案中，ntnha多肽通过共价或非共价相互作用直接缀合到基质表面。这可以通过分子的n末端、c末端或在分子内部发生。在ntnha多肽上包含接头以有利于与基底的附着可能也是有用的。
可以使用本领域中的多种方法完成与基底的缀合。共价附着的实例包括但不限于硅烷偶联(weetall,15adv.mol.cellbio.161(2008)；weetall,44meths.enzymol.134(1976))，以及使用nhs反应或缀合剂。非共价附着可以基于离子相互作用、范德华相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键、静电相互作用和/或形状识别相互作用。非限制地，缀合可以包括稳定的或不稳定的键或缀合剂。示例性缀合包括但不限于共价键、酰胺键、碳-碳多重键的添加、叠氮化物-炔烃huisgen环加成、狄尔斯-阿尔德反应、二硫键、酯键、迈克尔加成、硅烷键、氨基甲酸酯、亲核开环反应：环氧化物、非羟醛羰基化学、环加成反应：1,3-偶极环加成反应、温度敏感、辐射(ir、近红外、uv)敏感键或共轭剂、ph敏感键或共轭剂、非共价键(例如，离子电荷复合体形成、氢键、pi-pi相互作用、环糊精/坚固的主客体相互作用)等。如本文所用，术语“缀合剂”意指连接化合物的两个部分的有机部分。接头通常包括直接键或原子(诸如氧或硫)、单元(诸如nr1、c(o)、c(o)nh、so、so2、so2nh或原子链)，其中一个或多个亚甲基可以是由o、s、s(o)、so2、nh、c(o)n(r1)2、c(o)、可裂解连接基团、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环中断或终止；其中r1是氢、酰基、脂族或取代的脂族。
多种缀合化学可获得用于将两个分子缀合在一起并且可用于将ntnha多肽连接到基质。用于将至少一种工程化微生物靶向分子缀合到基底的示例性偶联分子和/或官能团包括但不限于聚乙二醇(peg、nh2-pegx-cooh，其可具有各种长度x的peg间隔臂，其中1<x<100，例如peg-2k、peg-5k、peg-10k、peg-12k、peg-15k、peg-20k、peg-40k等)、马来酰亚胺缀合剂、pas化、hes化、二(磺基琥珀酸亚酰胺)辛二酸酯缀合剂、dna缀合剂、肽缀合剂、硅烷缀合剂、多糖缀合剂、可水解的缀合剂及其任何组合。
结合到基质的ntnha的量可以由本领域技术人员确定和优化。在一个实施方案中，基质具有约20mg/ml的ntnha多肽。在一个实施方案中，基质具有约5mg/ml多肽，或约2mg/ml多肽。
蛋白酶
任何裂解bont的蛋白酶都可用于本文所述的方法中。此类蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、胃蛋白酶、lys-c蛋白内切酶、lys-n蛋白内切酶、精氨酰肽链内切酶、纤溶酶、omptin和如ep2524963中所述的梭菌蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶或lys-c蛋白内切酶。在一个实施方案中，蛋白酶是裂解bont非天然(即外源性)裂解位点的蛋白酶。在此类梭菌毒素中，天然蛋白酶裂解位点(也称为激活位点)被对于此梭菌毒素为非天然的蛋白酶裂解位点修饰或替换。可采用的非天然蛋白酶包括肠激酶(ddddk↓(seqidno:2))、因子xa(iegr↓(seqidno:3)/idgr↓(seqidno:4))、tev(烟草蚀纹病毒)(enlyfq↓g(seqidno:5))、凝血酶(lvpr↓gs(seqidno:6))和prescission(levlfq↓gp(seqidno:7))(↓表示裂解位点)。
核酸载体
本发明的另一方面涉及核酸载体，其包含编码本文所述ntnha多肽的核酸分子。载体可以是仅用于在生物体或细胞中增殖核酸序列的载体，或者也可以是用于在该生物体或细胞中将核酸序列表达为多肽。
在一个实施方案中，载体是表达载体。这种表达载体在本文中称为表达构建体，并且包含与表达载体可操作地连接的本文公开的核酸分子，所述表达载体可用于在细胞或无细胞提取物中表达核酸分子。多种表达载体可用于表达编码本文所述的ntnha多肽的核酸分子，包括但不限于病毒表达载体(例如，逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒)、原核表达载体、真核表达载体(例如像酵母表达载体、昆虫表达载体)、哺乳动物表达载体和无细胞提取物表达载体。在一个实施方案中，表达载体是杆状病毒表达载体。合适的表达载体包括但不限于okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pbluescript(stratagene)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogen)或psport1(invitrogen)或杆状病毒衍生的载体。衍生自病毒的表达载体可用于将本发明的核酸递送到靶细胞群中。用于产生具有亲和部分的融合物的许多表达载体，诸如本文所述的那些，在本领域中是可获得的。对适当的表达载体的选择、制备和使用是本领域技术人员进行的常规程序。
宿主细胞
本发明的另一方面涉及细胞，在其中一种或多种本文所述的分子(例如，ntnha多肽和/或bont多肽)被增殖和/或表达。这种细胞被称为宿主细胞。宿主细胞可以进行遗传修饰以表达本文所述的分子，诸如通过用编码蛋白质的载体转染，和/或可以天然地表达一种或多种分子(例如bont)。在一个实施方案中，宿主细胞包含编码ntnha多肽的核酸(例如，在载体的背景下)。在一个实施方案中，宿主细胞表达核酸(例如，来自表达载体)。在一些实施方案中，根据本发明使用的细胞包括原核细胞和真核细胞。原核细胞的非限制性实例是大肠杆菌细胞、肉毒梭菌细胞、破伤风梭菌(clostridiumtetani)细胞、巴氏梭菌(clostridiumberatti)细胞、酪酸梭菌(clostridiumbutyricum)细胞或产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)细胞。真核细胞的非限制性实例是昆虫细胞、酵母细胞、两栖动物细胞、哺乳动物细胞、植物细胞。昆虫细胞的非限制性实例是草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞、白纹伊蚊(aedesalbopictus)细胞、粉纹夜蛾(trichoplusiani)细胞、盐泽灯蛾(estigmeneacrea)细胞、家蚕(bombyxmori)细胞和黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)细胞。酵母细胞的非限制性实例是酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)细胞、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)细胞、巴斯德毕赤酵母细胞(pichiapastoris)、多形汉逊酵母细胞(hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)细胞和解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)细胞。
除非本文另外定义，否则与本申请关联使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非另外通过上下文要求，否则单数的术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，且因此可变化。本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，且不意图限制本发明的范围，所述范围仅由权利要求限定。
除在操作实施例中以外，或当另外指明时，本文使用的表示成分的量或反应条件的所有数值都应被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。当与百分比结合用于描述本发明时，术语“约”可以意指±1％或±5％或±10％。
在一方面，本发明涉及本文所述的组合物、方法及其相应组分，它们对于本发明是必需的，但仍然有可能包括必需或不必需的未指明元素(“包括(comprising)”)。在一些实施方案中，包括在所述组合物、方法或其相应组分的描述中的其他元素限于那些不会实质上影响本发明的基本和新颖特征的那些元素(“基本上由......组成”)。这同样适用于所述方法内的步骤以及其中的组合物和组分。在其他实施方案中，本文所述的本发明即组合物、方法及其相应组分旨在排除不被认为是所述组分、组合物或方法的必需元素的任何元素(“由......组成”)。
确认的所有专利、专利申请和出版物都出于描述和公开例如所述出版物中所述的可能结合本发明使用的方法的目的以引用的方式明确并入本文。这些出版物仅因它们的公开内容在本申请的提交日期之前而加以提供。就此而言，任何事物都不应解释为认可由于先前发明或因为任何其他原因而使发明者无权先于所述公开内容。所有关于日期的陈述或关于这些文档的内容的表述都是基于可为申请人所用的信息且不构成关于这些文档的日期或内容的正确性的任何认可。
通过以下实施例进一步说明本发明，不应当将以下实施例视为进一步的限制。
实施例
实施例1
用于纯化和激活bont的新方法
本文提出了一种通过亲和纯化的简单步骤纯化和激活未标记的天然形式的bont的新方法。该方法基于bont的独特特征：这些毒素与其伴侣蛋白(称为ntnha)天然形成二聚体复合体。该二聚体的生物学目的是保护毒素免受胃肠(gi)道中的蛋白酶和恶劣酸性环境的影响。bont与ntnha之间的相互作用是ph依赖性的：它们在ph<7时结合，并且在ph>7.4时彼此解离。因此，将亲和标签引入到ntnha上可用于在ph<7的溶液中分离天然形式的bont。然后通过简单地将溶液的ph升高至>ph7.4，可以释放结合的bont。换句话说，不是将亲和标签放在bont上，而是可以标记其结合配偶体。这允许通过方便的亲和纯化方法生产天然形式的bont。
除纯化外，bont还需要通过限制性蛋白水解来激活。重组bont通常用蛋白内切酶(诸如胰蛋白酶)进行纯化后激活。这种方法有若干个缺点：1)蛋白内切酶可能会导致非特异性切割，从而损害毒素的活性和产率；2)在反应完成后需要除去蛋白内切酶，从而需要额外的分离步骤，这会影响毒素的产率和活性。
bont上的激活位点仍然暴露在bont-ntnha复合体的表面上，而bont的其他易感位点通常保护在复合体中。这提供了在毒素仍与ntnha处于复合体中的同时用蛋白内切酶处理毒素的机会。这种方法解决了先前方法中的两个问题：1)ntnha将保护毒素免受蛋白内切酶的非特异性切割；2)蛋白内切酶可以在单一洗涤步骤中与所有未与ntnha结合的其他非毒素蛋白一起容易地除去。
结果
每种天然存在的bont都有其自己的天然存在的ntnha配偶体。bont/b和ntnha/b被用作原型以确定我们方法的可行性。简而言之，ntnha/b表达为具有常用gst标签(谷胱甘肽-s-转移酶)的融合蛋白。将gst-ntnha/b纯化、固定在谷胱甘肽珠上，随后用毒素结合缓冲液(ph＝6)平衡。然后将该树脂添加到含有重组表达的bont/b的大肠杆菌细胞裂解物中，并且在4℃温育1小时，以允许在ph6条件下形成复合体。随后，用结合缓冲液洗涤珠结合的复合体，以除去非特异性污染物和未结合的蛋白质。将结合的bont/b使用ph8洗脱缓冲液从珠上洗脱，或者进行胰蛋白酶处理以进行激活。
纯化原理和步骤在图1a和图1b中示意性地示出。结果表明，使用该方法可以从粗细菌裂解物中高效地纯化bont/b(图2a)，最终蛋白具有高的产率和纯度(图2b)。对含有ntnha/b:bont/b复合体的一部分树脂进行胰蛋白酶介导的裂解。示出在图3a和图3b中的结果表明bont可在复合体中的珠上在几小时内高效激活，并且随后可从珠上洗脱以产生天然的活性毒素。
探究了是否可以使用对一种血清型特异的ntnha来纯化含有该毒素的区段，特别是受体结合结构域的嵌合毒素。受体结合结构域介导ntnha与bont之间的大部分相互作用。示出在图4中的结果表明成功使用ntnha/b纯化了含有bont/b受体结合结构域的杂合毒素(bont/a1b)。
这些实验结果充当了可用于以下项的方法的概念证明：纯化广泛使用的治疗性毒素：bont/a(使用ntnha/a)和bont/b(使用ntnha/b)、纯化bont的其他血清型(使用合适的ntnha)、纯化含有突变的重组bont、纯化嵌合bont(使用结合受体结合域的ntnha或专门设计的嵌合ntnha蛋白)。该方法的优点是1)通过方便的亲和纯化来纯化重组表达的具有天然n末端和c末端的bont的能力，2)温和的缓冲条件(ph6-8)使对毒素的任何潜在损害最小化，3)特定的ph依赖性结合和洗脱方便地产生高纯度的毒素，减少了进一步纯化的需要，4)来自ntnha的保护减少了激活步骤期间由激活蛋白酶进行的非特异性切割，和5)在洗脱毒素之前进行蛋白酶激活消除了单独除去蛋白酶的需要。
材料和方法
蛋白质表达和纯化。将ntnha/b在大肠杆菌中表达为谷胱甘肽-s-转移酶融合蛋白(gst-ntnha/b)，其中gst与ntnha/b蛋白的n末端融合；将bont/b在大肠杆菌中表达，具有c末端his6标签(seqidno:1)。将细菌培养物(1l)在37度下生长，并且当600nm处的培养物光密度(od600)达到约0.6au时，通过加入异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)(250μm)诱导蛋白质表达。然后将培养物转移到20度振荡培养箱进行过夜表达(约16小时)。通过在5500xg离心收获细菌，并将所得的沉淀冷冻直至纯化。
将bont/b沉淀物解冻并溶解于具有5ml/g干的细菌沉淀的结合缓冲液(50mmmes，150mmnacl，ph6)中；将ntnha/b沉淀解冻并溶解于不同的结合缓冲液(50mmtris，150mmnacl，ph8)中。添加1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)，之后通过在冰上超声处理(bransonsonifier250)15min(3x5min，50％功率)进行裂解。然后通过离心(30,000xg，15min)澄清化粗裂解物，并且使用0.45μm注射器过滤器(nalgene)过滤上清液。
gst-ntnha/b纯化。将用结合缓冲液平衡的600μlpierce谷胱甘肽-琼脂糖珠粒(50％浆液；thermo)添加到约20mlgst-ntnha/b上清液，并使其在4℃下分批结合1小时。通过离心(700xg)回收珠，并将其用3倍树脂床体积的结合缓冲液(50mmtris，150mmnacl，ph8)洗涤两次。纯化的gst-ntnha/b的估计浓度为约0.6mg/ml(bca测定和sds-page分析)。
对纯化的bont的ph依赖性复合；蛋白酶激活；和洗脱。将具有gst-ntnha/b的琼脂糖珠粒添加到约5mlbont/b的澄清大肠杆菌裂解物，以在摇摆锥形管中在4度下进行分批结合2小时。通过(700xg)收获珠，并将其用3x树脂床体积的结合缓冲液(50mmmes，150mmnacl，ph6)洗涤两次。
在ph6(在珠上)下以1:10的摩尔比添加胰蛋白酶或lys-c蛋白内切酶(sigma-aldrich)以激活ntnha结合的毒素，最终体积为500μl。使反应在室温下在旋转平台上进行，并通过取样小等分试样用于后续分析对所述反应监测4小时。用结合缓冲液洗涤树脂两次以除去蛋白酶和未结合的杂质。用两倍树脂体积的高ph缓冲液(50mmtris，150mmnacl，ph8)洗脱纯化且激活的bont。
sds-page和wb分析。将10μl所有样品(含有或不含还原剂dtt)应用于9％sds-page凝胶。分离后，对凝胶用考马斯染色法染色或进行标准免疫印迹分析。将人单克隆抗体用于检测bont/b并且将多克隆兔抗体用于检测bont/a1b嵌合毒素。
实施例2
从粗细菌裂解物中容易、直接地分离重组bont
bont与ntnha之间的缔合通过形成特定表面识别的两个分子上的许多ph传感器来促进(gu等人，2012)。这种互锁复合体保护活性毒素免受恶劣的酸性环境的影响，它必须通过所述酸性环境到达其细胞目的地。
本实施例证实了分离大肠杆菌中表达的重组全长bont(无活性bont/b，在下文称为bont/b{ry})的可行性，如本文所述。有利于毒素分离的复合配偶体是其重组复合配偶体ntnha/b的gst标记的相容的血清型。gst标记的ntnha-b分子和bont/b{ry}在大肠杆菌宿主中单独表达，并且使用标准自诱导方法实现蛋白质产生(studier2005)。对于gst-ntnha-b分离，如方法中所述，用琼脂糖-谷胱甘肽珠进行一步法分批纯化。固定化gst-ntnha-b对于4度下的短-中期储存是稳定的，持续大约一周，但是长期储存导致可能的自发切口，如先前所报道(sagane等人2002；gu等人2012)。随后将该试剂用于在简单的工作流程中分离bont/bry和嵌合bont/a1{ry}b1(图6b)，其中琼脂糖珠粒是在有利条件(例如ph6.0，150mmnacl)下将重组毒素从粗裂解物中牵拉出的诱饵。对来自纯化方案的相关级分的sds-page分析示出在图6c中。洗脱后再生的gst-ntnha/b可以容易地用于另一个纯化循环中，以从新鲜或替代提取物中分离出更多相容的毒素。洗脱的全长毒素在珠上缓冲液更换时从复合体选择性释放，并且可以在sds-page上或通过蛋白质印迹(wb)分析可视化(图7a)。此外，用于分离全长(fl)毒素的这种温和条件更可能保持其蛋白酶活性和结合其细胞靶标的功能性作用。作为bont/b的经典神经元受体，在体外荧光各向异性结合测定中显示出突触结合蛋白衍生的标记肽与分离的全长毒素相互作用(图7b)。
复合毒素被外源蛋白酶高效激活
作为双链(ab)毒素，bont表达为单条多肽链，对其进行激活以产生通过重链与轻链之间的二硫键连接的功能分子。通过裂解维持lc与hc之间的共价桥的两个保守半胱氨酸之间的多肽链的外源性或内源性蛋白酶产生“切口”可以增强效力，并且可能是最大效力所需的(图6a)。本实施例证明，可以将此类蛋白酶(例如，特别是外源性蛋白酶)的添加结合到如本文所述的纯化方案工作流程中，并且在一些实施方案中可以帮助最大化对活性毒素的回收。例如，复合的gst-ntnha/b:bont/b{ry}可以在室温下、在温和条件下被催化量的胰蛋白酶或lys-c蛋白内切酶裂解，并且可以在较高ph的缓冲液中选择性地释放带切口的毒素。图8a-8c示出了在含有二硫苏糖醇(dtt)的样品中激活复合单链bont//b{ry}以释放约50kd蛋白酶结构域(lc)和约100kdahc的时程。较低的ph结合条件和较低的蛋白酶活性(kasserra和laidler1969；jekel等人1983)对毒素和/或ntnha的非特异性/过度降解起保护作用(图8b)。毒素切口的纯度和程度可以在sds-page凝胶上可视化或通过wb分析检测(图8a和图8c)。
可以使用常见的ntnha血清型分离嵌合重组毒素
本实施例证实，嵌合重组肉毒杆菌神经毒素可以使用如本文所述的基于复合体的纯化方案、使用可充当未来生物制剂的治疗骨架的各种靶标进行纯化。bont的受体结合结构域介导与ntnha的大部分极性接触(gu等人，2012)。本实施例证实，可以通过与ntnha形成复合体来纯化重组肉毒杆菌神经毒素。将由无活性的bont/alc、bont/ahn和bont/bhc构建的嵌合重组蛋白(bont/a1{ry}b1)用作概念证明。使用上述的相同重组gst-ntnha/b，尽管毒素的表达水平低，但仍可检测到ntnha珠上嵌合毒素的复合和富集(图9)。针对嵌合毒素的澄清裂解物含有降解产物和大杂质，这通常排除了与固定化ntnha的高效复合。因此，将bont/a1{ry}b1裂解物通过一次，并在暴露于琼脂糖树脂上的固定化ntnha之前从ni-nta树脂洗脱。该嵌合毒素的后续激活概况可能与bont/b{ry}类似，但可能具有不同的效率。
讨论
该实施例展示出使用ntnha/b作为非共价前体复合配偶体对重组表达的bont的分离。bont/b{ry}和ntnha/b在大肠杆菌宿主中单独地过表达。ntnha/b表达为融合蛋白，其具有附加于其n末端的gst标签以作为针对固体琼脂糖-谷胱甘肽树脂的亲和部分。bont/b{ry}(和嵌合bont/a1{ry}b1)表达为野生型序列，除了灭活突变和c末端his6x标签之外。在低ph缓冲液中的细菌裂解在裂解物中释放这些毒素，将所述裂解物与具有gst-ntnha/b的琼脂糖珠粒一起孵育。形成复合体后，将固体介质充分洗涤以除去杂质；之后，毒素可以通过高ph缓冲液更换来洗脱，或通过额外的步骤激活，在所述步骤中将外源性蛋白内切酶应用于树脂结合的复合体。
如通过本实施例中记载的发现所证实的，本公开提供了在温和条件下从各种来源高效分离活性、治疗性bont的解决方案。分离、激活和洗脱纯化的bont的增强方法诸如在大规模生产治疗性bont中可以是非常有用的。潜在的益处包括以下项：1)在温和条件下从粗裂解物中高效分离重组bont，而与目前实践中的条件不同(malizio等人2000；donovan2007)；2)高纯度、激活的毒素可以使用单一的纯化方案产生，因为它能够充分洗涤污染物并避免多个色谱步骤；3)固定化ntnha可以适当地保护毒素以在激活步骤中免受非特异性裂解，这可以容易地结合在纯化方案中(与常见的纯化后激活不同)。这可以增加最终激活毒素的最终收率和均一性；和4)固定化gst-ntnha可以用于多次连续纯化，因为它在每个循环结束时再生而几乎没有损失；以及5)这种方法可以扩展到分离具有相容的受体结合结构域的嵌合治疗性毒素。
材料和方法
蛋白质表达和纯化
ntnha/b在pgex载体中表达为谷胱甘肽-s-转移酶融合蛋白(gst-ntnha/b)；bont/b{ry}和bont/a1{ry}b1在大肠杆菌(bl21de3)中在pet32-a载体中表达为具有c末端(his6x)标签。将细胞培养物(通常300ml)在带挡板的2l烧瓶中的自诱导培养基(formediumtm，uk)中于37℃生长，同时剧烈摇动(>250rpm)。当培养物达到约0.6的od时，将细胞培养物转移到20℃振荡培养箱中进行过夜表达(约16小时)。通过在5500xg离心收获细胞，并将所得的沉淀在-20℃下冷冻直至纯化。
将bont/b{ry}细胞沉淀解冻并溶解于含有5ml/g干的细胞沉淀的结合缓冲液(50mmmes，150mmnacl，ph6)中。将gst-ntnha/b细胞解冻并溶解于tbs结合缓冲液(50mmtris，150mmnacl，ph8)中。将苯甲基磺酰氟(pmsf)以0.1mm的终浓度添加到溶解的细胞中，之后通过在冰上超声处理(bransonsonifier250)15min(3x5min)；30％功率进行裂解。然后通过离心(30,000xg，15min)澄清化粗裂解物，并且使用0.45μm注射器过滤器(nalgene)过滤上清液。
gst-ntnha/b纯化
将600μlpierce谷胱甘肽-琼脂糖珠粒(50％浆液；thermo)用结合缓冲液平衡并添加到约20mlgst-ntnha/b上清液，并且使其在温和摇动的平台上在4℃下分批结合1小时。通过离心(700xg)回收珠，并将其用3x树脂床体积的结合缓冲液(1xtbs)洗涤两次。纯化的gst-ntnha/b的估计浓度通常为约0.5mg/ml(bca测定和sds-page分析)。
对纯化的bont的结合、激活和洗脱
将具有gst-ntnha/b的琼脂糖珠粒添加到10-25ml的bont/b{ry}或bont/a1{ry}b1的澄清裂解物(在mes中，ph6)缓冲液中并使其在摇动平台上的50-ml锥形管中在4℃下进行批量结合2小时。通过(700xg)收获珠，并将其用3x树脂床体积的结合缓冲液(mes，ph6)洗涤两次。如果不需要激活，则可以如下所述在该阶段洗脱结合的纯化毒素。
在ph6(在珠上)下以1:10的蛋白内切酶:gst-ntnha/b摩尔比添加胰蛋白酶或lys-c蛋白内切酶(sigma-aldrich)以激活结合的毒素，最终体积为500-1000ul。将反应在室温下在旋转(翻滚)平台上进行并通过取样小等分试样用于后续分析对所述反应进行监测(如图8a和图8c中2-4小时；或如图8b中在4℃下过夜)。用结合缓冲液洗涤树脂两次以除去蛋白酶和杂质。在两倍树脂体积的高ph缓冲液(tbs：50mmtris，150mmnacl，ph8)的级分中洗脱纯化且激活的bont/b{ry}。
sds-page和wb分析
将10μl所有样品(含有或不含还原剂dtt或βme)应用于8％-12％sds-page凝胶。分离后，对凝胶用考马斯染色法染色或进行标准蛋白质印迹程序。使用单克隆兔抗体(1:5000)检测bont/b{ry}，并使用针对bont/a而产生的多克隆兔抗体(1∶2000)检测bont/a1{ry}b1。
荧光各向异性
将人突触结合蛋白1(syt1)衍生肽合成为具有n末端fitc标记(genscript，piscatawaynj)合成(aa33-53)，并且以50-100nm在结合实验中用作受体。将洗脱的全长毒素在vivaspin6过滤单元(10kmwco，ge)中浓缩。使用基于过滤器的板读数器(485/520nm激发/发射)在黑色96孔板(coming)中测量结合实验(50ul)。将bont/a和bont/bhc单独表达和纯化并且分别充当阴性对照和阳性对照。
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<140>
<141>
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<213>人工序列
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<223>/注意=“对人工序列的描述：合成的
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<213>未知
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<221>来源
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<213>未知
<220>
<221>来源
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因子xa肽”
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1
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<211>4
<212>prt
<213>未知
<220>
<221>来源
<223>/注意=“对未知的描述：
因子xa肽”
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<213>烟草蚀纹病毒
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<213>未知
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凝血酶肽”
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<212>prt
<213>未知
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<221>来源
<223>/注意=“对未知的描述：
prescission肽”
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<213>未知
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<221>来源
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myc肽”
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<211>5
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<213>未知
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<221>来源
<223>/注意=“对未知的描述：
irs肽”
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<213>牛乳头状瘤病毒1
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<213>牛乳头状瘤病毒1
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<213>多瘤病毒属
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<213>猿猴病毒40
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抗-xpress肽”
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<221>来源
<223>/注意=“对人工序列的描述：合成的
肽”
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<213>人工序列
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<221>来源
<223>/注意=“对人工序列的描述：合成的
肽”
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<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
<223>/注意=“该序列可包括4-10个残基”
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hishishishishishishishishishis
1510
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<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>/注意=“对人工序列的描述：合成的
肽”
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15
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<212>prt
<213>肉毒梭菌
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