抗PD-1抗体的制作方法

本发明涉及一种抗pd-1抗体，更具体而言，涉及具有包含大鼠抗牛pd-1抗体的互补链决定区(cdr)的可变区和大鼠以外的动物的抗体的恒定区的抗pd-1抗体。

背景技术：

免疫抑制受体programmeddeath1(pd-1)和作为其配体的programmeddeathligand1(pd-l1)是由京都大学本庶佑等人鉴定为抑制过度的免疫响应、与免疫耐受密切相关的因子的分子(非专利文献1：ishiday，agatay，shibaharak，honjottheemboj.，11(11)：3887-3895；nov.1992.)。近年来已表明还参与肿瘤中的免疫抑制，在人类医疗中，开发出阻碍pd-1的作用的抗体药并得到实用化(小野药品工业株式会社“opdivo(注册商标)”)。

此前，本发明人等进行了针对动物难治性疾病的以pd-1或pd-l1为标靶的免疫细胞疗法的开发，阐明该新型免疫细胞疗法可以横跨疾病并且横跨动物地应用(非专利文献2：ikebuchir，konnais，shirait，sundeny，muratas，onumam，ohashik.vet.res.，42：103；sep.26，2011.、非专利文献3：ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.vet.res.，44：59；jul.22，2013.、非专利文献4：ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.immunology.142(4)：551-61；aug.2014.、非专利文献5：maekawan，konnais，ikebuchir，okagawat，adachim，takagis，kagaway，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.plosone.，9(6)：e98415；jun.10，2014.、非专利文献6：mingalacn，konnais，ikebuchir，ohashik.comp.immunol.microbiol.infect.dis.，34(1)：55-63；jan.2011.)。

但是，由于本发明人等此前所制作的抗体为大鼠抗体，因此无法对大鼠以外的动物反复施用。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：ishiday，agatay，shibaharak，honjot.theembojournal.11(11)：3887-3895；nov.1992.

非专利文献2：ikebuchir，konnais，shirait，sundeny，muratas，onumam，ohashik.vet.res.，42：103；sep.2011.

非专利文献3：ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.vet.res.，44：59；jul.22，2013.

非专利文献4：ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.immunology，142(4)：551-61；aug.2014.

非专利文献5：maekawan，konnais，ikebuchir，okagawat，adachim，takagis，kagaway，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.plosone，9(6)：e98415；jun.10，2014.

非专利文献6：mingalacn，konnais，ikebuchir，ohashik.comp.immunol.microbiol.infect.dis.，34(1)：55-63；jan.2011.

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的目的在于，提供一种对于大鼠以外的动物也能够反复施用的抗pd-1抗体。

用于解决问题的方法

本发明人等确定了能够阻碍牛pd-1与pd-l1的结合的大鼠抗牛pd-1单克隆抗体(5d2)的可变区，并将该可变区基因与牛免疫球蛋白(牛igg1，其中为了抑制adcc活性而对ch2结构域的fcγ受体预想结合部位施加了突变(参照图1、图11。氨基酸序号及突变：251e→p，252l→v，253p→a，254g→缺失，348a→s，349p→s；ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.immunology2014aug；142(4)：551-561.)。)的恒定区基因组合而得到嵌合抗体基因，培养增殖导入了所得的嵌合抗体基因的中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell：cho细胞)，由此成功地制作出大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体。此外，确定了大鼠抗牛pd-1单克隆抗体(5d2)的可变区的cdr。本发明是根据这些见解而完成的发明。

本发明的主旨如下所示。

(1)一种抗pd-1抗体，其包含(a)l链和(b)h链，所述l链具有包含具有qsleysdgyty(序列号16)的氨基酸序列的cdr1、具有gvs的氨基酸序列的cdr2及具有fqathdpdt(序列号17)的氨基酸序列的cdr3的l链可变区、和大鼠以外的动物抗体的l链恒定区，所述h链具有包含具有gfsltsyy(序列号18)的氨基酸序列的cdr1、具有irsggst(序列号19)的氨基酸序列的cdr2及具有artssgyeggfdy(序列号20)的氨基酸序列的cdr3的h链可变区和大鼠以外的动物抗体的h链恒定区。

(2)根据(1)中记载的抗体，其中，l链可变区和h链可变区来自于大鼠。

(3)根据(2)中记载的抗体，其中，l链可变区为大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区，h链可变区为大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区。

(4)根据(3)中记载的抗体，其中，l链可变区具有序列号1的氨基酸序列，h链可变区具有序列号2的氨基酸序列。

(5)根据(1)～(4)中任一项记载的抗体，其中，大鼠以外的动物抗体的l链恒定区具有lambda链或kappa链的恒定区的氨基酸序列。

(6)根据(1)～(5)中任一项记载的抗体，其中，大鼠以外的动物抗体的h链恒定区具有相当于人的igg4的免疫球蛋白的恒定区的氨基酸序列，或者被导入了使adcc活性和/或cdc活性降低的突变。

(7)根据(6)中记载的抗体，其中，大鼠以外的动物为牛，牛抗体的l链恒定区具有lambda链的恒定区的氨基酸序列，并且牛抗体的h链恒定区被导入了使adcc活性和/或cdc活性降低的突变。

(8)根据(7)中记载的抗体，其中，牛抗体的l链恒定区具有序列号3的氨基酸序列，牛抗体的h链恒定区具有序列号4的氨基酸序列。

(9)根据(1)～(8)中任一项记载的抗体，其具有两条l链和两条h链的四链结构。

(10)一种医药组合物，其包含(1)～(9)中任一项记载的抗体作为有效成分。

(11)根据(10)中记载的医药组合物，其用于癌症和/或感染症的预防和/或治疗。

(12)根据(11)中记载的医药组合物，其中，癌症和/或感染症选自肿瘤性疾病、白血病、约内氏病、无浆体病(アナプラズマ病)、细菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、支原体感染症(例如支原体性乳腺炎、支原体性肺炎等)、结核病、小型梨浆虫病(小型ピロプラズマ病)、隐孢子虫病、球虫病、锥虫病及利什曼病中。

(13)一种人工基因dna，其包含(a’)编码l链的dna和(b’)编码h链的dna，所述l链具有包含具有qsleysdgyty(序列号16)的氨基酸序列的cdr1、具有gvs的氨基酸序列的cdr2及具有fqathdpdt(序列号17)的氨基酸序列的cdr3的l链可变区、和大鼠以外的动物抗体的l链恒定区，所述h链具有包含具有gfsltsyy(序列号18)的氨基酸序列的cdr1、具有irsggst(序列号19)的氨基酸序列的cdr2及具有artssgyeggfdy(序列号20)的氨基酸序列的cdr3的h链可变区和大鼠以外的动物抗体的h链恒定区。

(14)一种载体，其包含(13)中记载的人工基因dna。

(15)一种宿主细胞，其被利用(14)中记载的载体进行了转化。

(16)一种抗体的制造方法，其包括培养(15)中记载的宿主细胞、并从培养物中采集抗pd-1抗体的操作。

(17)一种dna，其编码l链，所述l链具有包含具有qsleysdgyty(序列号16)的氨基酸序列的cdr1、具有gvs的氨基酸序列的cdr2及具有fqathdpdt(序列号17)的氨基酸序列的cdr3的l链可变区、和大鼠以外的动物抗体的l链恒定区。

(18)一种dna，其编码h链，所述h链具有包含具有gfsltsyy(序列号18)的氨基酸序列的cdr1、具有irsggst(序列号19)的氨基酸序列的cdr2及具有artssgyeggfdy(序列号20)的氨基酸序列的cdr3的h链可变区、和大鼠以外的动物抗体的h链恒定区。

发明效果

根据本发明，可以得到新型的抗pd-1抗体。该抗体对于大鼠以外的动物也可以利用。

本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请日本特愿2016-159090及日本特愿2017-099615的说明书和/或附图中记载的内容。

附图说明

图1为大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的氨基酸序列。表示出大鼠抗牛pd-1抗体5d2的l链可变区及h链可变区中的cdr1、cdr2及cdr3区域，此外，还表示出对牛igg1(ch2结构域)施加了突变的氨基酸(氨基酸序号及突变：251e→p，252l→v，253p→a，254g→缺失，348a→s，349p→s)。

图2为pdn112载体与大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的示意图。

图3为大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的产生量及纯化纯度。

图4为大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的结合性。

图5为大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的牛pd-1/pd-l1结合阻碍活性。

图6为向blv实验感染牛施用后的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的血中浓度的推移。

图7为施用了大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的blv实验感染牛的对blv抗原的t细胞的细胞增殖响应。

图8为施用了大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的blv实验感染牛的blv前病毒量的变化。

图9为大鼠抗牛pd-1抗体5d2与绵羊pd-1的交叉反应性。

图10为大鼠抗牛pd-1抗体5d2与水牛的t细胞的交叉反应性。

图11为牛igg1恒定区的立体结构及fcγ受体预想结合部位。

图12为pdc6载体。

图13为大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2igg1wt及igg1adcc-的纯化纯度。

图14为大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2igg1wt及igg1adcc-的与各牛fcγ受体的结合性。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

本发明提供一种抗pd-1抗体，其包含(a)l链和(b)h链，所述l链具有包含具有qsleysdgyty(序列号16)的氨基酸序列的cdr1、具有gvs的氨基酸序列的cdr2及具有fqathdpdt(序列号17)的氨基酸序列的cdr3的l链可变区、和大鼠以外的动物抗体的l链恒定区，所述h链具有包含具有gfsltsyy(序列号18)的氨基酸序列的cdr1、具有irsggst(序列号19)的氨基酸序列的cdr2及具有artssgyeggfdy(序列号20)的氨基酸序列的cdr3的h链可变区和大鼠以外的动物抗体的h链恒定区。

大鼠抗牛pd-1抗体5d2(后述)的l链可变区中的cdr1～3分别为包含qsleysdgyty(序列号16)的氨基酸序列的区域、包含gvs的氨基酸序列的区域、包含fqathdpdt(序列号17)的氨基酸序列的区域(参照图1)。

另外，大鼠抗牛pd-1抗体5d2的h链可变区中的cdr1～3分别为包含gfsltsyy(序列号18)的氨基酸序列的区域、包含irsggst(序列号19)的氨基酸序列的区域及包含artssgyeggfdy(序列号20)的氨基酸序列的区域(参照图1)。

在qsleysdgyty(序列号16)的氨基酸序列、gvs的氨基酸序列及fqathdpdt(序列号17)的氨基酸序列、以及gfsltsyy(序列号18)的氨基酸序列、irsggst(序列号19)的氨基酸序列及artssgyeggfdy(序列号20)的氨基酸序列中，可以缺失、置换或加入1个、2个、3个、4个或5个氨基酸，即使导入这些突变，也可以具有作为pd-1抗体的l链可变区的cdr或h链可变区的cdr的功能。

本说明书中，所谓抗体，是除了包括全长抗体以外、还包括fab、f(ab)’2、scfv、二聚抗体、vh、vl、sc(fv)2、双特异性sc(fv)2、微型抗体、scfv-fc单体、scfv-fc二聚体等被低分子化了的抗体的概念。

本发明的抗pd-1抗体中，l链可变区和h链可变区可以来自于大鼠。例如，可以是l链可变区为大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区，h链可变区为大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区。

将大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区的氨基酸序列及h链可变区的氨基酸序列分别表示于序列号1及2中，然而在序列号1及2的氨基酸序列中，可以缺失、置换或加入1或多个(例如5个以下、至多10个左右)氨基酸，即使导入这些突变，也可以具有作为pd-1抗体的l链可变区或h链可变区的功能。

大鼠以外的动物抗体的l链恒定区及h链恒定区可以来自于产生与大鼠抗牛pd-1抗体5d2发生交叉反应的pd-1的动物。

在抗体的l链中，有kappa链(卡帕链)和lambda链(兰姆达链)，本发明的抗pd-1抗体中，大鼠以外的动物的抗体的l链恒定区无论具有kappa链或lambda链的哪个链的恒定区的氨基酸序列都可以，对于存在比率，就牛、绵羊、猫、狗、马而言是lambda链的一方高，就小鼠、大鼠、人、猪而言是kappa链的一方高。由于认为优选存在比率高的链的一方，因此就牛、绵羊、猫、狗、马而言优选具有lambda链的恒定区的氨基酸序列，就小鼠、大鼠、人、猪而言优选具有kappa链的恒定区的氨基酸序列。

大鼠以外的动物的抗体的h链恒定区可以具有相当于人的igg4的免疫球蛋白的恒定区的氨基酸序列。h链根据恒定区的差别被分为γ链、μ链、α链、δ链、ε链，根据该差别分别形成igg、igm、iga、igd、ige的5种类型(同种型)的免疫球蛋白。

免疫球蛋白g(igg)占人免疫球蛋白的70-75％，是血浆中最多的单体的抗体。具有两条轻链和两条重链的四链结构。人igg1、igg2、igg4的分子量约为146000，而人igg3的连接fab区域与fc区域的铰链部长，分子量也大到170000。人igg1占人igg的65％左右，人igg2占25％左右，人igg3占7％左右，人igg4占3％左右。平均地分布于血管内外。人igg1由于对效应细胞表面的fc受体、补体因子具有强亲和性，因此诱导抗体依赖性细胞毒作用(adcc)，另外，将补体活化而诱导补体依赖性细胞毒作用(cdc)。人igg2和人igg4由于对fc受体、补体因子的亲和性低，因此adcc活性及cdc活性低。

免疫球蛋白m(igm)是占人免疫球蛋白的约10％的、结合5个基本的四链结构而得的五聚体的抗体。分子量为970000。通常仅存在于血中，是针对感染微生物最先产生、担任早期免疫的免疫球蛋白。

免疫球蛋白a(iga)占人免疫球蛋白的10-15％。分子量为160000。分泌型iga是结合2个iga而得的二聚体的抗体。iga1存在于血清、鼻涕、唾液、母乳中，在肠液中存在大量iga2。

免疫球蛋白d(igd)是人免疫球蛋白的1％以下的单体的抗体。存在于b细胞表面，参与抗体产生的诱导。

免疫球蛋白e(ige)是人免疫球蛋白的0.001％以下的仅极微量存在的单体的抗体。被认为参与针对寄生虫的免疫反应，而在寄生虫稀少的发达国家中，特别是与支气管哮喘、过敏有很大关系。

就狗而言，作为igg的h链，鉴定出igg-a(相当于人igg2)、igg-b(相当于人igg1)、igg-c(相当于人igg3)、igg-d(相当于人igg4)的序列。本发明的抗体中，优选不同时具有adcc活性、cdc活性的iggh链恒定区(就人而言是igg4)。在没有鉴定出相当于人igg4的免疫球蛋白的恒定区的情况下，可以使用通过对相当于人igg1的免疫球蛋白的该区域施加突变而不同时具有adcc活性、cdc活性的区域。

就牛而言，作为igg的h链，鉴定出igg1、igg2、igg3的序列。本发明的抗体中，优选不同时具有adcc活性、cdc活性的iggh链恒定区(就人而言是igg4)。已知人igg1的恒定区就野生型而言具有adcc活性及cdc活性，而通过对特定的部分施加氨基酸置换、缺失，可以使它们的活性降低。在牛中，由于没有鉴定出相当于人igg4的免疫球蛋白的恒定区，因此可以对相当于人igg1的免疫球蛋白的该区域施加突变并使用该区域。作为其一例，将对牛抗体的h链恒定区(igg1链，genbank：x62916)的ch2结构域施加了突变的氨基酸序列和核苷酸序列(将密码子最佳化了的序列)分别表示于序列号4及8中。

更优选如下的抗pd-1抗体，即，牛抗体的l链恒定区具有lambda链的恒定区的氨基酸序列，并且牛抗体的h链恒定区被导入了使adcc活性和/或cdc活性降低的突变。

本发明的抗pd-1抗体包含大鼠－牛嵌合抗体、牛化抗体、完全牛型抗体，然而动物并不限定为牛，可以例示出人、狗、猪、猴、小鼠、猫、马、山羊、绵羊、水牛、兔、仓鼠、豚鼠等等。

例如，本发明的抗pd-1抗体可以是牛抗体的l链恒定区具有序列号3的氨基酸序列、牛抗体的h链恒定区具有序列号4的氨基酸序列的抗pd-1抗体。

在序列号3及4的氨基酸序列中，可以缺失、置换或加入1或多个(例如5个以下、至多10个左右)氨基酸，即使导入这些突变，也可以具有作为抗体的l链恒定区或h链恒定区的功能。

本发明的抗pd-1抗体可以是具有两条l链和两条h链的四链结构。

本发明的抗pd-1抗体可以如下所示地制造。合成包含鉴定了的大鼠抗牛pd-1抗体的可变区序列和大鼠以外的动物(例如牛等)的抗体(优选为对相当于人igg1的免疫球蛋白的该区域施加突变、使adcc活性和/或cdc活性降低的抗体)的恒定区序列的人工基因，将该人工基因插入载体(例如质粒)后，导入宿主细胞(例如cho细胞等哺乳类细胞)，并培养该宿主细胞，由此从培养物中采集抗体。

将本发明人等鉴定了的大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别表示于序列号1及5中。此外，将密码子最佳化后的核苷酸序列表示于序列号11中。

将本发明人等鉴定了的大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别表示于序列号2及6中。此外，将密码子最佳化后的核苷酸序列表示于序列号12中。

将牛抗体的l链恒定区(lambda链，genbank：x62917)的氨基酸序列和核苷酸序列分别表示于序列号3及7中。此外，将密码子最佳化后的核苷酸序列表示于序列号13中。

将牛抗体的h链恒定区(igg1链，改变genbank：x62916)的氨基酸序列和核苷酸序列(密码子最佳化后)分别表示于序列号4及8中。

另外，序列号9表示包含大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区和牛抗体的l链恒定区(lambda链，genbank：x62917)的嵌合l链的氨基酸序列。将包含大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区和牛抗体的l链恒定区(lambda链，genbank：x62917)的嵌合l链的核苷酸序列(密码子最佳化后)表示于序列号14中。

序列号10表示包含大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区和牛抗体的h链恒定区(igg1链，改变genbank：x62916)的嵌合h链的氨基酸序列。将包含大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区和牛抗体的h链恒定区(igg1链，改变genbank：x62916)的嵌合h链的核苷酸序列(密码子最佳化后)表示于序列号15中。

除此以外，大鼠以外的动物的l链恒定区及h链恒定区的氨基酸序列和核苷酸序列可以从公知的数据库获得，可以利用这些序列。

将牛的l链恒定区及h链恒定区的氨基酸序列和核苷酸序列集中整理于下述的表中。

(表)

将绵羊、水牛、人的l链恒定区及h链恒定区的氨基酸序列和核苷酸序列集中整理于下述的表中。

(表)

在序列号3、21～28、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、以及59的氨基酸序列中，可以缺失、置换或加入1或多个(例如5个以下、至多10个左右)氨基酸，即使导入这些突变，也可以具有作为ig重链或轻链的恒定区的功能。

已知人igg1的恒定区就野生型而言具有adcc活性及cdc活性，然而通过对特定的部分施加氨基酸置换、缺失，可以降低它们的活性。在人以外的动物中，在没有鉴定出相当于人igg4的免疫球蛋白的恒定区的情况下，可以使用对相当于人igg1的免疫球蛋白的该区域施加突变、降低了adcc活性及cdc活性的区域。

本发明提供一种人工基因dna，其包含(a’)编码l链的dna和(b’)编码h链的dna，所述l链具有包含具有qsleysdgyty(序列号16)的氨基酸序列的cdr1、具有gvs的氨基酸序列的cdr2及具有fqathdpdt(序列号17)的氨基酸序列的cdr3的l链可变区、和大鼠以外的动物抗体的l链恒定区，所述h链具有包含具有gfsltsyy(序列号18)的氨基酸序列的cdr1、具有irsggst(序列号19)的氨基酸序列的cdr2及具有artssgyeggfdy(序列号20)的氨基酸序列的cdr3的h链可变区和大鼠以外的动物抗体的h链恒定区。另外，本申请发明还提供一种编码l链的dna，所述l链具有包含具有qsleysdgyty(序列号16)的氨基酸序列的cdr1、具有gvs的氨基酸序列的cdr2及具有fqathdpdt(序列号17)的氨基酸序列的cdr3的l链可变区、和大鼠以外的动物抗体的l链恒定区。此外，本发明还提供一种编码h链的dna，所述h链具有包含具有gfsltsyy(序列号18)的氨基酸序列的cdr1、具有irsggst(序列号19)的氨基酸序列的cdr2及具有artssgyeggfdy(序列号20)的氨基酸序列的cdr3的h链可变区、和大鼠以外的动物抗体的h链恒定区。

对于(a)具有包含具有qsleysdgyty(序列号16)的氨基酸序列的cdr1、具有gvs的氨基酸序列的cdr2及具有fqathdpdt(序列号17)的氨基酸序列的cdr3的l链可变区、和大鼠以外的动物抗体的l链恒定区的l链、以及(b)具有包含具有gfsltsyy(序列号18)的氨基酸序列的cdr1、具有irsggst(序列号19)的氨基酸序列的cdr2及具有artssgyeggfdy(序列号20)的氨基酸序列的cdr3的h链可变区和大鼠以外的动物抗体的h链恒定区的h链，已经在前面叙述。(a’)的dna为编码(a)的l链的dna(基因)，(b’)的dna为编码(b)的h链的dna(基因)，包含(a’)的dna和(b’)的dna的人工基因dna可以使用市售的合成机合成。也可以向人工基因dna加入限制性酶识别部位、kozak序列、poly(a)加尾信号序列、启动子序列、内含子序列等。

另外，本发明还提供包含所述人工基因dna的载体。

作为载体，可以使用大肠杆菌来源的质粒(例如pbr322、pbr325、puc12、puc13)、枯草杆菌来源的质粒(例如pub110、ptp5、pc194)、酵母来源质粒(例如psh19、psh15)、λ噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、痘苗病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病原病毒等。后述的实施例中，使用了pdn112(marzia，yoshidar，miyamotoh，ishijimam，suzukiy，higuchim，matsuyamay，igarashim，nakayamae，kurodam，saijom，feldmannf，briningd，feldmannh，takadaa.plosone，7：e36192，apr.27，2012；ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.immunology，142(4)：551-561，aug.2014.)。

也可以向载体中加入启动子、增强子、剪接信号、poly(a)加尾信号、内含子序列、选择标记、sv40复制起始点等。

此外，本发明还提供利用所述载体进行了转化的宿主细胞。通过培养该宿主细胞，并从培养物中采集抗体，可以制造抗pd-1抗体。由此，本发明还提供一种抗体的制造方法，该制造方法包括培养所述宿主细胞、并从培养物中采集抗pd-1抗体的操作。本发明的抗体的制造方法中，可以将整合了包含编码l链的dna和编码h链的dna的人工基因dna的载体转染到宿主细胞中，也可以将整合了编码l链的dna的载体和整合了编码h链的dna的载体共转染到宿主细胞中。

作为宿主细胞，可以例示出细菌细胞(例如埃希菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、枯草杆菌等)、真菌细胞(例如酵母、曲霉等)、昆虫细胞(例如s2细胞、sf细胞等)、动物细胞(例如cho细胞、cos细胞、hela细胞、c127细胞、3t3细胞、bhk细胞、hek293细胞等)、植物细胞等。其中，优选作为二氢叶酸还原酶缺损细胞的cho-dg44细胞(cho-dg44(dhfr-/-))。

要将重组载体导入宿主，可以利用分子克隆第二版，j.sambrooketal.，coldspringharborlab.press，1989中记载的方法(例如磷酸钙法、deae-葡聚糖法、转染法、显微注射法、脂质体转染法、电穿孔法、转化法、刮棒负载法(スクレープローディング法)、鸟枪法(ショットガン法)等)或感染来进行。

可以用培养基培养转化体，从培养物中采集本发明的抗pd-1抗体。在抗体被分泌到培养基中的情况下，只要回收培养基并从该培养基中分离、纯化抗体即可。在抗体产生于受到转化的细胞内的情况下，只要将该细胞溶解并从其溶解物中分离、纯化抗体即可。

作为培养基，可以例示出opticho培养基、dynamis培养基、cdcho培养基、acticho培养基、forticho培养基、ex-cellcdcho培养基、balancdcho培养基、procho5培养基、cellventocho-100培养基等，然而并不限定于它们。

培养基的ph根据所培养的细胞而不同，然而一般而言为ph6.8～7.6，多数情况下适合为ph7.0～7.4。

在所培养的细胞为cho细胞的情况下，cho细胞的培养可以使用本领域人员公知的方法进行。例如，通常可以在气相的co2浓度为0－40％、优选为2－10％的气氛下、在30－39℃、优选在37℃左右进行培养。

适合的培养期间通常为1天～3个月，优选为1天～3周。

抗体的分离及纯化可以利用公知的方法进行。作为公知的分离、纯化法，可以使用盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的差的方法、透析法、超滤法、凝胶过滤法、以及sds－聚丙烯酰胺凝胶电泳法等利用分子量的差的方法、离子交换色谱等利用电荷的差的方法、亲和层析等利用特异性亲和性的方法、反相高速液体色谱等利用疏水性的差的方法、等电点电泳法等利用等电点的差的方法等。

本发明的抗pd-1抗体可以作为动物用或人用的抗体药利用。由此，本发明提供包含上述的抗pd-1抗体作为有效成分的医药组合物。

本发明的医药组合物可以用于癌症和/或感染症的预防和/或治疗。作为癌症和/或感染症，可以例示出肿瘤性疾病(例如恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、食道癌、卵巣癌等)、白血病、约内氏病、无浆体病、细菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、支原体感染症(例如支原体性乳腺炎、支原体性肺炎等)、结核病、小型梨浆虫病、隐孢子虫病、球虫病、锥虫病及利什曼病等，然而并不限定于它们。

可以将本发明的抗pd-1抗体溶解于pbs等缓冲液、生理盐水、灭菌水等中，根据需要用过滤器等进行过滤灭菌后，利用注射向受试动物(也包括人)施用。另外，可以向该溶液中添加添加剂(例如着色剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、溶解助剂、稳定化剂、保存剂、抗氧剂、缓冲剂、等渗剂、ph调节剂等)等。作为施用路径，可以是静脉、肌肉、腹腔、皮下、皮内施用等，另外，也可以经鼻、经口施用。

本发明的抗pd-1抗体的施用量、施用的次数及频率根据受试动物的症状、年龄、体重、施用方法、施用形态等而不同，例如通常可以对每一成年动物以至少一次、可以获得所期望的效果的频率施用0.1～100mg/kg体重、优选1～10mg/kg体重。

本发明的医药组合物可以单独使用，也可以与外科手术、放疗、癌症疫苗等其他免疫细胞疗法、分子靶向治疗药组合使用。由此可以期待协同效应。

实施例

以下，基于实施例对本发明进行详细说明，然而本发明并不限定于这些实施例。

〔实施例1〕大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的建立

序论

免疫抑制受体programmeddeath1(pd-1)和作为其配体的programmeddeathligand1(pd-l1)是由京都大学本庶佑等人鉴定为抑制过度的免疫响应、与免疫耐受密切相关的因子的分子。近年来还阐明参与肿瘤中的免疫抑制。本实施例中，以建立对牛的感染症的新型治疗法为目的，制作了大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2，并确认了体外(invitro)及体内(invivo)的效果，所述大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2是培养增殖表达嵌合抗体基因的中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell：cho细胞)而得，所述嵌合抗体基因是将能够阻碍牛pd-1与pd-l1的结合的大鼠抗牛pd-1单克隆抗体5d2的可变区基因、和牛免疫球蛋白(牛igg1及igλ。其中，为了抑制adcc活性，对牛igg1ch2结构域的fcγ受体预想结合部位施加了突变(图1、图11)。氨基酸序号及突变：250e→p，251l→v，252p→a，253g→缺失，347a→s，348p→s；ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.immunology，142(4)：551-561；aug.2014.)的恒定区基因组合而得。

材料、方法、以及实验结果

2.1.牛pd-1及pd-l1表达细胞的构建

对牛pd-1基因(genbank登记号ab510901；ikebuchir，konnais，sundeny，onumam，ohashik.microbiol.immunol.，54(5)：291-298；may2010.)及牛pd-l1基因(genbank登记号ab510902；ikebuchir，konnais，shirait，sundeny，muratas，onumam，ohashik.vet.res.，42：103；sep.26，2011.)确定cdna全长的碱基序列，根据其基因信息制作出牛pd-1或pd-l1表达细胞。首先，为了制作牛pd-1或pd-l1表达质粒，以所合成的牛外周血单核细胞(pbmc)来源cdna为模板，使用向5′末端侧加入限制性酶noti及hindiii(牛pd-1)、或nhei及xhoi(牛pd-l1)识别部位的引物(bopd-1-mycf及r、或bopd-l1-egfpf及r)进行了pcr。对所得的pcr产物利用noti(takara公司)及hindiii(takara公司；牛pd-1)、或nhei(takara公司)及xhoi(takara公司；牛pd-l1)进行处理后，使用fastgenegel/pcr提取试剂盒(nippongenetics公司)进行纯化，导入进行了同样的限制性酶处理的pcmv-tag1载体(agilenttechnologies公司；牛pd-1)或pegfp-n2载体(clontech公司；牛pd-l1)中，进行了克隆。使用qiagenplasmidmidikit(qiagen公司)提取所得的目标的表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pcmv-tag1-bopd-1或pegfp-n2-bopd-l1。

引物(bopd-1-mycf)：

atatgcggccgcatggggaccccgcgggcgct(序列号61)；

引物(bopd-1-mycr)：

gcgcaagctttcagaggggccaggagcagt(序列号62)；

引物(bopd-l1-egfpf)：

ctagctagcaccatgaggatatatagtgtcttaac(序列号63)；

引物(bopd-l1-egfpr)：

caatctcgagttacagacagaagatgactgc(序列号64)。

依照以下的步骤，制作出牛pd-1表达细胞。首先，使用lipofectamineltx(invitrogen公司)将2.5μg的pcmv-tag1-bopd-1导入4×10⁶个的cho-dg44细胞中。48小时后，将培养基更换为包含g418(enzolifescience公司)800μg/ml、glutamax添加剂(lifetechnologies公司)20ml/l、10％pluronicf-68(lifetechnologies公司)18ml/l的cddg44培养基(lifetechnologies公司)，进行了选择。使所得的表达细胞与大鼠抗牛pd-1抗体5d2在室温下反应，清洗后，与抗大鼠igg微珠标记抗体(miltenyibiotec公司)在室温下进一步反应。使用automacs(miltenyibiotec公司)分离高表达牛pd-1的细胞，为了进一步提高纯度，利用同様的步骤进行了再分离。对所制作出的表达细胞利用极限稀释法进行克隆，得到牛pd-1高表达chodg44细胞(牛pd-1表达细胞)。

依照以下的步骤，制作出牛pd-l1膜表达细胞。首先，使用lipofectamineltx(invitrogen公司)将2.5μg的pcmv-tag1-bopd-l1或作为阴性对照的pegfp-n2导入4×10⁶个的cho-dg44细胞中。48小时后，将培养基更换为包含g418(enzolifescience公司)800μg/ml、glutamax添加剂(lifetechnologies公司)20ml/l、10％pluronicf-68(lifetechnologies公司)18ml/l的cddg44培养基(lifetechnologies公司)，在进行选择的同时利用极限稀释法进行了克隆(牛pd-l1表达细胞)。为了确认所制作出的表达细胞中的牛pd-l1的表达，利用倒立型共聚焦激光显微镜lsm700(zeiss公司)，使egfp的细胞内局部可视化。

2.2.可溶性牛pd-1的构建

依照以下的步骤，构建出牛pd-1-ig表达质粒。制成使牛pd-1(genbank登记号ab510901)的信号肽及细胞外区域与已知的牛igg1(genbank登记号x62916)的恒定区结合了的基因序列，对cho细胞进行密码子的最佳化后，以将选择性酶(noti)识别序列、kozak序列、牛pd-1信号肽序列、牛pd-1基因细胞外区域序列、牛igg1fc区域序列、选择性酶(xbai)识别序列依照上述的顺序配置的方式进行了基因合成。需要说明的是，牛igg1为了抑制adcc活性，对ch2结构域的fcγ受体预想结合部位施加了突变(突变插入部位：185e→p，186l→v，187p→a，189g→缺失，281a→s，282p→s；ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.immunology，142(4)：551-561；aug.2014.该论文的figure2中给出了pd-1-ig的氨基酸序列、突变插入部位)。将所合成出的基因链利用noti(takara公司)及xbai(takara公司)处理后，使用fastgenegel/pcr提取试剂盒(nippongenetics公司)纯化，整合到进行了同样的选择性酶处理的表达用载体pdn11(由北海道大学人畜共患感染症研究中心铃木定彦教授分与)的克隆位点(位于pcmv下游、inrbg与pabgh之间的noti及xbai选择性酶识别序列)中，构建出牛pd-1-ig表达载体。使用qiagenplasmidmidikit(qiagen公司)纯化表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pdn11-bopd-1-ig。

依照以下的步骤，构建出牛pd-1-his表达质粒。以扩增牛pd-1(genbank登记号ab510901)的信号肽及细胞外区域的方式，设计了向5′末端侧加入选择性酶noti及xhoi识别部位的引物(bopd-1-hisf及r)。需要说明的是，向反向引物中加入了编码6×组氨酸(his)标签的基因序列。以所合成出的牛pbmc来源cdna为模板进行pcr，对各个pcr产物利用noti(takara公司)及xhoi(takara公司)进行处理后，使用fastgenegel/pcr提取试剂盒(nippongenetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的pcxn2.1(+)载体(niwah，yamamurak，miyazakij.gene，108(2)：193-199；dec.15，1991；由顺天堂大学大学院医学研究科横沟岳彦教授分与)，进行了克隆。将表达质粒利用fastgenexpressplasmidpluskit(nippongenetics公司)纯化，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pcxn2.1-bopd-1-his。

引物(bopd-1-hisf)：

ataagaatgcggccgccaccatggggaccccgcgggcgct(序列号65)；

引物(bopd-1-hisr)：

gccctcgagttaatggtgatggtgatggtggatgaccaggctctgcatct(序列号66)。

依照以下的步骤，制作出可溶性牛pd-1-ig表达细胞。使用lipofectamineltx(invitrogen公司)将2.5μg的pdn11-bopd-1-ig导入4×10⁶个cho-dg44细胞中。48小时后，将培养基更换为包含g418(enzolifescience公司)800μg/ml、glutamax添加剂(lifetechnologies公司)20ml/l的cdopticho培养基(lifetechnologies公司)，培养3周后进行了选择。利用使用了抗牛iggf(c)兔多克隆抗体(rockland公司)的elisa法测定出所得的细胞株的培养上清液中的fc融合重组蛋白的浓度，进行了高表达fc融合重组蛋白的细胞株的挑选。将所得的高表达细胞株转移到不包含g418的培养基中，进行14天振荡培养后回收培养上清液。将包含fc融合重组蛋白的培养上清液用centriconplus-70(millipore公司)超滤后，使用ab-capcherextra(protenova公司)纯化fc融合重组蛋白。纯化后，利用pd-10脱盐柱(gehealthcare公司)将缓冲液置换为磷酸缓冲生理盐水(pbs；ph7.4)，在用于实验前以-30℃保存(牛pd-1-ig)。利用使用了抗牛iggf(c)兔多克隆抗体(rockland公司)的elisa法测定出纯化后的牛pd-1-ig的浓度。在elisa的各清洗操作中使用了全自动洗板机biowasher50(dspharmabiomedical公司)，在吸光度的测定中使用了微板读数仪mtp-650fa(corona电气公司)。

依照以下的步骤，制作出可溶性牛pd-1-his表达细胞。使用expifectamine(lifetechnologies公司)将30μg的pcxn2.1-bopd-1-his导入7.5×10⁷个expi293f细胞(lifetechnologies公司)中，进行7天振荡培养后回收培养上清液。从培养上清液中使用talon金属亲和树脂(clontech公司；牛pd-1-his)纯化重组蛋白。纯化后，利用pdminitrapg-25(gehealthcare公司)将缓冲液置换为pbs(ph7.4)，在用于实验前以-30℃保存(牛pd-1-his)。对纯化后的牛pd-1-his浓度利用使用nanodrop8000分光光度计(thermofisherscientific公司)测定出的吸光度(280nm)进行定量。

2.3.大鼠抗牛pd-1单克隆抗体产生细胞的制作

将牛pd-1-ig(前述)对大鼠的足跖进行免疫，使用髂骨淋巴结法建立杂交瘤，得到大鼠抗牛pd-1单克隆抗体产生杂交瘤5d2株。对于大鼠抗牛pd-1单克隆抗体的建立方法，在以下的非专利文献中记载有其详情(ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.vet.res.，44：59；jul.22，2013)。

2.4.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体表达载体的制作

建立以大鼠抗牛pd-1抗体5d2作为抗体可变区融合了牛igg1及牛igλ的抗体恒定区的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2。

首先，从产生大鼠抗牛pd-1抗体5d2的杂交瘤中利用race法鉴定出可变区(重链及轻链)的基因。然后，制成使大鼠抗牛pd-1抗体5d2的重链及轻链可变区序列与已知的牛igg1(重链；改变genbank登记号x62916)及牛igλ(轻链；genbank登记号x62917)的恒定区结合的基因序列，进行了密码子最佳化(序列号9及10(氨基酸序列)、序列号14及15(密码子最佳化后核苷酸序列))。需要说明的是，牛igg1中为了抑制adcc活性，对ch2结构域的fcγ受体预想结合部位施加了突变(参照图1、图11。氨基酸序号及突变：251e→p，252l→v，253p→a，254g→缺失，348a→s，349p→s；ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.immunology，142(4)：551-561；aug.2014.)。然后，以将noti选择性酶识别序列、kozak序列、嵌合抗体轻链序列、poly(a)加尾信号序列(pabgh)、启动子序列(pcmv)、saci选择性酶识别序列、内含子序列(inrbg)、kozak序列、嵌合抗体重链序列、xbai选择性酶识别序列依照上述的顺序配置的方式人工地合成出基因。将所合成出的基因链利用noti(takara公司)及xbai(takara公司)处理后，使用fastgenegel/pcr提取试剂盒(nippongenetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的表达质粒pdn112(由北海道大学人畜共患感染症研究中心铃木定彦教授分与)的克隆位点(位于pcmv下游、inrbg与pabgh之间的noti及xbai选择性酶识别序列)，进行了克隆(图2)。使用qiagenplasmidmidikit(qiagen公司)提取所得的目标的表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pdn112-bopd-1ch5d2。

2.5.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的表达(图3)

将所制作出的pdn112-bopd-1ch5d2使用lipofectamineltx(lifetechnologies公司)导入作为二氢叶酸还原酶缺损(dfhr^-/-)细胞的cho-dg44细胞。48小时后，将培养基更换为包含2mmglutamax添加剂(lifetechnologies公司)及g418硫酸盐800μg/ml(enzolifescience公司)的cdopticho培养基(lifetechnologies公司)，培养3周而进行了基于表达细胞的选择及极限稀释法的克隆。然后，利用使用了抗牛iggf(c)兔多克隆抗体(rockland公司)的斑点印迹法及elisa法测定培养上清液中所含的嵌合抗体的浓度，筛选出高表达克隆。此外，对筛选出的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体高表达克隆在包含60nm的甲氨蝶呤(mtx；和光纯药工业公司)的培养基中施加负荷，由此进行了基因扩增处理。将如上所述地建立的大鼠-牛嵌合抗牛pd-1抗体稳定表达细胞转移到不包含mtx的cdopticho培养基中，进行14天的振荡培养(125rpm，37℃，5％co2)。利用使用了抗牛iggf(c)兔多克隆抗体(rockland公司)的elisa法，对培养上清液中的嵌合抗体产生量进行定量。需要说明的是，在elisa的各清洗操作中使用了全自动洗板机biowasher50(dspharmabiomedical公司)，在吸光度的测定中使用了微板读数仪mtp-650fa(corona电气公司)。将第14天的培养上清液以10000g离心10分钟而除去细胞后，将离心上清液通过steritop-gp0.22μm过滤器(millipore公司)而灭菌，在用于纯化前以4℃保存。

将结果表示于图3a中。大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体表达细胞株当中产生量最高的克隆在14天的振荡培养中向培养上清液中分泌出91.7mg/l的嵌合抗体。

2.6.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的纯化

从利用上述的方法准备的培养上清液中，使用abcapcherextra(protenova公司)将各嵌合抗体纯化。与树脂的结合使用开管柱法，作为平衡化缓冲液及清洗缓冲液使用1.5m甘氨酸/3mnacl(ph8.0)。作为洗脱缓冲液使用0.1m甘氨酸-hcl(ph2.8)，作为中和缓冲液使用1mtris(ph9.0)。对纯化了的抗体使用pd-10脱盐柱(gehealthcare公司)及amiconultra-15(50kda、millipore公司)进行了置换为pbs(ph7.4)的缓冲液置换及浓缩。将纯化了的嵌合抗体通过0.22μm注射器过滤器(palllifesciences公司)而进行灭菌，在用于实验前以4℃保存。

2.7.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的纯化纯度的确认(图3)

为了确认纯化了的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的纯度，利用sds-page及cbb染色进行了抗体蛋白质的检测。将纯化了的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2悬浮于laemmli样品缓冲液(bio-rad公司)中，在还原条件下(利用2-巯基乙醇(sigma-aldrich公司)还原)或非还原条件下进行变性处理(95℃、5分钟)。对所制备的样品使用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。此时，作为分子量标记使用了precisionplusprotein全蓝蛋白质标准品(bio-rad公司)。电泳后，利用quick-cbb(和光纯药工业公司)进行凝胶的染色，接下来在蒸馏水中进行脱色。

将结果表示于图3b中。在还原条件下在25kda(轻链)及50kda(重链)的预估的位置确认到大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的条带，在非还原条件下在150kda的预估的位置确认到大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的条带。

2.8.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的结合特异性(图4)

利用流式细胞仪法确认了大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体与牛pd-1表达细胞(前述)特异性地结合。首先，使大鼠抗牛pd-1抗体5d2或大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2与牛pd-1表达细胞在室温下反应30分钟。清洗后，使别藻蓝蛋白(apc)标记抗大鼠ig山羊抗体(southernbiotech公司)或alexafluor647标记抗牛igg(h+l)山羊f(ab′)2(jacksonimmunoresearch公司)在室温下反应30分钟。作为阴性对照抗体，使用了大鼠igg2a(κ)同种型对照(bdbiosciences公司)或牛igg1抗体(bethyl公司)。清洗后，利用facsverse(bdbiosciences公司)检测出结合于细胞表面的各大鼠抗体或大鼠－牛嵌合抗体。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有1％牛血清白蛋白(sigma-aldrich公司)的pbs。

将实验结果表示于图4中。显示出大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2与大鼠抗牛pd-1抗体5d2同样地与牛pd-1表达细胞结合。

2.9.大鼠-牛嵌合抗牛pd-1抗体的pd-1结合亲和性

利用使用了分子间相互作用分析装置(biacorex100；gehealthcare公司)的表面等离子体共振法，计测出大鼠抗pd-1抗体5d2及大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2与牛pd-1的结合亲和性。将牛pd-1-his(前述)作为配体固定于传感器芯片cm5(gehealthcare公司)，以大鼠抗pd-1抗体5d2或大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2作为待分析物使之反应，进行了单动力学(シングルカイネティクス)分析。在相同条件下重复3次实验，在各个实验中确定结合常数(kd值)和解离常数(ka值)，求出结合亲和性(kd值)。

将实验结果表示于下述的表中。大鼠－牛抗牛pd-1嵌合抗体与pd-1蛋白的结合亲和性是与大鼠抗牛pd-1抗体5d2相同的程度，在统计学上观察不到差别(p＞0.05；welch的t检验)。

2.10.大鼠－牛嵌合抗pd-1抗体的牛pd-1/pd-l1结合阻碍活性(图5)

使用牛pd-l1表达细胞(前述)及牛pd-1-ig(前述)，进行了利用抗pd-1抗体的牛pd-1/pd-l1结合阻碍试验。首先，向96孔板中添加使用lightning-linktypea生物素标记试剂盒(innovabiosciences公司)进行了生物素标记的牛pd-1-ig(终浓度5μg/ml)，使之与终浓度(0、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50μg/ml)的大鼠抗牛pd-1抗体5d2或大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2在37℃反应30分钟。使该混合液与1×10⁵个牛pd-l1表达细胞在37℃反应30分钟。清洗后，使apc标记抗生蛋白链菌素(biolegend公司)在室温下反应30分钟，检测出结合于细胞表面的牛pd-1-ig。分析中使用了facsverse(bdbiosciences公司)。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有1％牛血清白蛋白(sigma-aldrich公司)的pbs。将未添加抗体时的牛pd-1-ig结合细胞的比例设为100％，作为相对值表示出各抗体浓度下的牛pd-1-ig结合细胞的比例。

将实验结果表示于图5中。大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2以与大鼠抗牛pd-1抗体5d2相同的程度阻碍了pd-1-ig与pd-l1表达细胞的结合。

2.11.大鼠抗牛pd-1抗体的cdr分析

使用ncbiigblast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，确定了大鼠抗牛pd-1抗体5d2的互补链决定区(cdr)。将结果表示于图1中。

2.12.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体对牛的接种试验

对blv实验感染小牛(荷尔斯泰因种、公、4月龄、体重173.5kg)静脉滴注所建立的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d214mg(0.08mg/kg)。从感染牛中经时地进行采血，采集血液(使用肝素钠(味之素制药株式会公司)作为抗凝剂)及血清。利用使用了percoll(gehealthcare公司)的密度梯度离心法从血液中分离出外周血单核细胞(pbmc)。

2.13.施用的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的血中动态(图6)

将牛pd-1-his(前述)以终浓度10μg/ml在elisa板(h型，住友电木公司)中在4℃固相化一晩。其后，将各孔用加入有0.05％tween20的tris-缓冲盐水溶液(tbs-t)200μl清洗5次，使用加入有1％脱脂牛奶的tbs-t在室温下进行1小时封闭。再次同样地进行清洗，将从试验牛中采集的血清添加到各孔中，在室温下反应1小时。清洗后，使辣根过氧化物酶标记抗牛iggf(c)兔多克隆抗体(rockland公司)在室温下反应1小时。再次清洗各孔，加入tmb单组分底物(bethyl公司)，进行了显色。其后，用0.18m稀硫酸停止酶反应，使用微板读数仪mtp-650fa(corona电气公司)测定出吸光度(450nm)。在板的各清洗操作中，使用了全自动洗板机biowasher50(dspharmabiomedical公司)。

将实验结果表示于图6中。直到施用后第70天(临床试验结束时)都从试验牛的血清中检测出大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体。特别是施用后1周维持了高抗体浓度。

2.14.t细胞对blv抗原的细胞增殖响应(图7)

将牛pbmc悬浮于pbs中，使羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse；invitrogen公司)在室温下反应20分钟，进行了标记。用包含10％钝化胎牛血清(cellculturetechnologies公司)、青霉素200u/ml、链霉素200μg/ml、0.01％l-谷氨酸(lifetechnologies公司)的rpmi1640培养基(sigma-aldrich公司)清洗2次后，用相同培养基调整为4×10⁶个/ml。向pbmc中添加2％blv感染胎绵羊肾细胞(flk-blv)培养上清液、2％blv非感染胎绵羊肾细胞(flk)培养上清液、或blvgp51肽混合物0.1μg/ml或1μg/ml，在37℃、5％co2条件下培养6天。6天后，回收pbmc，与alexafluor647标记小鼠抗牛cd4抗体(cc30，abdserotec公司)、多甲藻素-叶绿素-蛋白质复合物/花青苷5.5标记小鼠抗牛cd8抗体(cc63，abdserotec公司)及藻红蛋白/花青苷7(pe/cy7)标记抗牛igm小鼠抗体(il-a30，abdserotec公司)在4℃反应20分钟。在抗体的标记时使用了zenonmouseigg1标记试剂盒(lifetechnologies公司)或lightning-linkkits(innovabiosciences公司)。在分析时使用了facsverse(bdbiosciences公司)。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有1％牛血清白蛋白(sigma-aldrich公司)的pbs。对于增殖了的t细胞(cfse^low细胞)的比例，使用dunnett的方法进行了统计学检验。

将实验结果表示于图7中。利用大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的施用，cd4⁺t细胞中的blv特异性细胞增殖响应与施用前相比，从刚刚施用后起在统计学上明显地增加。

2.15.blv前病毒量的推移(图8)

从分离出的牛pbmc中使用wizarddnapurificationkit(promega公司)提取dna。对所提取出的dna的浓度以使用nanodrop8000分光光度计(thermofisherscientific公司)测定出的吸光度(260nm)作为基准进行定量。为了测定pbmc中的blv前病毒量，使用cycleavepcrreactionmixsp(takara公司)及牛白血病病毒检测用探针/引物/阳性对照(takara公司)进行实时pcr。测定中使用了lightcycler480systemii(rochediagnosis公司)。对于测定出的前病毒量，使用dunnett的方法进行了统计学检验。

将实验结果表示于图8中。利用大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的施用，pbmc中的blv前病毒量与施用前相比，从刚刚施用后起在统计学上明显地减少，保持低的值不变地推移至临床试验结束时(第70天)。

〔实施例2〕抗pd-1抗体向其他动物种类的应用

1.材料、方法、以及实验结果

1.1.绵羊及水牛pd-1基因的鉴定

为了确定绵羊及水牛pd-1cdna编码区(cds)全长，首先设计以牛及绵羊pd-1基因的碱基序列(genbank登记号bc123854及xm_012176227)为基础扩增基因的cds全长的引物(ovpd-1cdsf及r、bupd-1cdsf1、r1、f2及r2)，以所合成出的绵羊或水牛pbmc来源cdna作为模板实行了pcr法。对所得的扩增产物，依照常法利用毛细管测序仪确定出碱基序列(mingalacn，konnais，ikebuchir，ohashik.comp.immunol.microbiol.infect.dis.，34(1)：55-63；jan.2011.鉴定水牛pd-1基因的论文)。

引物(ovpd-1cdsf)：atggggaccccgcgggcgcc(序列号67)；

引物(ovpd-1cdsr)：tcagaggggccaggagcagtgtcca(序列号68)；

引物(bupd-1cdsf1)：atggggaccccgcgggcgct(序列号69)；

引物(bupd-1cdsr1)：gatgaccaggctctgcatct(序列号70)；

引物(bupd-1cdsf2)：aatgacagcggcgtctactt(序列号71)；

引物(bupd-1cdsr2)：tcagaggggccaggagcagt(序列号72)。

1.2.绵羊pd-1表达cos-7细胞的构建

为了制作绵羊pd-1表达质粒，以所合成出的绵羊pbmc来源cdna为模板、使用向5′末端侧加入选择性酶bglii及smai识别部位而设计的引物(ovpd-1-egfpf及r)进行了pcr。对所得的pcr产物利用bglii及smai(takara公司)处理后，使用fastgenegel/pcr提取试剂盒(nippongenetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的pegfp-n2载体(clontech公司)，进行了克隆。使用fastgenexpressplasmidpluskit(nippongenetics公司)提取表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pegfp-n2-ovpd-1。

引物(ovpd-1-egfpf)：

gaagatctatggggaccccgcgggcgccg(序列号73)；

引物(ovpd-1-egfpr)：

gacccggggaggggccaggagcagtgtcc(序列号74)。

将5×10⁴/cm²的cos-7细胞在6孔板中进行传代，在包含10％钝化胎牛血清(invitrogen公司)、0.01％l-谷氨酸(lifetechnologies公司)的rpmi1640培养基中在37℃、5％co2存在下培养一晩。将pegfp-n2-ovpd-1或作为阴性对照的pegfp-n20.4μg/cm²使用lipofectamine2000(invitrogen公司)导入cos-7细胞并培养48小时(ovpd-1-egfp表达细胞)。为了确认所制作出的表达细胞中的绵羊pd-1的表达，利用全功能荧光显微镜bz-9000(keyence公司)使egfp的细胞内局部可视化。

1.3.大鼠抗牛pd-1抗体5d2与绵羊pd-1的反应性(图9)

利用流式细胞仪法确认到大鼠抗牛pd-1单克隆抗体与绵羊pd-1发生交叉反应。将绵羊pd-1-egfp表达cos-7细胞使用加入有10％钝化山羊血清(invitrogen公司)的pbs在室温下封闭15分钟，使10μg/ml的大鼠抗牛pd-1抗体5d2在室温下反应30分钟，清洗后使apc标记抗大鼠ig山羊抗体(beckmancoulter公司)在室温下反应30分钟。作为阴性对照抗体，使用了大鼠igg2a(κ)同种型对照(bdbiosciences公司)。在分析时使用了facsverse(bdbiosciences公司)。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有1％牛血清白蛋白(sigma-aldrich公司)的pbs。

将实验结果以图9表示。确认了大鼠抗牛pd-1抗体5d2与绵羊pd-1表达细胞结合。

1.4.大鼠抗牛pd-1抗体5d2与水牛的淋巴细胞的反应性(图10)

从水牛(bubalusbubalis；亚洲水牛)的外周血中，利用使用了percoll(gehealthcare公司)的密度梯度离心法分离出外周血单核细胞(pbmc)。将分离出的水牛pbmc悬浮于包含10％钝化胎牛血清(cellculturetechnologies公司)、青霉素200u/ml、链霉素200μg/ml、0.01％l-谷氨酸(lifetechnologies公司)的rpmi1640培养基(sigma-aldrich公司)中，调整为2×10⁶个/ml。向该pbmc中添加醋酸佛波豆蔻酯(phorbol12-myristateacetate)(pma)20ng/ml及离子霉素(ionomycin)1μg/ml(sigma-aldrich公司)，在37℃、5％co2条件下培养2天。回收所培养的pbmc，使用加入有10％钝化山羊血清(invitrogen公司)的pbs在室温下封闭15分钟，使大鼠抗牛pd-1抗体5d2、小鼠抗牛cd8抗体(38.65，abdserotec公司)在37℃反应30分钟。作为阴性对照抗体，使用了大鼠igg2a(κ)同种型对照(bdbiosciences公司)。清洗后，使apc标记山羊抗大鼠ig抗体(beckmancoulter公司)、pe标记山羊抗小鼠igg抗体(beckmancoulter公司)在室温下反应30分钟。进一步清洗后，使alexaflour488标记小鼠抗牛cd4抗体(cc30，abdserotec公司)及pe/cy7标记抗牛igm小鼠抗体(il-a30，abdserotec公司)在室温下反应30分钟。作为抗体的标记使用了zenonmouseigg1标记试剂盒(lifetechnologies公司)或lightning-linkkits(innovabiosciences公司)。在分析时使用了facsverse(bdbiosciences公司)。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有10％钝化山羊血清(invitrogen公司)的pbs。

将实验结果以图10表示。大鼠抗牛pd-1抗体5d2与利用pma/离子霉素刺激活化了的水牛的cd4⁺t细胞(igm^-cd4⁺)及cd8⁺t细胞(igm^-cd8⁺)强烈地结合。

〔实施例3〕具有野生型或突变型牛igg1的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体与牛fcγ受体的结合性

序论

实施例1中，以建立对牛的感染症的新型治疗法为目的建立了大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体。此时，为了抑制借助嵌合抗体的adcc活性，对牛igg1ch2结构域的fcγ受体预想结合部位施加了突变(图1、图11)。本实施例中，为了研究该氨基酸突变的效果，制作具有突变型牛igg1(上述、igg1adcc-)和野生型牛igg1(igg1wt)的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体，确认了与已知的牛fcγ受体的结合性。

材料、方法、以及实验结果

2.1.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体表达载体的制作

建立具有野生型牛igg1(igg1wt)或突变型牛igg1(上述、igg1adcc-)的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2。

依照实施例1中记载的步骤，制作出编码具有突变型igg1(igg1adcc-)的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的表达质粒(序列号9及10(氨基酸序列)、序列号14及15(密码子最佳化后核苷酸序列)。需要说明的是，在ch5d2igg1adcc-中所用的牛igg1中为了抑制adcc活性，对ch2结构域的fcγ受体预想结合部位施加了突变(参照图1及图11。氨基酸序号及突变：251e→p，252l→v，253p→a，254g→缺失，348a→s，349p→s；ikebuchir，konnais，okagawat，yokoyamak，nakajimac，suzukiy，muratas，ohashik.immunology，142(4)：551-561；aug.2014.)。以后，将所制作出的表达质粒表示为pdn112-bopd-1ch5d2igg1adcc-。

依照以下的步骤，制作出编码具有野生型igg1(igg1wt)的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2的表达质粒。首先，为了扩增野生型的牛igg1(genbank登记号x62916)恒定区的基因，以所合成出的牛pbmc来源cdna为模板、使用向5′末端侧加入选择性酶nhei及xbai识别部位而设计的引物(boigg1ch1f及boigg1ch3r)进行了pcr。将扩增了的基因链利用nhei(takara公司)及xbai(takara公司)处理后，使用fastgenegel/pcr提取试剂盒(nippongenetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的pdn112-bopd-1ch5d2igg1adcc-，进行了克隆。此外，将该质粒用qiagenplasmidmidikit(qiagen公司)纯化，利用noti(takara公司)及xbai(takara公司)处理，得到ch5d2的轻链(序列号9(氨基酸序列)、序列号14(核苷酸序列))及重链(igg1wt)(序列号75(氨基酸序列)、序列号76(核苷酸序列))的表达盒。将该基因片段用fastgenegel/pcr提取试剂盒(nippongenetics公司)纯化，导入表达质粒pdc6(由北海道大学人畜共患感染症研究中心铃木定彦教授分与)的克隆位点(位于pcmv下游、inrbg与pabgh之间的noti及xbai选择性酶识别序列)，进行了克隆(图12)。使用qiagenplasmidmidikit(qiagen公司)提取所得的目标的表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作出的表达质粒表示为pdc6-bopd-1ch5d2igg1wt。

引物(boigg1ch1f)：ctagctagcaccacagccccgaaagtct(序列号77)；

引物(boigg1ch3r)：

tgctctagattatttacccgcagacttaga(序列号78)。

2.2.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的表达及纯化

向7.5×10⁷个的expi293f细胞(lifetechnologies公司)中使用expifectamine(lifetechnologies公司)导入30μg的pdc6-bopd-1ch5d2igg1wt或pdn112-bopd-1ch5d2igg1adcc-，进行5～7天振荡培养后回收培养上清液。从培养上清液中使用abcapcherextra(protenova公司)纯化各嵌合抗体。与树脂的结合使用开管柱法，作为平衡化缓冲液及清洗缓冲液使用1.5m甘氨酸/3mnacl(ph8.0)。作为洗脱缓冲液使用0.1m甘氨酸-hcl(ph2.8)，作为中和缓冲液使用1mtris(ph9.0)。对纯化了的抗体使用pd-10脱盐柱(gehealthcare公司)及amiconultra-15(50kda、millipore公司)进行了置换为pbs(ph7.4)的缓冲液置换及浓缩。将纯化了的嵌合抗体通过0.22μm注射器过滤器(palllifesciences公司)而进行灭菌，在用于实验前以4℃保存。对纯化后的各嵌合抗体浓度利用使用nanodrop8000分光光度计(thermofisherscientific公司)测定出的吸光度(280nm)进行了定量。

2.3.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体的纯化纯度的确认(图13)

为了确认纯化了的大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体(ch5d2igg1wt及ch5d2igg1adcc-)的纯度，利用sds-page及cbb染色进行了抗体蛋白质的检测。将纯化了的各嵌合抗体悬浮于laemmli样品缓冲液(bio-rad公司)中，在还原条件下(利用2-巯基乙醇(sigma-aldrich公司)还原)或非还原条件下进行变性处理(95℃、5分钟)。对所制备的样品使用supersepace5％-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(和光纯药工业公司)进行电泳。此时，作为分子量标记使用了precisionplusprotein全蓝蛋白质标准品(bio-rad公司)。电泳后，利用quick-cbb(和光纯药工业公司)进行凝胶的染色，接下来在蒸馏水中进行脱色。

将结果表示于图13中。还原条件下确认到25kda(轻链)及50kda(重链)，非还原条件下在150kda的预估的位置确认到ch5d2igg1wt及ch5d2igg1adcc-的条带。

2.4.可溶性牛fcγ受体(fcγr)的构建

依照以下的步骤，构建了牛fcγri-his、fcγrii-his、fcγriii-his及fcγ2r-his表达质粒。以扩增牛fcγri、fcγrii、fcγriii及fcγ2r(genbank登记号nm_174538、nm_174539、nm_001077402及nm_001001138)的信号肽及细胞外区域的方式，设计了向5′末端侧加入有选择性酶noti及xhoi识别部位的引物(bofcγri-hisf及r、bofcγriii-hisf及r、或bofcγ2r-hisf及r)或向5′末端侧加入有选择性酶nhei及ecorv识别部位的引物(bofcγriii-hisf及r)。需要说明的是，向反向引物中加入了编码6×组氨酸(his)标签的基因序列。以所合成出的牛pbmc来源cdna为模板进行pcr，将各自的pcr产物利用noti(takara公司)及xhoi(takara公司)(fcγri-his、fcγriii-his及fcγ2r-his)或nhei(takara公司)及ecorv(takara公司)(fcγrii-his)处理后，使用fastgenegel/pcr提取试剂盒(nippongenetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的pcxn2.1(+)载体(niwah，yamamurak，miyazakij.gene，108(2)：193-199；dec.15，1991；由顺天堂大学大学院医学研究科横沟岳彦教授分与)，进行了克隆。利用fastgenexpressplasmidpluskit(nippongenetics公司)纯化表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作出的表达质粒表示为pcxn2.1-bofcγri-his、pcxn2.1-bofcγrii-his、pcxn2.1-bofcγriii-his或pcxn2.1-bofcγ2r-his。

引物(bofcγri-hisf)：

ataagaatgcggccgccaccatgtggctcataatagctct(序列号79)；

引物(bofcγri-hisr)：

gccctcgagttaatggtgatggtgatggtgaggagttgttgactggaggc(序列号80)；

引物(bofcγrii-hisf)：

ataagaatgctagccaccatggggatcccctcattcct(序列号81)；

引物(bofcγrii-hisr)：

gccgatatcttaatggtgatggtgatggtgcgatgaggggccgctcgagc(序列号82)；

引物(bofcγriii-hisf)：

ataagaatgcggccgccaccatgtggcaactgctaccacc(序列号83)；

引物(bofcγriii-hisr)：

gccctcgagttaatggtgatggtgatggtggtgccaaggtagaaagaatg(序列号84)；

引物(bofcγ2r-hisf)：

ataagaatgcggccgccaccatggcccccaccctccctgccttgctct(序列号85)；

引物(bofcγ2r-hisr)：

gccctcgagttaatggtgatggtgatggtgattctgcatcgtgtagtctg(序列号86)。

依照以下的步骤，制作出可溶性牛fcγri-his、fcγrii-his、fcγriii-his及fcγ2r-his表达细胞。向7.5×10⁷个的expi293f细胞(lifetechnologies公司)中使用expifectamine(lifetechnologies公司)导入30μg的pcxn2.1-bofcγri-his、pcxn2.1-bofcγrii-his、pcxn2.1-bofcγriii-his或pcxn2.1-bofcγ2r-his，进行5～7天振荡培养后回收培养上清液。从培养上清液中使用talon金属亲和树脂(clontech公司)纯化重组蛋白。纯化后，利用amiconultra-15离心超滤装置(10kda、millipore公司)将缓冲液置换为pbs(ph7.4)，在用于实验前以-30℃保存(牛pd-1-his)。对纯化后的牛fcγri-his、fcγrii-his、fcγriii-his及fcγ2r-his浓度利用使用nanodrop8000分光光度计(thermofisherscientific公司)测定出的吸光度(280nm)进行了定量。

2.5.大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2igg1wt及igg1adcc-与牛fcγr的结合性(图14)

将大鼠－牛嵌合抗牛pd-1抗体ch5d2igg1wt或igg1adcc-以终浓度50、25、12.5、6.25、3.12、1.5610nm在nuncmaxisorpelisa板(nunc公司)中在37℃固相化2小时。其后，将各孔用加入有0.05％tween20的pbs(pbs-t)200μl清洗5次，使用superblock(pbs)封闭缓冲液(thermofisherscientific公司)在37℃进行30分钟封闭。再次同样地进行清洗，将牛fcγri-his、fcγrii-his、fcγriii-his或fcγ2r-his以终浓度10μg/ml添加到各孔中，在37℃反应1小时。清洗后，使抗多聚组氨酸标签小鼠单克隆抗体(abcam公司)在37℃反应30分钟。然后，清洗各孔，使辣根过氧化物酶标记抗小鼠igg山羊多克隆抗体(mpbiomedicals公司)在37℃反应30分钟。再次清洗各孔，加入tmb单组分底物(bethyl公司)，进行了显色。其后，用0.18m稀硫酸停止酶反应，使用微板读数仪mtp-900(corona电气公司)测定出吸光度(450nm)。在板的各清洗操作中，使用了全自动洗板机biowasher50(dspharmabiomedical公司)。

将实验结果表示于图14中。igg1wt与牛fcγri-his强结合，与牛fcγrii-his弱结合。另一方面，igg1adcc-未与牛fcγri-his及fcγrii-his结合。另外，igg1wt及igg1adcc-均未观察到与牛fcγriii-his及牛fcγ2r-his的结合。

将本说明书中引用的所有出版物、专利及专利申请原样不变地作为参考纳入本说明书中。

产业上的可利用性

本发明的抗pd-1抗体可以用于动物的癌症、感染症的预防和/或治疗。

＜序列号1＞

序列号1表示大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区的氨基酸序列。下划线部：从nh2末端起依次为cdr1、cdr2、cdr3。

＜序列号2＞

序列号2表示大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区的氨基酸序列。下划线部：从nh2末端起依次为cdr1、cdr2、cdr3。

＜序列号3＞

序列号3表示牛抗体的l链恒定区(牛iglambda，genbank：x62917)的氨基酸序列。

＜序列号4＞

序列号4表示牛抗体的h链恒定区(牛igg1，改变genbank：x62916)的氨基酸序列。在突变部位划有下划线。氨基酸序号及突变：123e→p，124l→v，125p→a，126g→缺失，218a→s，219p→s

＜序列号5＞

序列号5表示大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区的核苷酸序列。

将序列号5的核苷酸序列的密码子最佳化后核苷酸序列表示于＜序列号11＞中。

＜序列号6＞

序列号6表示大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区的核苷酸序列。

将序列号6的核苷酸序列的密码子最佳化后核苷酸序列表示于＜序列号12＞中。

＜序列号7＞

序列号7表示牛抗体的l链恒定区(牛iglambda，genbank：x62917)的核苷酸序列。

将序列号7的核苷酸序列的密码子最佳化后核苷酸序列表示于＜序列号13＞中。

＜序列号8＞

序列号8表示牛抗体的h链恒定区(牛igg1，改变genbank：x62916)的核苷酸序列(密码子最佳化后)。

＜序列号9＞

序列号9表示包含大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区和牛抗体的l链恒定区的嵌合l链的氨基酸序列。

＜序列号10＞

序列号10表示包含大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区和牛抗体的h链恒定区(牛igg1，改变genbank：x62916)的嵌合h链的氨基酸序列。

＜序列号14＞

表示包含大鼠抗牛pd-1抗体的l链可变区和牛抗体的l链恒定区的嵌合l链的核苷酸序列(密码子最佳化后核苷酸序列)。

＜序列号15＞

表示包含大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区和牛抗体的h链恒定区(牛igg1，改变genbank：x62916)的嵌合h链的核苷酸序列(密码子最佳化后核苷酸序列)。

＜序列号16＞

序列号16表示大鼠抗牛pd-1抗体5d2的l链可变区的cdr1的氨基酸序列(qsleysdgyty)。

＜序列号17＞

序列号17表示大鼠抗牛pd-1抗体5d2的l链可变区的cdr3的氨基酸序列(fqathdpdt)。

＜序列号18＞

序列号18表示大鼠抗牛pd-1抗体5d2的h链可变区的cdr1的氨基酸序列(gfsltsyy)。

＜序列号19＞

序列号19表示大鼠抗牛pd-1抗体5d2的h链可变区的cdr2的氨基酸序列(irsggst)。

＜序列号20＞

序列号20表示大鼠抗牛pd-1抗体5d2的h链可变区的cdr3的氨基酸序列(artssgyeggfdy)。

＜序列号21＞

序列号21表示牛抗体(igg1突变体1)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号22＞

序列号22表示牛抗体(igg1突变体2)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号23＞

序列号23表示牛抗体(igg1突变体3)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号24＞

序列号24表示牛抗体(igg2突变体1)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号25＞

序列号25表示牛抗体(igg2突变体2)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号26＞

序列号26表示牛抗体(igg2突变体3)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号27＞

序列号27表示牛抗体(igg3突变体1)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号28＞

序列号28表示牛抗体(igg3突变体2)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号29＞

序列号29表示牛抗体(igg1突变体1)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号30＞

序列号30表示牛抗体(igg1突变体2)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号31＞

序列号31表示牛抗体(igg1突变体3)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号32＞

序列号32表示牛抗体(igg2突变体1)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号33＞

序列号33表示牛抗体(igg2突变体2)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号34＞

序列号34表示牛抗体(igg2突变体3)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号35＞

序列号35表示牛抗体(igg3突变体1)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号36＞

序列号36表示牛抗体(igg3突变体2)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号37＞

序列号37表示绵羊抗体(igg1)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号38＞

序列号38表示绵羊抗体(igg1)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号39＞

序列号39表示绵羊抗体(igg2)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号40＞

序列号40表示绵羊抗体(igg2)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号41＞

序列号41表示绵羊抗体的l链(igkappa(ck))恒定区的氨基酸序列。

＜序列号42＞

序列号42表示绵羊抗体的l链(igkappa(ck))恒定区的核苷酸序列。

＜序列号43＞

序列号43表示绵羊抗体的l链(iglambda(cl))恒定区的氨基酸序列。

＜序列号44＞

序列号44表示绵羊抗体的l链(iglambda(cl))恒定区的核苷酸序列。

＜序列号45＞

序列号45表示水牛抗体(推定为igg1)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号46＞

序列号46表示水牛抗体(推定为igg1)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号47＞

序列号47表示水牛抗体(推定为igg2)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号48＞

序列号48表示水牛抗体(推定为igg2)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号49＞

序列号49表示水牛抗体(推定为igg3)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号50＞

序列号50表示水牛抗体(推定为igg3)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号51＞

序列号51表示水牛抗体的l链(推定为iglambda)恒定区(cl)的氨基酸序列。

＜序列号52＞

序列号52表示水牛抗体的l链(推定为iglambda)恒定区(cl)的核苷酸序列。

＜序列号53＞

序列号53表示人抗体(igg4突变体1)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号54＞

序列号54表示人抗体(igg4突变体1)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号55＞

序列号55表示人抗体(igg4突变体2)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号56＞

序列号56表示人抗体(igg4突变体2)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号57＞

序列号57表示人抗体(igg4突变体3)的h链恒定区(ch1～ch3)的氨基酸序列。

＜序列号58＞

序列号58表示人抗体(igg4突变体3)的h链恒定区(ch1～ch3)的核苷酸序列。

＜序列号59＞

序列号59表示人抗体的l链恒定区的氨基酸序列。

＜序列号60＞

序列号60表示人抗体的l链恒定区的核苷酸序列。

＜序列号61～74＞

序列号61～74依次表示引物bopd-1-mycf、bopd-1-mycr、bopd-l1-egfpf、bopd-l1-egfpr、bopd-1-hisf、bopd-1-hisr、ovpd-1cdsf、ovpd-1cdsr、bupd-1cdsf1、bupd-1cdsr1、bupd-1cdsf2、bupd-1cdsr2、ovpd-1-egfpf及ovpd-1-egfpr的核苷酸序列。

＜序列号75＞

序列号75表示包含大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区和牛抗体的h链恒定区(牛igg1，genbank：x62916)的嵌合h链的核苷酸序列。

＜序列号76＞

序列号75表示包含大鼠抗牛pd-1抗体的h链可变区和牛抗体的h链恒定区(牛igg1，genbank：x62916)的嵌合h链的氨基酸序列。

＜序列号77～86＞

序列号77～86依次表示引物boigg1ch1f、boigg1ch3r、bofcγri-hisf、bofcγri-hisr、bofcγrii-hisf、bofcγrii-hisr、bofcγriii-hisf、bofcγriii-hisr、bofcγ2r-hisf及bofcγ2r-hisr的核苷酸序列。