L-半胱氨酸的制造方法与流程

本发明涉及作为氨基酸的一种的l-半胱氨酸的制造方法。
背景技术：
：l-半胱氨酸为近年来市场急剧扩大的氨基酸，预测其市场今后也会由于世界人口的增加而持续扩大。l-半胱氨酸的主要的用途为用作食品添加物、药品、化妆品或谷胱甘肽、n-乙酰基-半胱氨酸、辅酶a的合成前体。作为l-半胱氨酸的制造方法，以从毛发或羽毛等的酸水解物的分离提取为中心，但近年也开始利用使用微生物的发酵法来制造。但是，利用微生物的发酵法存在如下的课题。已知有l-半胱氨酸的细胞内浓度的上升会引起(1)对微生物的增殖抑制和(2)对生物合成酶的反馈抑制。关于(1)，正在谋求通过l-半胱氨酸细胞外排泵蛋白的鉴定和该基因的表达强化来解决；关于(2)，正在谋求通过l-半胱氨酸生物合成酶的立体结构解析和反馈抑制机制的阐明、及基于其的非敏感性变异酶的研发的育种战略来解决。这样，正在尝试有效利用微生物的代谢功能、通过基因改造、育种等来提高生产率，但由于如上所述的课题，有时无法得到充分的生产率。(专利文献1～5)另外，正在进行使用源自微生物的酶制造各种有用物质(专利文献6、7)。用这种方法制造l-半胱氨酸时，有时在其过程中会合成o-磷酸丝氨酸。该o-磷酸丝氨酸由3-磷酸甘油酸(以下，原则上称为“3pg”)经由磷酸羟基丙酮酸(以下，原则上称为“hpv”)而合成。在非专利文献1中报道有源自作为超嗜热菌古生菌的东工大硫化叶菌(sulfolobustokodaii)的3-磷酸甘油酸脱氢酶(以下，原则上称为“pgdh”)，但仅在ph11这样的非常极端的条件且以促进二硫键的方式设计的大肠杆菌中过量表达的pgdh能确认到酶活性，在本来菌体可生存的中性附近的ph8.0几乎看不到活性。本申请发明人等对已经被注释(annotation)的源自thermococcuskodakarensiskod1的pgdh进行克隆，测定酶活性，但同样地单独时不能表现出活性。在这种背景中，为了适应今后需求的进一步增大而要求开发一种l-半胱氨酸的廉价且有效的制造方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2010-22215号公报专利文献2：wo2013/000864专利文献3：日本特开2009-232844号公报专利文献4：日本再表2012-137689号公报专利文献5：wo2012/152664专利文献6：日本特开2005-160371号公报专利文献7：日本特开2003-219892号公报非专利文献非专利文献1:1:shimizuy,sakurabah,doik,ohshimat(2008)molecularandfunctionalcharacterizationofd-3-phosphoglyceratedehydrogenaseintheserinebiosyntheticpathwayofthehyperthermophilicarchaeonsulfolobustokodaii.archbiochembiophys.470(2):120-8.技术实现要素：发明所要解决的技术问题本发明的课题在于，提供一种取代现有的发酵法的新的制造l-半胱氨酸的方法。更具体而言，通过耐热性酶的组合，提供一种l-半胱氨酸的制造方法。特别是课题在于，提供一种有效地制造由3pg经由hpv而合成o-磷酸丝氨酸的通路的方法。用于解决问题的技术方案本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现一种l-半胱氨酸的制造方法，所述制造方法将耐热性酶组合并利用体外构建任意的人工代谢通路的技术。本发明的概要如下：(1)使源自嗜热菌/超嗜热菌的耐热性酶基因在大肠杆菌那样的通用的且中温性的微生物宿主内表达。(2)将得到的重组菌体或来自菌体的提取液供于60～90℃左右的热处理，使源自宿主的酶失活，同时部分地破坏宿主的细胞结构，从而制成底物/产物的透过性得到提高的催化剂组件。(3)将这些组件组合，构建体外人工代谢通路。另外，关于o-磷酸丝氨酸的合成，可以通过将源自异种菌株的pgdh和磷酸丝氨酸氨基转移酶(以下，原则上称为“psat”)而表现出活性。可知：就o-磷酸丝氨酸的合成而言，pgdh和psat单独时均不起作用，但组合则显示活性。这样，本发明的课题在于，提供一种取代现有的发酵法的新的制造l-半胱氨酸的方法。更具体而言，通过耐热性酶的组合，提供一种l-半胱氨酸的制造方法。特别是发现一种由3pg经由hpv而制造作为l-半胱氨酸的前体、即o-磷酸丝氨酸的方法。更具体而言，提供如下的发明。(1)一种o-磷酸丝氨酸的制造方法，使源自嗜热菌的3-磷酸甘油酸脱氢酶(pgdh)及磷酸丝氨酸氨基转移酶(psat)作用于3-磷酸甘油酸(3pg)，生成o-磷酸丝氨酸；(2)一种l-半胱氨酸的制造方法，其为制造l-半胱氨酸的方法，其包含(1)的制造工序；(3)根据(2)所述的制造方法，其特征在于，进一步添加谷氨酸脱氢酶(gdh)或nadh氧化酶(以下，“nox”)而制造。发明效果根据本发明，可以通过使用由微生物粗纯化而得的耐热性酶来体外制造l-半胱氨酸。因此，在发酵法中成为课题的l-半胱氨酸导致的生长抑制不再成为问题。另外，在本发明中，可以通过将酶组合而自由地设计通路，因此，能够设计成不经由会受到l-半胱氨酸的反馈抑制的酶反应的方式(图1)。附图说明图1是l-半胱氨酸制造的代谢通路例。图2是pgdh的活性测定。图3是psat的活性测定结果。图4是反应液中的nadh及α-kg的浓度。图5是pgdh的活性。图6是添加辅酶再生系统的研究。图7是半胱氨酸生产试验的经时变化。具体实施方式本发明为一种o-磷酸丝氨酸的制造方法，其使源自嗜热菌的磷酸丝氨酸氨基转移酶(psat)及3-磷酸甘油酸脱氢酶(pgdh)作用于3-磷酸甘油酸(3pg)，生成o-磷酸丝氨酸。进一步为包含上述的工序的l-半胱氨酸的制造方法。o-磷酸丝氨酸由3pg经由hpv而合成。该通路中使用的酶为pgdh及psat。本发明中所使用的3-磷酸甘油酸脱氢酶(pgdh)为将3pg变换为hpv的氧化还原酶。如果该酶源自嗜热菌，则其结构等没有特别限定。在本发明中，嗜热菌为表达在60℃以上、特别是70～110℃下不变性且可以保持活性的酶的菌。作为嗜热菌，例如为：栖热菌属(嗜热栖热菌(thermusthermophilus)、水生栖热菌(thermusaquaticus)等)、热孢菌属(莱廷格热袍菌(thermotogalettingae)、那不勒斯栖热袍菌(thermotoganeapolitana)、嗜岩热孢菌(thermotogapetrophila)、海栖热袍菌(thermotogamaritima)等)、热球菌属(thermococcusprofundus、thermococcuskodakarensis、thermococcusgammatolerans等)、火球菌属(掘越氏火球菌(pyrococcushorikoshii)、深海热球菌(pyrococcusabyssi)、甘氏火球菌(pyrococcusglycovorans)、激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)、沃氏火球菌(pyrococcuswosei)等)、硫化叶菌属(东工大硫化叶菌(sulfolobustokodaii)、嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)、冰岛硫化叶菌(sulfolobusislandicus)、硫磺矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus))、热网菌属(隐蔽热网菌(pyrodictiumoccultum)、火山口热网菌(pyrodictiumabyssi)、布氏热网菌(pyrodictiumbrockii)等)、火棒菌属(高温热棒菌(pyrobaculumaerophilum)、pyrobaculumarsenaticum、嗜有机物热棒菌(pyrobaculumorganotrophum)等)、超热菌属(丁酸栖高温菌(hyperthermusbutylicus)等)、产水菌属(噬火液菌(aquifexpyrophilus)等)、热脱硫杆菌属(好热硫酸还原菌(thermodesulfobacteriumcommune)等)、甲烷嗜热菌属(坎氏甲烷嗜热菌(methanopyruskandleri)等)、火叶菌属(延胡索酸火叶菌(pyrolobusfumarii)等)、热变形菌属(顽固热变形菌(thermoproteustenax)、嗜中性热变形菌(thermoproteusnaphthophila))、嗜热聚球藻属(嗜热蓝细菌聚球藻(thermosynechococcuselongates))、聚球藻属(铅色聚球藻(synechococcuslividus))、海洋栖热菌属(深层大洋栖热菌(oceanithermusprofundus))、红嗜热盐菌属(海洋红嗜热盐菌(rhodothermusmarinus))、热弧菌属(加氨热弧菌(thermovibrioammonificans))、除硫杆菌属(大西洋还原硫杆状菌(desulfurobacteriumthermolithotrophum))、热脱硫杆菌属(印度洋热还原硫酸盐菌(thermodesulfatatorindicus))等。其次，磷酸丝氨酸氨基转移酶(psat)为丝氨酸生物合成酶。如果该酶源自嗜热菌，则其结构等没有特别限定。在本发明中，嗜热菌为表达在60℃以上、特别是70～110℃下不变性且可以保持活性的酶的菌。嗜热菌例如为：栖热菌属(嗜热栖热菌(thermusthermophilus)、水生栖热菌(thermusaquaticus)等)、热孢菌属(莱廷格热袍菌(thermotogalettingae)、那不勒斯栖热袍菌(thermotoganeapolitana)、嗜岩热孢菌(thermotogapetrophila)、海栖热袍菌(thermotogamaritima)等)、热球菌属(thermococcusprofundus、thermococcuskodakarensis、thermococcusgammatolerans等)、火球菌属(掘越氏火球菌(pyrococcushorikoshii)、深海热球菌(pyrococcusabyssi)、甘氏火球菌(pyrococcusglycovorans)、激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)、沃氏火球菌(pyrococcuswosei)等)、硫化叶菌属(东工大硫化叶菌(sulfolobustokodaii)、嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)、冰岛硫化叶菌(sulfolobusislandicus)、硫磺矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus))、热网菌属(隐蔽热网菌(pyrodictiumoccultum)、火山口热网菌(pyrodictiumabyssi)、布氏热网菌(pyrodictiumbrockii)等)、火棒菌属(高温热棒菌(pyrobaculumaerophilum)、pyrobaculumarsenaticum、嗜有机物热棒菌(pyrobaculumorganotrophum)等)、超热菌属(丁酸栖高温菌(hyperthermusbutylicus)等)、产水菌属(噬火液菌(aquifexpyrophilus)等)、热脱硫杆菌属(好热硫酸还原菌(thermodesulfobacteriumcommune)等)、甲烷嗜热菌属(坎氏甲烷嗜热菌(methanopyruskandleri)等)、火叶菌属(延胡索酸火叶菌(pyrolobusfumarii)等)、热变形菌属(顽固热变形菌(thermoproteustenax)、嗜中性热变形菌(thermoproteusnaphthophila))、嗜热聚球藻属(嗜热蓝细菌聚球藻(thermosynechococcuselongates))、聚球藻属(铅色聚球藻(synechococcuslividus))、海洋栖热菌属(深层大洋栖热菌(oceanithermusprofundus))、红嗜热盐菌属(海洋红嗜热盐菌(rhodothermusmarinus))、热弧菌属(加氨热弧菌(thermovibrioammonificans))、除硫杆菌属(大西洋还原硫杆状菌(desulfurobacteriumthermolithotrophum))、热脱硫杆菌属(印度洋热还原硫酸盐菌(thermodesulfatatorindicus))等。如果本发明中所使用的pgdh及psat源自上述的东工大硫化叶菌(s.tokodaii)等嗜热菌等，则取得该酶的方法没有特别限定。在使用基因工程的方法得到的情况下，将编码目标酶的基因插入于适当的载体，构建重组载体。可以用该重组载体转化可进行酶生产的宿主细胞，表达、制造酶。在本发明中，使用多种酶，因此，可简便地转化的dh5α、mg1655株等大肠杆菌、假单胞菌(pseudomonas)属等革兰氏阴性菌、棒状杆菌(corynebacterium)属或芽胞杆菌(bacillus)属、红球菌(rhodococcus)属等革兰氏阳性菌适合。具体而言，对于pgdh和psat，将由各微生物的基因组dna进行pcr扩增而得的该基因例如连结于pet21a，在t7启动子控制下使其表达。各微生物的基因组dna可以从国立研究开发法人理化学研究所生物资源中心、国立环境研究所、独立行政法人制品评价技术基盘机构生物技术中心(nbrc)、公益财团法人上总dna研究所等中获得。另外，就使用的dna而言，即使由序列信息合成的dna也可使用，只要氨基酸序列相同则与序列信息不完全一致也可以。合成dna为将氨基酸序列按照与大肠杆菌的密码子使用频率一致的方式设计的dna序列。将由这些dna如上述那样制备了该基因的表达载体转化到novagen社制bl21(de3)plyss等大肠杆菌中。或者，也可以插入利用同源重组或转位子形成的dna片段。转化方法可以为一般的方法。在本发明中，在由3pg制造o-磷酸丝氨酸时使用的酶为psat及pgdh。可以适当选择、使用源自前段所记载的嗜热菌的酶。该两种酶可以源自同种的菌，即使源自不同种的菌，也可以使用。在o-磷酸丝氨酸制造工序中，即使pgdh单独时仅在ph11等条件下反应的情况下，通过使用该两种酶也可以在ph6～8左右的中性附近得到o-磷酸丝氨酸。本申请发明中需要的酶可以在选自dh5α、mg1655株等大肠杆菌、假单胞菌(pseudomonas)属等革兰氏阴性菌、棒状杆菌(corynebacterium)属或芽胞杆菌(bacillus)属、红球菌(rhodococcus)属等革兰氏阳性菌等中的菌类中多个同时表达而得到。如后所述，本段落中使用的菌类除去源自宿主的蛋白质较容易，因此，不需要为嗜热菌。可以使需要的酶全部同时表达，但通常从表达效率等方面考虑，也可以如实施例记载的那样分成多个大肠杆菌等而得到酶。另外，也可以使各自的酶在各个大肠杆菌等中表达而得到。就本申请而言，使源自嗜热菌的酶在大肠杆菌等中表达而得到，因此，可以容易地除去源自大肠杆菌等宿主的蛋白质。例如，在大肠杆菌中表达后，通过在高温、60℃～80℃下进行热处理，源自大肠杆菌的蛋白质变性，但目标酶由于为源自嗜热菌的酶而不发生热变性。这样，通过除去因热处理而变性的蛋白质，可以容易地得到需要的粗酶液。就热处理而言，可以将培养后的菌体直接进行热处理。或者，也可以将菌体提取液进行热处理。提取方法可以没有特别限制地选择。也可以将菌体通过超声波破碎等而破碎后，将提取的液体进行热处理。具体而言，例如，将重组大肠杆菌的湿菌体以成为200mgwetcells/ml的方式悬浮于50mmhepes-naoh(ph8.0)，将悬浮液供于超声波破碎处理而将菌体破碎，得到无细胞提取液。对于无细胞提取液，实施70℃、30分钟的热处理，进行源自宿主的蛋白质的变性操作。可以通过利用离心分离除去细胞残留和变性蛋白质，将上清液作为粗酶液而用于l-半胱氨酸的制造。在本发明中，在制造l-半胱氨酸的工序中，在得到o-磷酸丝氨酸的工序中，包含由3pg利用上述的pgdh和psat得到o-磷酸丝氨酸的工序。由于pgdh和psat单独不起作用，因此，将两酶同时使用。两酶使用上述的源自嗜热菌的酶，但可以为源自同种的嗜热菌，也可以为源自不同种的嗜热菌，可以适当组合而使用。在制造本发明的l-半胱氨酸的工序中，在前段的由3pg得到o-磷酸丝氨酸的工序以外的工序中需要的酶也与pgdh及psat同样地，使用源自嗜热菌的酶。如果源自嗜热菌，则可以适当选择而使用。使用的酶因原料而不同，将在以葡萄糖为原料的情况下需要的酶组的实例示于表1。其它原料为甘油、淀粉等糖类，只要是可通过醣酵解系统代谢的原料即可。本申请如果具有利用pgdh和psat得到o-磷酸丝氨酸的工序，则所述的原料可以没有限制地使用。就使用葡萄糖以外的原料时的酶而言，只要是本领域技术人员，则可以适当选择。需要的酶使用源自本说明书中例示的嗜热菌的酶。[表1]酶名称ec编号简称1葡萄糖激酶2.7.1.2gk2葡萄糖磷酸异构酶5.3.1.9gpi3磷酸果糖激酶2.7.1.1pfk4果糖-1，6-二磷酸醛缩酶4.1.2.13fba5三糖磷酸异构酶5.3.1.1tim6甘油醛-3-磷酸脱氢酶1.2.1.90gapn73-磷酸甘油酸脱氢酶1.1.1.95pgdh8磷酸丝氨酸氨基转移酶2.6.1.52psat9o-磷酸丝氨酸硫化氢解酶2.5.1.65cyss10多聚磷酸激酶2.7.4.1ppk11nadh氧化酶1.6.3.4nox12谷氨酸脱氢酶1.4.1.3gdh表1的酶的取得方法与段落[0017]～[0018]中记载的方法同样地进行。全部的酶可以为同种的嗜热菌，也可以为不同种的嗜热菌。酶基因可以使用可由国立研究开发法人理化学研究所生物资源中心、国立环境研究所、独立行政法人制品评价技术基盘机构生物技术中心(nbrc)、公益财团法人上总dna研究所等获得的酶基因。可以通过pcr等由获得的dna扩增目标基因而使用。另外，可以为由获得的基因信息合成的dna。在本发明中，如上述那样导入于大肠杆菌等并进行表达，因此，可以将各酶基因优化为大肠杆菌等所选择的菌类中的表达而使用。这样得到的基因可以通过一般的方法重组于大肠杆菌表达载体。也可以将使用的全部的基因重组于一个表达载体，但可以根据所使用的基因的微生物来源、启动子选择等的优化来区分所需的表达载体而导入。例如，对于源自嗜热栖热菌(thermusthermophilus)hb8的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(ttfba)、源自顽固热变形菌(thermoproteustenax)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ttegapn)、谷氨酸脱氢酶(ttegdh)和源自thermococcuskodakarensiskod1的3-磷酸甘油酸脱氢酶(tkpgdh)、磷酸丝氨酸氨基转移酶(tkpsat)，将由各微生物的基因组dna进行pcr扩增而得的该基因连结于pet21a；对于源自敏捷气热菌(aeropyrumpernix)的o-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(amcyss)和源自thermococcusprofundus的nadh氧化酶(tpnox)，将合成dna连结于pet21a，利用t7启动子，对于源自嗜热栖热菌(t.thermophilus)hb8的乳酸脱氢酶导入于pet11a，源自嗜热栖热菌(t.thermophilus)hb8的葡萄糖激酶(ttgk)、葡萄糖磷酸异构酶(ttgpi)、磷酸果糖激酶(ttpfk)、三糖磷酸异构酶(tttim)和源自嗜热栖热菌(t.thermophilus)hb27的多聚磷酸激酶(ttppk)、丙酮酸激酶(ttpk)，将合成dna分别导入于prci(※)等，本领域技术人员可以根据使用的基因选择多个最适的载体。※ninhph,hondak,sakait,etal.(2015)assemblyandmultiplegeneexpressionofthermophilicenzymesinescherichiacoliforinvitrometabolicengineering.biotechnolbioeng112,189-196将这样得到的表达载体导入于段落0019中记载的大肠杆菌等。对导入的方法没有特别限制，可以使用一般的方法。大肠杆菌等的培养可以为一般的方法。在根据所使用的启动子而需要表达诱导的情况下，进行表达的诱导。培养大肠杆菌后，与段落0019记载的方法同样地得到粗酶液。在使用的菌类不同的情况下，可以分别地制备，也可以一并制备。由于使用源自嗜热菌的酶，因此，通过热处理，可以由于热变性而容易地除去源自大肠杆菌等宿主的蛋白质。另外，在本发明中，可以使用仅通过变性除去蛋白质的纯化而操作得到的粗酶液。另外，也可以进一步纯化而使用。将这样得到的粗酶液用于l-半胱氨酸的制造。在缓冲液中添加需要的辅酶及底物并制造。添加的辅酶及底物因使用的原料(糖类的种类)而不同，在以葡萄糖为原料的情况下，在用所述的方法得到的粗酶液中加入氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)、腺苷三磷酸(atp)、葡萄糖-1-磷酸(g1p)、谷氨酸、硫化钠、硫酸铵、多聚磷酸，向其中加入葡萄糖而制造l-半胱氨酸。在以甘油为原料的情况下，也加入甘油来代替葡萄糖而制造。在本发明中，制造的反应在50℃～80℃下进行。由此，具有原料的溶解性提高、反应速度增大、污染风险降低等优点。在以淀粉为原料的情况下，添加淀粉分解所需要的酶。在l-半胱氨酸的合成中使用作为辅酶的氧化还原辅酶nad+。但是，因α-酮戊二酸(以下，“α-kg”)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)的蓄积而达到平衡，因此，有时l-半胱氨酸的制造无法有效地进行。因此，将氧化使α-kg变换为谷氨酸的gdh或nadh的nadh氧化酶(nox)与其它酶一起使用，由此可以改善α-kg或nadh的蓄积，使l-半胱氨酸的生产速度提高。gdh和nox可以分别添加1个，但添加两个时，生产速度进一步提高，因此优选。至上述为止的酶反应结束后，通过从酶反应液中回收而可以得到l-半胱氨酸。可以通过用于氨基酸的分离纯化的一般的方法从该反应液中分离纯化l-半胱氨酸。具体而言，例如可以将凝胶色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、硫酸铵沉淀等单独或适当组合而进行。实施例以下，更详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下的方法。(3pg至o-磷酸丝氨酸工序的研究)·酶液的制备将重组大肠杆菌的湿菌体以成为200mgwetcells/ml的方式悬浮于50mmhepes-naoh(ph8.0)。通过将悬浮液供于超声波破碎处理而将菌体破碎，得到无细胞提取液。对于无细胞提取液，实施70℃、30分钟的热处理，进行源自宿主的蛋白质的变性操作。将通过离心分离而除去了细胞残留和变性蛋白质的上清液作为粗酶液，用于活性测定。·使用酶基因、菌株、培养就源自东工大硫化叶菌(s.tokodaii)(st)的pgdh及psat而言，将合成dna连结于pet21a，在t7启动子控制下进行表达。另一方面，对于源自顽固热变形菌(thermoproteustenax)(tt)和海栖热袍菌(thermotogamaritima)(tm)、t.kodakarensis(tk)、嗜热蓝细菌聚球藻(thermosynechococcuselongates)(te)的pgdh和psat，将由各微生物的基因组dna进行pcr扩增而得的该基因连结于pet21a，在t7启动子控制下进行表达。这些基因表达载体全部导入于novagen社制rosetta2(de3)plyss。在rosetta2(de3)plyss中，将100mg/l的氨苄青霉素和34mg/l的氯霉素添加于luria-bertani培养基，在37℃下好氧培养。在对数增殖后期，在培养液中添加0.2mmiptg，进行目的酶基因的诱导。·pgdh和psat的活性确认以除去了3pg的表2的组成制作反应液。在70℃下保温1分钟后，通过加入3pg而开始反应。就反应而言，通过监视340nm的吸光而测定由pgdh所生成的nadh的浓度。将结果在图2中记载。予以说明，nadh的浓度用340nm的分子吸光系数6.3×103mol-1l-1cm-1算出。由此可知：通过加入psat，而进行pgdh的反应。[表2]·psat的活性确认单独的pgdh酶不显示活性。研究psat是否也同样地显示活性。但是，psat不是使用nadh的反应，因此单独时无法进行评价。因此，研究了通过使其与nad(h)依赖型谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase，ttegdh)偶联是否进行反应。首先，确认了在表3的条件1下ttegdh具有活性。接着，通过如条件2那样使tkpsat和ttegdh偶联，验证了tkpsat是否起作用。将结果记载于图3，在此，基于340nm的分子吸光系数为6.3×103mol-1l-1cm-1，算出nadh的消耗量。由此可知：与tkpgdh同样地，tkpsat单独时也不起作用。[表3]·pgdh和psat的确认由上述可知：各自单独不显示酶活性。但是，上述的方法仅追踪nadh下的行为，因此，也许psat实际上起作用。因此，研究了通过使pgdh和psat偶联是否生产作为psat的产物之一的α-kg。用以表4的反应组成制成的体系测定nadh的活性。就吸光度计的条件而言，以波长340nm、60℃、2分钟进行空白测定，对※2的文献进行部分改变而用hplc测定底物添加后5、10、15分钟后的吸光度的值及α-kg。具体而言，取样50μl并加入40μl的2mhcl，向进行离心分离而得的上清液中加入等量的1mg/ml邻苯二胺/3mhcl，在80℃下孵化60分钟，进行冰冷并进行了离心分离，将所得物质供于hplc分析，测定α-kg。就测定条件而言，在洗脱液：乙酸/水/甲醇(1：54：45,v/v)、流速：0.4ml/分钟、色谱柱：cosmosil填充柱5c18-ar-ii4.6id×250mm、柱温：35℃、检测器：exc：336nm,emi：420nm)、样品冷却器：4℃下进行。图4中示出nadh生成量及α-kg生成量。由该结果，nadh和α-kg显示同样的结果。因此，可知：pgdh和psat连锁而进行反应。※2：muhlingj,fuchsm,camposme,gonterj,engeljm,sablotzkia,mengest,weisss,dehnemg,krullm,hempelmanng.(2003)quantitativedeterminationoffreeintracellularα-ketoacidsinneutrophils.jchromatogrb789:383-392[表4]·各种各样的嗜热菌古生菌及细菌的pgdh和psat的酶活性评价综上所述，源自t.kodakarensis的pgdh及psat在两者共存时起作用。因此，以表6的组合研究了不同的嗜热菌古生菌或细菌的情况下，以表5的组成且同样地组合pgdh及psat是否也起作用。这些酶同样地单独不起作用，但可以通过将pgdh和psat组合而确认活性(图5)。另外，可知：通过在6、7中将源自异种菌株的pgdh和psat组合，也显示活性。[表5][表6]3pgdhpsat1stst2tttt3tmtm4tktk5tete6tttk7tkttst：东工大硫化叶菌(sulfolobustokodaii)tt：嗜热栖热菌(thermusthermophilus)tm：海栖热袍菌(thermotogamaritima)tk：thermococcuskodakarensiste：嗜热蓝细菌聚球藻(thermosynechococcuselongates)(l-半胱氨酸制造的研究)[材料和方法]·使用酶基因、菌株、培养表7中示出本研究中使用的酶基因的列表。对于源自嗜热栖热菌(thermusthermophilus)hb8的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(ttfba)、源自顽固热变形菌(thermoproteustenax)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ttegapn)、谷氨酸脱氢酶(ttegdh)和源自thermococcuskodakarensiskod1的3-磷酸甘油酸脱氢酶(tkpgdh)、磷酸丝氨酸氨基转移酶(tkpsat)，将由各微生物的基因组dna进行pcr扩增而得的该基因连结于pet21a，对于源自敏捷气热菌(aeropyrumpernix)的o-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(amcyss)和源自thermococcusprofundus的nadh氧化酶(tpnox)，将合成dna连结于pet21a，在t7启动子控制下进行表达。这些基因表达载体全部导入于novagen社制rosetta2(de3)plyss。对于源自嗜热栖热菌(t.thermophilus)hb8的葡萄糖激酶(ttgk)、葡萄糖磷酸异构酶(ttgpi)、磷酸果糖激酶(ttpfk)、三糖磷酸异构酶(tttim)和源自嗜热栖热菌(t.thermophilus)hb27的多聚磷酸激酶(ttppk)，将合成dna连结于prci且处于lamnbdapr启动子控制下，导入于e.colidh5α株。e.colidh5α的情况下，将100mg/l的氨苄青霉素添加于luria-bertani培养基，rosetta2(de3)plyss的情况下，将100mg的氨苄青霉素和34mg/l的氯霉素添加于luria-bertani培养基，在37℃下好氧培养。在对数增殖后期，通过在培养液中添加0.2mmiptg或热诱导(42℃)而进行目标酶基因的诱导。[表7]·酶液的制备将重组大肠杆菌的湿菌体以成为200mgwetcells/ml的方式悬浮于50mmhepes-naoh(ph8.0)。通过将悬浮液供于超声波破碎处理而将菌体破碎，得到无细胞提取液。对于无细胞提取液，实施70℃、30分钟的热处理，进行源自宿主蛋白质的变性操作。将通过离心分离而除去了细胞残留和变性蛋白质的上清液作为粗酶液，用于活性测定。·酶活性在活性测定中使用100mmhepes-naoh(ph8.0)，反应全部在70℃下实施。就ttgk而言，通过监视340nm的吸光，测定通过与至下游的ttegapn为止的通路偶联而产生的nadh的浓度。ttgpi、ttpfk、ttfba、tttim、ttegapn也用同样的方法进行测定。就tkpgdh而言，通过监视340nm的吸光，测定通过与tkpsat偶联而产生的nadh的浓度。就apcyss而言，通过加入与反应液等量的20％三氯氯醋酸而将蛋白质进行变性、使反应停止后，通过进行※4的茚三酮试验而测定l-半胱氨酸的浓度。就ttppk而言，通过gk和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)(株式会社耐热性酵素研究所社制)的偶联而实施反应。就tpnox而言，通过监视340nm的吸光，测定通过反应而减少的nadh的浓度。就ttegdh而言，通过监视340nm的吸光，测定通过反应而蓄积的nadh的浓度。由这些测定结果，添加需要量的粗酶液，测定以葡萄糖为底物的l-半胱氨酸的生产量。予以说明，l-半胱氨酸的定量通过茚三酮试验实施。※4：gaitondemk(1967)aspectrophotometricmethodforthedirectdeterminationofcysteineinthepresenceofothernaturallyoccurringaminoacids.biochemj.104(2):627-633·l-半胱氨酸的生产试验基于酶活性测定的结果，添加需要量的粗酶液，测定由葡萄糖起始的l-半胱氨酸的生产率。就反应组成而言，在由100mmhepes、5mmmgcl2、0.5mmmncl2、10mmnad+、1mmatp、1mmg1p、2.5mm葡萄糖、5mm谷氨酸、5mm硫化钠、32mm醋酸铵、1mm多聚磷酸(平均链长60)构成的反应液中实施。通过茚三酮试验对l-半胱氨酸进行定量。·l-半胱氨酸的生产试验结果实施例中的使用酶为ttgk、ttgpi、ttpfk、ttfba、tttim、ttegapn、tkpgdh、tkpsat、apcyss。反应组成设为表8的条件1的组成，在70℃下实施。向除葡萄糖以外的反应液中加入前述全部的酶，再向其中加入葡萄糖而开始反应。反应开始15分钟后，进行l-半胱氨酸的定量。其结果，可以确认17.3mg/l的l-半胱氨酸。·辅酶再生系统的添加效果在l-半胱氨酸的合成通路中使用作为辅酶的nad+。以供给gdh或nox而还原nadh、从而使l-半胱氨酸的生产速度提高为目的进行研究。以表8的反应组成在70℃下实施。反应开始15分钟后，进行半胱氨酸的定量。其结果如图6所示，可知在反应液中加入ttegdh或tpnox的一方，生产量高，进一步加入两者则生产量进一步升高。[表8]·经时变化取得l-半胱氨酸的生产试验的经时变化。这次的试验的使用酶为ttgk、ttgpi、ttpfk、ttfba、tttim、ttegapn、tkpgdh、tkpsat、apcyss、ttppk、tpnox、ttegdh。在除葡萄糖以外的反应液中加入全部的酶，向其中加入葡萄糖而开始反应。反应开始5、10、15、20分钟后，进行取样，进行l-半胱氨酸的定量。将反应组成示于表9，在70℃下实施反应。将其结果在图7中示出。由此可知：加入ttegdh或tpnox则生产速度提高。另一方面，在表9的3、4、5中，在反应开始15分钟以后达到稳态。另外，在表9的2中，生产量也增长，但速度变得缓慢。其另一方面，在表9的1中，生产一直持续进行，即使与2相比，生产速度也不那么降低。因此暗示：为了进行长时间反应，利用ttppk将adp再生为atp是重要的。[表9]综上所述，在本发明中，通过耐热性酶的组合，可以使用例如葡萄糖、甘油或淀粉等可通过醣酵解系统代谢的原料制造l-半胱氨酸。特别是有效地制造由3pg经由hpv而合成o-磷酸丝氨酸的通路，进一步，通过组合再合成作为辅酶的烟酰胺辅酶的工序，可以长时间制造l-半胱氨酸。当前第1页12