HERV-E反应性T细胞受体及使用方法与流程

本申请要求2016年6月30日提交的美国临时申请62/357,265的权益，其通过引用整体并入本文。发明领域本公开涉及癌症免疫治疗，尤其涉及表达肾细胞癌反应性t细胞受体的t细胞，以及制备和使用所述t细胞的方法。发明背景肾细胞癌(rcc)仅在美国每年会造成大约12,000人死亡。与大多数癌症一样，当在早期被检测出时，手术干预是高度有效的。尽管在用靶向抑制剂和免疫检查点的抑制剂(如抗ctla-4和抗pd-1单克隆抗体)治疗rcc方面已取得了进展，但转移性rcc一般仍具有致死性，平均存活时间不到一年。因此，rcc仍需要更有效的治疗方法。技术实现要素：本文公开了识别表达在rcc细胞上表达的抗原的t细胞受体(tcr)。t细胞可用编码所述tcr(例如，tcrα与β链)的核酸转导并施用于患有rcc的受试者以治疗或抑制受试者中的rcc。本文公开了能够结合由rcc细胞表达的人内源性逆转录病毒-e(herv-e)抗原(例如，具有序列atwlgsktwk的肽；seqidno:1)的tcr。在一些示例中，tcr为由透明细胞肾细胞癌(ccrcc)细胞表达的hla-a11限制性tcr。在一些示例中，tcr包括α链(如具有与seqidno:4有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的α链)和β链(如具有与seqidno:5有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的β链)。在一些示例中，tcrα链由与seqidno:2有至少90％的序列相同性的核酸编码，tcrβ链由与seqidno:3有至少90％的序列相同性的核酸编码。本文还公开了包括编码所公开的tcrα和/或β链的核酸的载体(如病毒载体)，例如，所述核酸与表达控制序列如启动子可操作地连接。在一些示例中，载体还包括编码截短的cd34蛋白质的核酸，如包括细胞外和跨膜结构域但缺少细胞内结构域的cd34蛋白质。在一个非限制性示例中，载体为逆转录病毒载体(如samen载体)，包括编码tcrα链的核酸(如seqidno:2)、编码tcrβ链的核酸(如seqidno:3)和编码截短的cd34的核酸。还公开了表达能结合由rcc细胞(如ccrcc细胞)表达的herv-e抗原的tcr的经修饰的t细胞，如编码tcrα链的核酸(例如，seqidno:2)和编码tcrβ链的核酸(例如，seqidno:3)。在一些示例中，通过用包含核酸的载体转导t细胞来制备经修饰的t细胞，所述核酸编码tcrα链和tcrβ链，和任选存在的，截短的cd34蛋白质。在一些实施方案中，方法包括通过以下治疗患有rcc(例如，ccrcc或转移性ccrcc)的受试者：从受试者或供体获取t细胞群，用包含编码tcrα链的核酸(例如，seqidno:2)和编码tcrβ链的核酸(例如，seqidno:3)的载体转导t细胞群，产生经修饰的t细胞群，给受试者施用含有经修饰的t细胞的组合物。在一些示例中，在用核酸分子进行转导之前，体外激活t细胞群。在其他示例中，在施用于受试者之前，扩增和/或富集经修饰的t细胞群。从参照附图进行的以下详细描述，本发明的前述和其他特征将变得更加明显。附图说明图1为表达本文所述的tcrα和β链的示例性逆转录病毒载体的示意图。cmv，人巨细胞病毒启动子/增强子；ψ，包装信号；sd，剪接供体；sa，剪接受体；tcrα，herv-e抗原特异性tcrα链(例如，seqidno:2)；p2a，源自猪捷申病毒的自裂解2a肽；tcrβ，herv-e抗原特异性tcrβ链(例如，seqidno:3)；t2a，thoseaasigna病毒的自裂解2a肽；cd34t，具有蛋白质的细胞外和跨膜区的截短的cd34；ltr，3’ltr。图2为用于收集和生产经修饰的t细胞用于治疗患有rcc的受试者的示例性方案的示意图。图3a和3b是显示用编码hla-a11限制性tcr的逆转录病毒载体转导的t细胞针对来自两个供体(图3a)和来自一个供体(图3b)的ccrcc细胞的反应活性的曲线图。图4a-4c是一系列标绘图(plot)，显示cd34选择步骤前后其在转导的t细胞中的cd34表达(图4a)和在cd34选择的经转导的t细胞中cd3(图4b)与herv-e四聚物(图4c)的表达。图5a和5b是显示cd34+-herv-e四聚物+的经转导的t细胞中cd8(图5a)和cd4(图5b)细胞的标绘图。图6a和6b是显示用编码hla-a11限制性tcr的逆转录病毒载体转导的t细胞针对来自两个供体的ccrcc细胞的铬细胞毒性的曲线图。来自供体1的t细胞群为39.9％cd8+(图6a)，来自供体2的t细胞群为52.8％cd8+(图6b)。图7是显示用编码hla-a11限制性tcr的逆转录病毒载体转导的t细胞针对来自两个不同供体的rcc或lcl细胞和针对来自hla-a11阴性供体的t细胞以及激活的t细胞的铬释放细胞毒性的曲线图。图8是显示采用来自健康供体的cd8+cd34+t细胞与各个细胞系接触分泌干扰素-γ(ifnγ)的曲线图，所述cd8+cd34+t细胞用编码hla-a11限制性tcr的逆转录病毒载体转导。每个细胞系的herv-e/hla-a11状态如下：sauj：herv-e+/hla-a11+；lyowt：herv-e+/hla-a11neg；snya11+：herv-eneg/hla-a11-转导；urba11+：herv-eneg/hla-a11-转导；whia11+：herv-eneg/hla-a11-转导；orta11+：herv-eneg/hla-a11-转导；ortwt:herv-eneg/hla-a11neg；seawt:herv-eneg/hla-a11neg。标准曲线显示在插图中。图9是显示用于确定患有晚期ccrcc的hla-a11阳性患者中的herv-etcr转导的自体t细胞的安全性和耐受性的示例性i期临床试验的示意图。图10是显示用herv-etcr转导的t细胞治疗患有转移性ccrcc的患者的示例性方案的示意图。序列表采用核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写(如37c.f.r.§1.822中所定义)显示本文或所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列。至少在一些情形下，每个核酸序列仅显示一条链，但是应理解对显示的链的任何引用也包含了互补链。seqidno:1为hla-a11rcc特异性herv-e抗原肽的氨基酸序列。seqidno:2为示例性rccherv-反应性tcrα链的核酸序列。seqidno:3为示例性rccherv-反应性tcrβ链的核酸序列。seqidno:4为示例性rccherv-反应性tcrα链的氨基酸序列。seqidno:5为示例性rccherv-反应性β链的氨基酸序列。seqidno:6为用于表达rccherv-反应性tcr和截短的cd34的示例性samen载体的核酸序列。seqidno:7为示例性截短的cd34(cd34t)蛋白质的氨基酸序列。发明详述异体t细胞克隆分离自rcc患者，所述rcc患者在异体移植后显示出延长的肿瘤退化(takahashi等的j.clin.invest.118:1099-1109,2008)。该hla-a11限制性cd8+t细胞克隆对呈hla-a11阳性的ccrcc细胞系有高细胞毒性，但不杀伤非恶性细胞(takahashi等，2008)。利用cdna表达克隆鉴定了由该克隆识别的由e型内源性逆转录病毒(herv-e)编码的抗原(takahashi等，2008)。该抗原在ccrcc中表达但在正常组织或其他肿瘤类型中却观察不到，并且大约80％的ccrcc肿瘤表达该抗原。本发明人已鉴定了由分离自所述rcc患者的t细胞克隆表达的t细胞受体。如本文所述，该tcr可用于基因转移免疫疗法以治疗rcc患者。t细胞用编码tcrα和β链的基因转导并施用于患有rcc的受试者以将来自受试者的正常t细胞再定向于rcc细胞。i.缩写ccrcc透明细胞肾细胞癌cd34截短的cd34ctl细胞毒性t淋巴细胞herv人内源性逆转录病毒hla人白细胞抗原ltr长末端重复序列mmlv莫洛尼鼠白血病病毒pbmc外周血单个核细胞rcc肾细胞癌tcrt细胞受体ii.术语除非另有说明，根据常规用法使用技术术语。可在以下文献中找到分子生物学中的一般术语的定义：lewin’sgenesx,ed.krebs等，jones和bartlettpublishers,2009(isbn0763766321)；kendre等(eds.),theencyclopediaofmolecularbiology，blackwellpublishers出版,1994(isbn0632021829)；roberta.meyers(ed.),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,wiley,john&sons,inc.,出版1995(isbn0471186341)；和georgep.rédei,encyclopedicdictionaryofgenetics,genomics,proteomicsandinformatics,3rdedition,springer,2008(isbn:1402067534)；以及其他类似参考文献。除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语都具有与所属领域普通技术人员共同理解相同的含义。单数术语“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数个参照物，除非上下文另有清晰指示。类似地，单词“或”意指包括“和”，除非上文另有清晰指示。因此，“包含a或b”意指包含a或b或a和b”。应进一步理解的是，核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并且用于描述。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述相似或等效的方法和材料，但是下文仍描述了适宜的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过援引整体并入。与genbank登录号相关的序列通过援引并入本文，于2016年6月30日登记于genbank中，除非另有所指。如有冲突，以本发明说明书，包括术语解释在内为准(control)。此外，所述材料、方法和示例仅仅是说明性的，并不旨在限制。为了便于对本发明的各个实施方案进行评述，下面提供具体术语的解释：抗原：一种能刺激受试者中的抗体产生或t细胞应答的化合物、组合物或物质。抗原与特定体液或细胞免疫的产物(包括由异源性免疫原诱导的那些)反应。术语“抗原”包括所有有关的抗原表位。“表位”或“抗原决定簇”是指b和/或t细胞所响应的抗原上的位点。在一个实施方案中，当表位连同mhc分子呈递时，t细胞对该表位有响应。表位可由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸形成。当暴露于变性溶剂中时，由连续氨基酸形成的表位通常被保留，而当用变性溶剂处理时，通过三级折叠形成的表位通常会丢失。表位通常包括至少3个并且更通常地包括至少5个、大约9个、大约7-11个或大约8-10个处于独特的空间构象的氨基酸。确定表位空间构象的方法包括，例如，x射线结晶学和二维核磁共振。抗原可以是组织特异性抗原，也可以是疾病特异性抗原。这些术语不是排他性的，因为组织特异性抗原也可以是疾病特异性抗原。组织特异性抗原表达在有限数量的组织中，如单一组织。疾病特异性抗源表达与疾病过程一致。疾病特异性抗原的特定的非限制性示例为其表达与肿瘤(如rcc)形成相关，或可预测肿瘤(如rcc)形成的抗原。自体同源：是指从个体自身组织提取的组织、细胞或核酸。例如，在t细胞的自体转移或移植中，供体和受体为相同的人。自体同源(或“自体(autogeneic)”或“自体(autogenous)”)与自身有关，或源于有机体自身内。cd34：一种作为细胞-细胞粘附分子而发挥功效的细胞表面糖蛋白。cd34为单次(single-pass)跨膜蛋白质，具有高糖基化细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导(signaling)结构域。cd34在造血细胞上表达并在细胞迁移中发挥作用。示例性人cd34序列包括genbank登录号nm_001025109和nm_001773(核酸序列)以及np_001020280和np_001764(氨基酸序列)，所有这些都如于2016年6月30日存在于genbank中那样通过援引并入本文。hla-a11：一种hlaa组内的人白细胞抗原(hla)血清型。hla-a11为一种mhci类分子，其包括由hla-a*11等位基因组编码的α链和由β2-微球蛋白编码的β链。诸如hla-a11的mhci类分子结合肽(抗原)，所述肽通常为7-11个氨基酸长并通过与tcr结合而参与将抗原呈递至t细胞。人内源性逆转录病毒e(herv-e)：herv为整合入人基因组中的古外源性逆转录病毒的残余物。估计herv占人基因组的5-8％。大部分herv已累积了突变或被转录沉默，且不产生全长蛋白质。然而，一些herv在如肿瘤等的环境中具有转录活性。herv-e为位于人染色体6q上的herv亚型。已经鉴定出至少三个来自herv-e(例如，genbank登录号eu137847、eu137847和jq733905)的转录物，所述转录物在rcc细胞中表达，但不在其他肿瘤或非肿瘤细胞中表达(takahashi等j.clin.oncol.118:1099-1109,2008)。可操作地连接：当第一核酸与第二核酸处于功能关系时，第一核酸与第二核酸可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般地，可操作地连接的核酸是连续的，必要时连接两个蛋白质编码区，开放阅读框匹配。重组：重组核酸分子为具有不天然存在的序列或具有通过将两个序列区段人工组合(如不组合所述序列区段是分离的)制得的序列的核酸分子。该人工组合可通过化学合成或通过将分离的核酸分子区段进行人工操作如通过基因工程技术来完成。类似地，重组病毒为具有非天然存在的核酸序列(如包括不来自病毒的异源序列)或通过将不同来源的至少两个序列进行人工组合制得的核酸序列的病毒。术语“重组”还包括已被单独地通过添加，取代或缺失天然核酸分子、蛋白质或病毒的部分而改变的核酸、蛋白质和病毒。肾细胞癌(rcc)：一种源于肾脏细胞的肿瘤。rcc为成年人中最常见的肾癌类型。rcc有多种组织学亚型，包括透明细胞肾细胞癌(ccrcc),其占rcc的60-70％，源于近端小管细胞。ccrcc细胞具有透明细胞质，为腺泡或肉瘤样生长模式。另外的亚型包括但不限于乳头状rcc(也源于近端小管细胞)、嫌色(chromophobic)rcc(源于皮质集合管细胞)、溶瘤rcc(源于皮质集合管细胞的良性赘生物)和集合管rcc(源于髓质结合管细胞)。t细胞：一种白细胞(淋巴细胞)，其为免疫应答的重要中介物。t细胞包括但不限于cd4+t细胞和cd8+t细胞。cd4+t淋巴细胞为在其表面上携带标记的免疫细胞，所述标记称为“分化抗原簇(clusterofdifferentiation)4“(cd4)。这些细胞，又称辅助t细胞，可帮助协调免疫应答，包括抗体应答以及杀伤t细胞应答。cd8+t细胞携带“分化抗原簇8”(cd8)标记。在一个实施方案中，cd8+t细胞为细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。在另一实施方案中，cd8+细胞为抑制t细胞。可通过细胞增殖和/或一种或多种细胞因子(il-2、il-4、il-6、ifnγ或tnfα)的表达或分泌的增加来检测激活的t细胞。还可通过响应于抗原的溶细胞活性的增加来检测cd8+t细胞的激活。在一些示例中，“经修饰的t细胞”为用异源核酸(如一个或多个本文所述的核酸或载体)转导的或表达一种或多种异源蛋白质的t细胞。在本文的一些示例中，可交换地使用术语“经修饰的t细胞”和“经转导的t细胞”。t细胞受体(tcr)：一种在t细胞的表面上的结合抗原(如与mhc分子，例如，抗原呈递细胞上的mhc分子，结合的抗原)的异二聚体蛋白质。tcr包括α和α链，其各自为跨膜糖蛋白。每个链具有与免疫球蛋白可变和恒定结构域同源的可变和恒定区、铰链区、跨膜结构域和胞质尾。与免疫球蛋白类似，tcr基因区段在发育期间重排以产生完整的可变结构域。通过将抗原与tcr结合和协同刺激信号来激活t细胞。例如，cd8+t细胞承载识别特定的表位(当由细胞上的特定hla分子呈递时)的t细胞受体。当已被抗原呈递细胞刺激而变为细胞毒性t淋巴细胞的ctl前体接触承载这种hla-肽配合物的细胞时，ctl与所述细胞形成缀合物(conjugate)并破坏它。转导：将核酸转移至细胞中，如将异源核酸转移至宿主细胞中。如本文所使用，术语转导(或转染，或转化)包括将核酸引入细胞中的所有技术，包括但不限于用质粒载体转化、用病毒载体感染和通过电穿孔、核转染、脂质转染或粒子枪加速引入裸dna。“异源”核酸或蛋白质是指源于不同遗传来源的核酸或蛋白质。例如，与细胞异源的核酸或蛋白质源于与细胞不同的生物体或个体，所述核酸或蛋白质在所述细胞中表达。在其他示例中，异源核酸或蛋白质源于与所述细胞不同的细胞类型，所述核酸或蛋白质在所述细胞中表达。载体：一种允许外来核酸插入但不干扰载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可包括一种或多种可选择的标记基因和其他遗传元件。表达载体为含有必要调控序列以允许转录和翻译一或多个插入基因的载体。在一些非限制性示例中，载体为病毒载体，如逆转录病毒载体。iii.t细胞受体、载体和宿主细胞本文公开了从rccherv-e反应性t细胞系克隆的t细胞受体(例如，tcrα和β链)。还公开了包括所公开的tcr的载体(如表达载体)和包括至少一种编码所公开的tcrα和/或β链的异源核酸的宿主细胞。a.tcr在一些实施方案中，tcr识别表达在rcc细胞上的herv-e肽，如atwlgsktwk(seqidno:1)。tcr包括α和β链核酸或多肽。在一些示例中，tcrα链由包括seqidno:2的核酸序列或由seqidno:2的核酸序列组成的核酸编码。在一些示例中，tcrβ链由包括seqidno:3的核酸序列或由seqidno:3的核酸序列组成的核酸编码。在一些示例中，tcrα链多肽包括seqidno:4的氨基酸序列或由seqidno:4的氨基酸序列组成。在一些示例中，tcrβ链多肽包括seqidno:5的氨基酸序列或由seqidno:5的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本文公开的编码tcr的核酸具有与seqidno:2或seqidno:3的核酸序列有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，如100％)相同性的序列。在其他实施方案中，本文公开的tcr多肽具有与seqidno:4或seqidno:5的氨基酸序列有至少95％(如至少96％、、97％、98％、99％或100％)相同性的序列。可采用互联网上易于得到的计算机程序和本文所述的核酸与氨基酸序列获得示例性序列。在一个示例中，例如，在tcrα和β链的上下文中，当所述多肽被t细胞表达时，其保留所公开的tcr多肽的至少一种活性，如结合rcc特异性抗原表位(例如，seqidno:1)。对编码tcrα和/或β链的核酸或一级氨基酸序列进行微小修饰可导致产生具有与本文所公开的未修饰的相应多肽相比基本等效的活性的多肽。这种修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可能是自发的。通过这些修饰产生的所有多肽都包括在本文中。因此，tcrα或β链多肽的特定的非限制性示例为tcrα或β链多肽的保守性变体(如单一保守性氨基酸取代，例如，一个或多个保守性氨基酸取代，例如，1-10个保守性取代、2-5个保守性取代、4-9个保守性取代，如1、2、5或10个保守性取代)。本文提供保守性取代表(表1)。基于该表可进行seqidno:4和5所示的氨基酸序列的取代。然而，应理解的是，在不显著改变多肽活性的前提下也可进行非保守性氨基酸取代。本领域普通技术人员可基于序列比对和其他可得的序列分析工具选择可以取代的氨基酸。表1示例性保守性氨基酸取代原始残基保守性取代alaserarglysasngln、hisaspglucysserglnasngluasphisasn、glnileleu、valleuile、vallysarg、gln、glumetleu、ilephemet、leu、tyrserthrthrsertrptyrtyrtrp、phevalile、leub.载体本文还公开了包括编码herv-e反应性tcr的核酸的载体。载体包括与一个或多个表达控制元件可操作地连接的编码所公开的tcr(如与seqidno:2和/或seqidno:3有至少90％相同性的核酸)的α和β链中的一者或二者的核酸。在具体的实施方案中，载体包括编码tcrα链的核酸(例如，编码seqidno:4的核酸，如seqidno:2)和编码tcrβ链的核酸(例如，编码seqidno:5的核酸，如seqidno:3)。然而，在其他示例中，可由不同的载体表达tcrα链和tcrβ链。表达控制元件为控制或调节核酸的转录和/或翻译的序列，如启动子、增强子、前导序列、转录终止子、起始和/或终止密码子、内部核糖体进入位点(ires)、剪接信号和聚腺苷酸化信号。载体还可含有另外的用于载体的转移和后续复制的元件，如复制起点和可选择标记。在一些示例中，载体为病毒载体，其包括编码所公开的tcrα和β链中的至少一者的核酸(如与seqidno:2或seqidno:3有至少90％的序列相同性的核酸)。在特定的实施方案中，载体为逆转录病毒载体。适用于将基因递送至t细胞的另外的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、牛痘病毒载体、甲病毒载体、疱疹病毒载体和禽豆病毒载体。在其他示例中，载体为质粒或杆状病毒载体。本领域普通技术人员可选择适宜的载体，例如，以用本文描述的tcr稳定或瞬时转导t细胞。在一些实施方案中，载体为包括编码tcrα和β链中的一者或二者的核酸的逆转录病毒载体。在具体的示例中，载体为经修饰的逆转录病毒载体，其中已缺失了病毒编码的蛋白质(例如，以防止产生有复制能力的病毒，减少不需要的免疫源性和/或适应目的基因的插入)。示例性逆转录病毒骨架包括基于莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)的那些，如lxsn和samen载体(clay等的pathol.oncol.res.5:3-15，1999)。因此，在一个示例中，载体为samen逆转录病毒载体，其包括编码具有与seqidno:4有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的tcrα链的核酸(如与seqidno:2有至少90％的序列相同性的核酸)。在另一示例中，载体为samen逆转录病毒载体，其包括编码具有与seqidno:5有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的tcrβ链的核酸(如与seqidno:3有至少90％的序列相同性的核酸)。在另一示例中，载体为samen逆转录病毒载体，其包括编码具有与seqidno:4有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的tcrα链的核酸(如与seqidno:2有至少90％的序列相同性的核酸)和编码具有与seqidno:5有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的tcrβ链的核酸(如与seqidno:3有至少90％的序列相同性的核酸)。在一个非限制性示例中，载体为samen逆转录病毒载体，其包括编码具有seqidno:4的氨基酸序列的tcrα链的核酸(如seqidno:2的核酸序列)和编码具有seqidno:5的氨基酸序列的tcrβ链的核酸(如与seqidno:3的核酸序列)。在tcrα链和β链核酸都存在的载体中，α链和β链核酸可由ires或启动子分开，以使α链和β链核酸都被转录和/或翻译。在其他示例中，α链和β链核酸由编码肽裂解位点或“自裂解”肽(如病毒2a肽，例如，猪捷申病毒-12a或thoseaasigna病毒自裂解肽(参见，例如，kim等的plosone6:e18556,2011))的核酸分离。在另外的实施方案中，载体还包括编码可选择标记的核酸，所述可选择标记允许鉴定和/或富集用载体转导的细胞。示例性的可选择标记包括抗生素抗性基因(如新霉素抗性)、胸苷激酶、荧光蛋白质(如绿色荧光蛋白)或β-半乳糖苷酶。在其他示例中，可选择标记包括细胞表面表达的蛋白质，其可用于鉴定经转导的细胞(例如，使用流式细胞术或免疫磁性分离法)。在一个非限制性示例中，本文公开的载体包括编码缺少细胞内信号转导结构域的截短的cd34蛋白质(cd34t)的核酸。cd34t蛋白质具有cd34的细胞外和跨膜区，以及结果，其表达在细胞表面，但不影响表达截短的蛋白质(norell等的cancerimmunol.immunother.59:851-862，2010)的细胞的活性。表达cd34t的细胞可用抗cd34抗体鉴定，并采用流式细胞术或免疫磁性法分离。在一个示例中，编码cd34t的核酸包括seqidno:6的第4028-4975位核苷酸的序列或与seqidno:6的第4028-4975位核苷酸有至少95％(如至少95％、96％、97％、98％、99％或以上)序列相同性的序列或由seqidno:6的第4028-4975位核苷酸的序列或与seqidno:6的第4028-4975位核苷酸有至少95％(如至少95％、96％、97％、98％、99％或以上)序列相同性的序列组成。在具体的示例中，cd34t蛋白质包括与seqidno:7的氨基酸序列有至少95％(如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列相同性的氨基酸序列或由与seqidno:7的氨基酸序列有至少95％(如至少95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列相同性的氨基酸序列组成。一种用于表达所公开的tcrα和β链的示例性逆转录病毒载体(如samen载体)在图1中示出。载体包括5’长末端重复序列(ltr)(包括启动子/增强子如融合至mmlv’5ltr的人巨细胞病毒启动子/增强子)、包装信号(ψ)、编码tcrα链的核酸(例如，seqidno:2)、第一自裂解2a肽(如猪捷申病毒自裂解2a(p2a)肽)、编码tcrβ链的核酸(例如，seqidno:3)、第二自裂解2a肽(如thoseaasigna自裂解2a(t2a)肽)、编码截短的cd34蛋白质的核酸和3’ltr。在一些示例中，载体包括seqidno:6的核酸序列或由seqidno:6的核酸序列组成。在其他示例中，载体含有与seqidno:6的核酸序列有至少95％(如95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列相同性的核酸序列或由与seqidno:6的核酸序列有至少95％(如95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列相同性的核酸序列组成。在本文提供的示例性载体中，由seqidno:6的核苷酸2165-2971编码tcrα链，由seqidno:6的核苷酸2972-3037编码p2a肽，由seqidno:6的核苷酸3038-3958编码tcrβ链、由seqidno:6的核苷酸3959-4027编码t2a肽，由seqidno:6的核苷酸4028-4975编码cd34t受体。c.宿主细胞本文还公开了宿主细胞，其包括编码所公开的tcrα链和/或所公开的tcrβ链的核酸，如编码tcrα链、tcrβ链或二者的载体。在一些示例中，宿主细胞为能够产生包括载体的重组病毒的细胞(例如，生产者细胞)。在其他示例中，宿主细胞为淋巴细胞(例如，t细胞)。将载体引入至宿主细胞的方法对本领域普通技术人员来说是已知的并且包括转化(例如，用质粒载体)、感染(例如，用病毒载体)和电穿孔、核转染、脂质转染或粒子枪加速(例如，裸dna)。在由逆转录病毒载体(如所公开的samen载体)表达tcrα和/或β链的示例中，重组病毒载体的生产需要由辅助病毒或包装细胞系表达的病毒蛋白质。因此，在一些示例中，将本文公开的病毒载体与表达病毒蛋白质(如gag、pol和/或env)的辅助病毒一起引入宿主细胞(如293细胞系)中。在其他示例中，将本文公开的病毒载体转导至稳定表达病毒gag、pol和env蛋白质的包装细胞系中。示例性包装细胞系包括nih-3t3细胞系，如gp&e86、pg13和pa317细胞系(markowitz等j.virol.62:1120-1124，1988；miller等j.virol.65:2220-2224，1991；miller等mol.cellbiol.6:2895-2902，1986)或293细胞系，如293gpg细胞，gp2-293细胞。因此，在一个实施方案中，宿主细胞为生产者细胞，如用本文所述的病毒载体转导的包装细胞系。在一个非限制性示例中，病毒载体为编码herv-e特异性tcrα链和β链以及截短的cd34a蛋白质的samen载体(如具有seqidno:6的核酸的载体)。在一些示例中，生产者细胞系是gmp合格的。在一个示例中，生产者细胞系为包括编码herv-e特异性tcrα链和β链以及截短的cd34蛋白质的samen载体(如具有seqidno:6的核酸的载体)的pg13包装细胞系。在一些示例中，宿主细胞为淋巴细胞，如t细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞为t细胞(如富集或扩增的t细胞群)，所述t细胞包括编码所公开的tcrα和β链中至少一者的异源核酸。在一些示例中，淋巴细胞包括编码具有与seqidno:4有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的tcrα链的异源核酸(如与seqidno:2有至少90％的序列相同性的核酸)。在另一示例中，淋巴细胞包括编码具有与seqidno:5有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的tcrβ链的异源核酸(如与seqidno:3有至少90％的序列相同性的核酸)。在另一示例中，淋巴细胞包括编码具有与seqidno:4有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的tcrα链的异源核酸(如与seqidno:2有至少90％的序列相同性的核酸)和编码具有与seqidno:5有至少95％的序列相同性的氨基酸序列的tcrβ链的异源核酸(如与seqidno:3有至少90％的序列相同性的核酸)。在一个非限制性示例中，淋巴细胞包括编码具有seqidno:4的氨基酸序列的tcrα链的异源核酸(如seqidno:2的核酸序列)和编码具有seqidno:5的氨基酸序列的tcrβ链的异源核酸(如seqidno:3的核酸序列)。在另外的示例中，淋巴细胞还包括编码截短的cd34蛋白质(例如，缺少细胞内或信号转导结构域的cd34蛋白质)的异源核酸。在一些实施方案中，用本文公开的载体转导淋巴细胞(如淋巴细胞群)。转导后，tcrα链和/或β链的表达可通过本领域技术人员已知的方法确定，如采用标记抗体或检测对相关(cognate)肽(如seqidno:1)的反应性的流式细胞术。在一些示例中，如果tcrα和/或β链与cd34t共表达，则也可采用抗cd34抗体检测和/或富集经转导的细胞，例如，利用流式细胞术或免疫磁性技术(例如，cd34试剂系统,miltenyibiotecinc.,sandiego,caor300磁性细胞选择系统,nexelltherapeuticsinc.,irvine,ca)进行检测和/或富集。在一些实施方案中，通过例如血液成分分离术从受试者获取淋巴细胞群(如pbmc群)来产生表达所公开的tcrα和β链的经修饰的(例如经转导的)t细胞。在进行转导前激活淋巴细胞群中的初始态或休眠的t细胞，所述激活通过，例如，将淋巴细胞与一个或多个细胞因子(如il-2、il-4、il-6、il-7、il-12、il-15和il-23中的一个或多个)接触进行。在一些示例中，将淋巴细胞与抗cd3抗体和il-2接触1-4天(如1天、大约2天、大约3天或者大约4天)，产生激活的t细胞。在一些示例中，将淋巴细胞与30ng/ml抗cd3抗体和300iu/mlil-2接触2或3天。用本文公开的载体转导激活的t细胞，例如，通过感染(在病毒载体的情形下)或通过转染或转化(在质粒或裸dna载体的情形下)进行。在一些示例中，富集和/或扩增经转导的t细胞。例如，如果载体包括编码截短的cd34分子的核酸，可通过将转导的t细胞群与抗cd34抗体接触并纯化表达cd34的细胞(例如，采用流式细胞术或免疫磁珠)来选择或富集转导的t细胞，例如在转导后大约2-4天进行。也可通过用抗cd3(例如，大约30nm/ml)、抗cd28(例如，大约30nm/ml)和/或il-2(例如，大约300iu/ml)培养经转导的t细胞一段时间(如大约7-14天或9-11天)来扩增经转导的t细胞。在一些示例中，通过在经辐照的pbmc细胞上进行培养来扩增转导的t细胞。iv.治疗或抑制肾细胞癌的方法本文公开了通过给受试者施用表达tcr(例如，tcrα和β链)的t细胞(或t细胞群)治疗或抑制受试者中的rcc的方法，所述tcr与由rcc细胞表达的抗原或表位结合。在一些示例中，所述方法包括给患有rcc(如ccrcc、晚期ccrcc或转移性ccrcc)的受试者施用本文所述的经修饰的t细胞。在具体的示例中，受试者是hla-a11阳性的，并患有ccrcc。本文所述的经修饰的淋巴细胞(例如，经修饰或转导的t细胞)可并入药物组合物中。在一些示例中，所述组合物包括大约104-1012个经修饰的t细胞(例如，大约104-107个细胞、大约106-109个细胞或大约108-1012个细胞)。例如，可制备组合物，从而个受试者施用大约5x106至5x108个经修饰的t细胞/kg。这种组合物通常包括经修饰的t细胞群和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”包括与药物施用兼容的任意和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这种载体或稀释剂的示例包括但不限于水、盐水、ringer’s溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水溶性运载体，如不挥发油。组合物中还可并入补充的活性化合物。用于制备可施用组合物的实际方法对本领域技术人员来说是已知的或是明显的，并且在如以下文献的出版物中更详细地描述：remington:thescienceandpracticeofpharmacy,theuniversityofthesciencesinphiladelphia,editor,lippincott,williams,&wilkins,philadelphia,pa,21stedition(2005)。通过施用本文公开的经修饰的t细胞开始对受试者进行体内治疗。尽管也可直接注射入实体瘤或其他病灶(focallesion)中，但通常经静脉内或腹膜内输注施用。一般地，通过减少/清除病灶(lesion)(例如，采用recist标准)来评估治疗的功效。通过成像(如mri、pet和/或ct成像)来评价病灶的尺寸和数目。在一些示例中，每一个月、每3个月或每6个月进行分期。在一些示例中，还可在输注后的一个或多个时间点分析来自受试者的血液样品以定量存在的经修饰的t细胞的数目(例如，在表达cd34t的经修饰的t细胞的情形下，通过评估表达cd34的cd3+细胞的绝对数目和/或百分比进行)。可施用多剂经修饰的t细胞群。例如，可每天、每隔一天、每周两次、每周、每隔一周、每三周、每月或频率更低地施用经修饰的t细胞群。在一个特定的示例中，施用单次输注的经修饰的t细胞；然而，熟练的临床医生可根据受试者、正在治疗的病症、先前的治疗历史和其他因素选择替代的方案。在一些实施方案中，受试者有rcc，如ccrcc。鉴定患有rcc或ccrcc的受试者的方法对本领域普通技术人员来说是已知的，包括rcc的放射影像证据(例如，超声成像、mri、ct扫描或pet扫描)和/或确认rcc存在的活检(如细针抽吸或针刺活检)。在一些示例中，受试者有转移性rcc。在另外的示例中，患有rcc的受试者也是hla-a11+，且肿瘤表达herv-e前病毒(例如，表达包含seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质)。在一些实施方案中，方法包括选择患有rcc(如ccrcc)的患者以用经修饰的t细胞进行治疗，所述患者为hlaa11+，并且所述患者的肿瘤表达包含seqidno:1的蛋白质。在具体的实施方案中，方法包括从患有rcc的受试者(如患有ccrcc的受试者，其为hlaa11+，并且其肿瘤表达herv-e前病毒，如包含seqidno:1的蛋白质)获取包括淋巴细胞的细胞群。在其他示例中，从与待治疗的受试者(如，患有ccrcc的受试者，其为hlaa11+，并且其肿瘤表达herv-e前病毒，如包含seqidno：1的蛋白质)hla匹配的供体获取包括淋巴细胞的细胞群。图中示出了从受试者收集和转导t细胞的示例性方案。可通过包括但不限于血液成分分离法的任意方法获取包括淋巴细胞的细胞群(如pbmc)。可立即使用全部或部分细胞群，也可冷藏保存全部或部分细胞以供将来使用。当准备使用时，解冻全部或部分细胞群(如果先前已冷藏保存)，并通过与抗cd3抗体(如okt3)温育激活t细胞。在一些示例中，大约107-109个pbmc与抗cd3单克隆抗体(例如，大约30ng/ml)，和任选地，还与il-2(例如，大约300iu/ml)和/或il-15(大约10-100ng/ml)温育。在一个特定的示例中，将大约6x108个pbmc与抗cd3抗体和il-2温育大约1-5天(如大约1天、大约2天、大约3天、大约4天或大约5天)。在另一特定的示例中，将大约6x108个pbmc与抗cd3抗体okt3、il-2和il-15温育大约1-5天(如大约1天、大约2天、大约3天、大约4天或大约5天)。在一些示例中，在t细胞激活之后，任选地，去除细胞中的cd4+细胞。在一些示例中，使用抗cd4+抗体去除cd4+细胞以产生cd4耗竭的细胞群，例如，利用流式细胞术或免疫磁性技术(例如，cd4reagentsystem,miltenyibiotecinc.,sandiego,ca)或对与抗cd4抗体结合的cd4+t细胞进行红细胞复位(erythrocyteresetting)进行所述去除。在其他示例中，可在转导后或扩增经转导的t细胞后进行cd4耗竭。在一些示例中，cd4耗竭的细胞群为t细胞的cd8+t细胞群(例如，基本上为cd8+t细胞的t细胞群，如cd8+t细胞为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的t细胞群)。t细胞激活(和任选存在的cd4+细胞耗竭)后，用包括编码herv-e反应性tcrα链、tcrβ链或二者的异源核酸的载体(如一个或多个以上iiib部分中描述的载体)转导细胞。在具体的示例中，转导大约107-109个细胞(例如，大约1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个细胞)。在一个非限制性示例中，转导大约2x108个细胞。在一些示例中，载体还包括编码截短的cd34蛋白质的异源核酸。因此，在一些示例中，使用cd34特异性抗体富集转导的t细胞(如流式细胞术或免疫磁性纯化)。离体扩增经转导的t细胞(或任选地，cd34富集的经转导的t细胞和/或cd34富集的cd4耗竭的经转导的t细胞)，并在扩增后以适宜的剂量(例如，大约106-1012个细胞)冷藏保存。在一个特定的示例中，在含有300iu/mlil-2、30ng/ml抗cd3和30ng/ml抗cd28的培养基中在辐照过的异体pbmc饲养细胞(40,000,000细胞每250,000t细胞)上扩增经转导的t细胞。扩增足够时间以获取所需数目的t细胞，例如，大约4-14天(如4-9天、8-12天、9-14天、9-11天)。在一些示例中，在第5、第8和第11天用新鲜的il-2补充t细胞。在一些非限制性示例中，任选地，扩增可以在wave生物反应器(gehealthcarelifesciences，pittsburgh，pa)中进行，至少持续部分扩增过程(foratleastaportionoftheexpansion)，如大约1-5天，例如从扩增方案的第9至第14天。本领域普通技术人员可确定离体扩增t细胞的其它方法，所述方法也可用于与本文所述的经转导的t细胞(参见，例如，u.s.pat.no.5,827,64与riddell和greenberg,j.immunol.meth.128:189-201，1990，通过援引整体并入本文)。在给受试者施用之前，解冻(如先前已冷冻)经转导的(经修饰)t细胞。在施用经修饰的t细胞之前，受试者可以经历免疫抑制方案(例如，淋巴细胞删除)。在一个示例中，在施用经修饰的t细胞之前，给受试者施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。在一个非限制性示例中，在第-5天和第-4天给受试者施用环磷酰胺(例如，60mg/kg)，和/或在第-5天至第-1天给受试者施用氟达拉滨(例如，25mg/m2)(其中，第0天时施用经修饰的t细胞)。在另外的非限制性示例中，在第-5天给受试者施用环磷酰胺(1,000mg/m2iv)，在第-5天至第-3天向受试者施用氟达拉滨(30mg/m2)(其中，第0天时施用经修饰的t细胞)。例如，通过输注给受试者施用经修饰的t细胞。在一些示例中，施用t细胞的剂量为大约104至1012个经修饰的t细胞(例如，大约104-107个细胞、大约106-109个细胞或大约108-1012个细胞或大约1x106至1x109个经修饰的t细胞/kg(如大约1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108或1x109个细胞/kg))。也可给受试者施用免疫系统支持疗法，例如，以促进经修饰的t细胞在受试者中扩增和/或支持中性粒细胞恢复。在一个非限制性示例中，给受试者施用il-2(例如，每8小时72,000iu/kgiv)10天和/或从第1天开始每天施用g-gsf(例如，300-480μgsc)，直到中性粒细胞的绝对计数大于500。在另一示例中，免疫系统支持疗法包括施用经修饰的t细胞后每12小时施用2x106i.u./m2，持续7天。通过标准方法如肿瘤大小、病灶数目、肿瘤分期、应答速率或者本领域普通技术人员已知的其他准则监测治疗效果。在一些示例中，原发性肿瘤或转移瘤尺寸的减小(例如，由标准的recist或irrecist准则定义)表明受试者中rcc受到了抑制。参见，例如，eisenhauer等eur.j.cancer45:228-247,2009；wolchock等clin.cancerres.15:7412-7420,2009；二者通过援引并入本文。在其他示例中，无进展存活和/或整体存活(例如，1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、2年或更长，如1-2个月、6-8个月、1-2年或更长)表明受试者中rcc受到了抑制。在其他示例中，根据基线临床结果，在治疗期间的不同时间点和在疾病进展的时间，对循环herv-etcr转导的cd34+或cd8+/cd34+t细胞的持续性、免疫细胞亚群的变化和t细胞的激活状态以及其他免疫决定因素的一种或多种进行评价。在一些示例中，也给受试者施用一种或多种另外的治疗，如用转导的t细胞进行治疗之前、同时或之后施用一种或多种治疗剂、手术切除和/或放疗。本领域技术人员可选择治疗剂，与本文公开的经修饰的t细胞组合施用于患有rcc的受试者。这种药剂(agent)包括抗vegf剂(如帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、卡博替尼、索菲拉尼、乐伐替尼和/或贝伐单抗)、mtor抑制剂(如替西罗莫司和/或依维莫司)、免疫核查点抑制剂(如纳武单抗(nivolumab))和/或细胞因子疗法(如ifnα和/或il-2)。实施例提供以下实施例以说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被视为将本发明限制为所描述的具体特征或实施方案。实施例1由herv-ect-rcc1反应性cd8+t细胞克隆t细胞受体先前鉴定了cd8+hla-a11限制性rcc反应性t细胞克隆(takahashi等的j.clin.invest.118:1099-1109，2008)。该rcc反应性ctl识别herv-e肽atwlgsktwk(seqidno:1)(takahashi等2008)。从hla-a11限制性识别ccrcc细胞的t细胞克隆中提取总rna，并通过5’race鉴定全长tcr链。本文以seqidno:2和3分别公开编码tcrα和β链的核酸。本文以seqidno:4和5分别公开tcrα和β链的氨基酸序列。将编码tcrα和β链的核酸(seqidno:2和3)克隆到逆转录病毒构建体中，所述载体包括与β链连接的截短的cd34分子的(图1)。截短的cd34盒包括细胞外和跨膜结构域，但缺少细胞内信号转导结构域，所以在细胞中不发挥功能，但其表达允许基于cd34的表面表达富集转导的t细胞。载体的序列如seqidno:6所示。实施例2用针对ccrcc细胞的hla-a11限制性tcr转导的t细胞的反应性用实施例1中描述的载体转导来自两个健康供体的pbmc。经转导的t细胞特异性杀伤hla-a11+和herv-e+ccrcc细胞(图3a和3b)。ct-rcc-1肽(seqidno:1)的加入增加了对herv-e阴性和herv-e阳性细胞的反应性，如所期望(如3a和3b)。实施例3生产者克隆的开发将实施例1中描述的含有该tcr的逆转录病毒载体引入pg13包装细胞系中，分离出高滴度逆转录病毒生产者克隆以供临床应用。以有限稀释法克隆pg13生产者细胞系，产生高滴度克隆。然后，就将抗herv-e反应性有效转导和转移至人t细胞中的能力筛选克隆。选择两个克隆(7g1和27a7)用于进一步测试。基于该目的，由每个克隆制备逆转录病毒，分别进行全量程验证。用来自克隆7g1或27a7的逆转录病毒转导来自2个健康供体的t细胞。它们分别为63.2％和67.5％或65.2％和61.6％cd34+,表明这两个克隆都转导t细胞，效率相同。采用免疫磁珠对转导的细胞进行cd34纯化后，培养物分别为99.3％和98.4％或99.4％和99.7％cd34+，表明纯的tcr转导t细胞培养物。对两个克隆都产生5x106个细胞每瓶的主细胞库(7g1，212瓶，而27a7，220瓶)。由7g1克隆制备3升大量病毒，将7g1克隆和7g1病毒送到位于印第安纳大学的载体生产设施/国家基因载体生物库进行gmp质量认证(qualification)。实施例4评价herv-etcr转导的t细胞使用来自pg13逆转录病毒生产者克隆7g1的上清液转导正常的源自pbl的t细胞。转导后3天，细胞与抗cd34包覆的免疫磁性颗粒一起温育，采用clinimacs纯化，并对cd34表达进行染色。在选择前，有63.2％的细胞表达cd34，这在选择后增加至99.3％(图4a)。cd34+细胞表达cd3(图4b)并用herv-e四聚物染色呈阳性(图4c)。cd34选择的细胞主要为cd8+细胞(图5a)，只有少部分为cd4+细胞(图5b)。评价如实施例2中所述的经转导的t细胞。如铬释放细胞毒性所确定的，经转导的t细胞可特异性地杀伤hla-a11+和herv-e+ccrcc细胞(图6a和6b)。加入ct-rcc-1肽(seqidno:1)增加了对herv-e阴性细胞的反应性(图6a和6b)。来自供体1的t细胞群为39.9％cd8+(图6a)，来自供体2的t细胞群为52.8％cd8+(图6b)。也对用实施例1中所述的载体转导的来自健康供体的pbmc进行测试，测试特异性杀伤rcc细胞和t细胞。表达hla-a11+和herv-e的sayujrcc细胞被特异性杀伤，而hla-a11-herv阴性细胞(suj-lcl)则未被杀伤(图7)。无论表达herv-e(lyo-rcc)或不表达(lyo-lcl)，hla-a11-细胞也都不会被杀伤。最后，来自hla-a11+供体的t细胞未被杀伤(图7)。采用一组(apanelof)ccrcc细胞系作为目标物，通过由酶联免疫吸附测定(elisa)测量干扰素-y(inf-γ)分泌，对herv-etcr转导的t细胞的抗原特异性进行评价。图8显示，仅当与hla-a11阳性并表达ct-rccherv-e的ccrcc细胞共培养时，经转导的t细胞产生inf-γ(＞两倍背景和＞1ng/ml)。实施例5确定herv-etcr转导的t细胞的安全性和耐受性本实施例描述了可用于确定用herv-etcr转导的t细胞治疗ccrcc的安全性和耐受性的方法。然而，本领域技术人员会认识到，也可采用不同于这些特定方法的方法来成功地确定herv-etcr转导的t细胞的安全性和耐受性。图9是显示用于确定herv-etcr转导的t细胞(例如，在临床实施之前)的安全性和耐受性的示例性方案的示意图。选择患有转移性herv-e阳性ccrcc且呈hla-a11阳性的受试者进行本研究，所述ccrcc不适合完全手术切除，并且所述ccrcc在临床上或放射性成像上是进行性的、二维可评价的。对受试者进行15-20升白细胞血液成分分离，收集(并且任选地冷藏保存)1x1010个pbmc。接着，解冻pbmc(6x108至2x109个细胞)并在含有抗cd3(例如，50ng/mlokt3)和il-2(例如，300iu/ml)(和任选存在的il-5，例如，100ng/ml)的培养基中激活pbmc(6x108至2x109个细胞)2-3天，然后采用免疫磁性法耗尽表达cd4的细胞。用编码hla-a11限制性herv-etcr和cd34t的逆转录病毒(如实施例1中所述)转导大约200x106个t细胞。转导后，采用cd34+免疫磁珠选择法富集0.5-1x106个经转导的t细胞/kg，然后采用辐照过的异体pbmc饲养细胞(从3个健康供体汇集)在含il-2/il-15的培养基(例如，300iu/mlil-2和100ng/mlil-15)中离体扩增9-11天。在所述方案的一些实施方案中，将阳性选择的cd34+t细胞置于rep中，快速产生输注所需的细胞数。由患者的体重和输注组(cohort)确定置于rep中的经转导的细胞的数目。为启动rep，在含有150ml具有30ng/ml可溶性抗hcd3抗体(okt3)的完全细胞因子培养基(rhil2/rhil15)的直立t175cm2烧瓶中将1x106个herv-etcr转导的细胞与200x106个饲养细胞组合。所述饲养细胞由来自至少3个单独的正常供体的pbmc组成，其混合在一起并且进行5000rad的辐照。将烧瓶直立置于润湿的5％co2培养箱中5-6天。从培养箱中移出烧瓶，收集细胞，对细胞计数，并重悬于含有300iu/ml-il2和100ng/mlil15的新鲜培养基中。将细胞悬浮液转移至wave生物反应器袋子中以进行进一步扩增。利用wave生物反应器灌注系统，每天用含有细胞因子的新鲜培养基对培养基进行补充。以适宜的剂量水平(参见下文)将经转导和扩增的t细胞冷藏保存，用于在用免疫抑制性化疗进行治疗后进行后续输注到各个受试者中。依次在4个不同的t细胞剂量升高的组(5x106个t细胞/kg、5x106个t细胞/kg、1x107个t细胞/kg或5x107个t细胞/kg)的每组登记三个受试者。受试者经历非脊髓抑制性免疫抑制调节方案，所述方案用环磷酰胺1,000mg/m2iv(第-5天)，氟达拉滨30mg/m2i.v.每天30分钟以上，持续3天(第-5天至第-3天)，然后在第0天输注herv-etcr转导的t细胞以递送靶向的t细胞剂量。在输注之前，t细胞进行最终细胞计数，并进行活力和无菌性评估。在t细胞输注后，监测受试者的与输注有关的毒性标记多至4小时。在t细胞输注前的前驱给药(premedication)为对乙酰氨基酚和i.v.苯那君。在t细胞输注后，受试者接受il-2i.v.12小时，剂量为2,000,000iu/m2，持续7天(第0天至第+6天)，从第1天开始每天接受g-csf300μg，直到中性粒细胞恢复(anc>500)。受试者在中性粒细胞恢复后从临床中心出院并每周进行回访，持续6-8周，其中受试者接受包括身体检查和体重以及常规临床实验室(血液学和电解质)在内的标准评估。在t细胞输注后30天，采用recist标准，利用pet和ct成像进行再分期，然后第一年每3个月进行再分期，再然后每6个月进行再分期，直到出现肿瘤进展的证据。研究中逐步、减少或暂停剂量增加的决定将遵循表2中概述的规则。表2由于与过继性细胞转移相关的不良事件一般在t细胞注射后21天内出现，在治疗组中的下一个受试者或下一个组中的第一个受试者之前，在t细胞输注后，观察每个受试者21天。因此，在对每个患者进行herv-etcr转导的t细胞输注到下一个登记的患者开始进行调理化疗之前最少有21天。剂量限制性毒性(dlt)被定义为导致t细胞输注中断和/或导致判断为可能或肯定地与herv-etcr转导的cd8+/cd34+t细胞输注有关的所有3级和4级毒性的任意不良事件，除了以下情形：·骨髓抑制，定义为淋巴细胞减少、中性粒细胞减少和血小板减少。·il-2预期毒性(14.3部分描述)。·氟达拉滨和环磷酰胺预期毒性。·细胞输注(与细胞输注有关)2小时内发生的即发超敏反应(除了有症状的支气管痉挛和4级低血压)，所述即发超敏反应用标准支持性治疗在细胞施用24小时内可逆至2级或更低。·3级发烧。·3级自身免疫，其在10天内降至小于或等于2级自身免疫毒性。·3级代谢实验室异常，无显著临床后遗症，7天内降至2级。t细胞输注后，在多个时间点抽取血液样品来评估循环性herv-etcr转导的t细胞，其通过定量表达cd34的cd3+细胞的百分比和绝对数目进行分析。具有易于活检的肿瘤的患者还可进行转移性肿瘤病灶的选择性细针抽吸以使用与上述相同的方法来评估herv-etcr转导的t细胞。受试者随访长达5年，并且当记录有疾病进展时取消研究。实施例6用herv-etcr转导的t细胞治疗肾细胞癌本实施例描述了可用herv-etcr转导的t细胞治疗患有rcc的受试者的方法。然而，本领域技术人员将认识到也可使用不同于这些特定方法的方法来用herv-etcr转导的t细胞成功地治疗患有rcc的受试者。图10是显示用于治疗患有rcc的受试者的示例性方案的示意图。对患有rcc(如转移性ccrcc)的hla-a11阳性和herv-e阳性受试者进行血液成分分离以收集t淋巴细胞。用30ng/ml抗cd3抗体和300iu/mlil-2体外激活t细胞两天。用包括本文所述的herv-e特异性tcr的逆转录病毒载体转导t细胞(例如，seqidno:6)。用30mg/ml抗cd3和30ng/ml抗cd28扩增淋巴细胞7-14天。受试者经历化疗诱导的淋巴细胞删除(例如，如实施例3中所述)，以mtd(例如，如实施例5中所确定)输注经转导的t细胞，以il-2支持。鉴于本发明原理可应用其中的众多可能的实施方案，应认识到，所说明的实施方案仅仅是示例，不应被视为是限制本发明的范围。相反，由以下权利要求限定本发明的范围。因此，我们要求我们的发明全部落入这些权利要求的范围和精神内。序列表<110>美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）芝加哥罗约拉大学r·w·查尔兹m·i·西村e·a·切尔卡索瓦<120>herv-e反应性t细胞受体及使用方法<130>4239-96569-02<150>us62/357,265<151>2016-06-30<160>7<170>patentin版本3.5<210>1<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>herv-e肽<400>1alathrtrpleuglyserlysthrtrplys1510<210>2<211>807<212>dna<213>人<400>2atgaagaggatattgggagctctgctggggctcttgagtgcccaggtttgctgtgtgaga60ggaatacaagtggagcagagtcctccagacctgattctccaggagggagccaattccacg120ctgcggtgcaatttttctgactctgtgaacaatttgcagtggtttcatcaaaacccttgg180ggacagctcatcaacctgttttacattccctcagggacaaaacagaatggaagattaagc240gccacgactgtcgctacggaacgctacagcttattgtacatttcctcttcccagaccaca300gactcaggcgtttatttctgtgctgtgcgaggaggtgctgacggactcacctttggcaaa360gggactcatctaatcatccagccctatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctg420agagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaaca480aatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatg540aggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgca600tgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaa660agttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaacttt720caaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctg780ctcatgacgctgcggctgtggtccagc807<210>3<211>921<212>dna<213>人<400>3atgggctgcaggctgctctgctgtgcggttctctgtctcctgggagcagttcccatagac60actgaagttacccagacaccaaaacacctggtcatgggaatgacaaataagaagtctttg120aaatgtgaacaacatatggggcacagggctatgtattggtacaagcagaaagctaagaag180ccaccggagctcatgtttgtctacagctatgagaaactctctataaatgaaagtgtgcca240agtcgcttctcacctgaatgccccaacagctctctcttaaaccttcacctacacgccctg300cagccagaagactcagccctgtatctctgcgccagcagccctcccaatgaaaaactgttt360tttggcagtggaacccagctctctgtcttggaggacctgaacaaggtgttcccacccgag420gtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtg480tgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaag540gaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaat600gactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccc660cgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacc720caggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagac780tgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgag840atcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggca900atggtcaagagaaaggatttc921<210>4<211>269<212>prt<213>人<400>4metlysargileleuglyalaleuleuglyleuleuseralaglnval151015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